牛支原体疫苗 |
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| 申请号 | CN200880112290.1 | 申请日 | 2008-10-29 | 公开(公告)号 | CN101827605B | 公开(公告)日 | 2016-05-04 |
| 申请人 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司; | 发明人 | 迈克尔·贝克; 杰弗里·尼特尔; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 牛 支原体的新的减毒株。本发明还提供包含任一种所述牛支原体减毒株的活菌的免疫原性组合物，其制备方法，及其在 治疗 和 预防 牛支原体感染方面的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.经减毒的无毒性牛支原体菌株，其中所述经减毒的无毒性牛支原体菌株选自：以ATCC保藏号PTA-8694、PTA 8695、或PTA 8696保藏的减毒牛支原体菌株，其经皮下或鼻内途径给小牛施用一剂2.1E9 CFU后的14天内，能在小牛中引起体液免疫应答，且不引起通常由致病性牛支原体野生型菌株感染引起的临床症状的任何减毒后代牛支原体菌株。 |
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| 说明书全文 | 牛支原体疫苗[0001] 相关申请 [0004] 本申请包含纸件形式和计算机可读形式的序列表，其教导和内容引入本文做参考。 [0005] 背景 [0006] 牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)被认为是支原体属中较有致病性的物种之一，它在全世界范围内导致显著的经济损失。支原体在所有年龄段的牛(cattle)中引起严重的临床症状。牛支原体是被发现引起牛的肺炎(pneumonia)、乳腺炎(mastiffs)、以及关节炎(arthritis)的最常见支原体病原，其病因学角色还与母牛(cows)和公牛(bulls)的耳炎(otitis)、角膜结膜炎(keratoconjuctivitis)、滑膜炎(synovitis)、以及生殖疾病(reproductive disorder)相关。一般而言，支原体很难治，因为它们缺乏细胞壁或膜，使得它们耐受多类常用的广谱抗生素治疗。支原体区别于病毒之处在于，支原体比大多数病毒大，其通过附着细胞表面并破坏该表面而不是进入细胞内部来损伤组织。被牛支原体感染的动物免疫应答水平降低，可出现诸如发烧、抑郁症(depression)、厌食(anorexia)、呼吸吃力(labored breathing)、流鼻涕流眼泪(nasal and ocular discharge)、咳嗽、打喷嚏(sneezing)、喘(gasping)、打呼噜(grunting)、跛(lameness)和关节肿胀(swollen joints)、乳腺炎、中耳感染、流产(abortion)、慵懒(recumbence)和死亡等等牛支原体感染症状。这种生物在不洁的温暖潮湿环境中能存活很长时间。支原体能在奶中存活，在因响应于感染而出现大量白细胞的情况下甚至可能茁壮成长。 [0007] 本领域有多篇文献披露牛支原体疫苗。专利6,548,069披露了一种疫苗组合物，其掺入了含有至少两种杀灭的牛支原体菌株的全细胞灭活菌苗(inactivated bacterin)。能找到的其它文献披露了将牛支原体菌株传代不到10次以制备灭活疫苗，但它们未描述将传染性或病原性牛支原体菌株通过连续传代而减毒、或者将任何这类减毒活牛支原体菌株作为无毒力活培养疫苗的基本成分。 [0008] 现有技术未发现，杀灭的牛支原体在减轻与牛支原体感染有关的临床症状严重程度方面并不是有效的。即使是低水平传代也不能产生能导致临床症状大大减轻的高效的疫苗。现有的极少数较少传代的(low passage)灭活牛支原体疫苗未显示出使临床症状严重程度大幅降低。此外，与将多次传代的(high passage)牛支原体减毒菌株用作免疫原性组合物或疫苗组合物的想法相比，上述‘069专利的教导是完全背道而驰的，它指出： [0009] “因支原体分离物在培养中可能快速改变其抗原，传了50代以上的多次传代的菌株当用在本发明的菌苗中时可能失去感染力，并激发较弱的免疫应答。因此，优选应用新鲜分离的菌株或者经过培养但仍有毒力的菌株；即，保留了感染宿主动物的能力的菌株。虽然不清楚关键的传代次数是多少，但本发明优选用那些在大规模生产前传代不超过大约10次、优选仅传代大约5次以下的支原体菌株来开始。我们相信，通过采用在培养中传代较少次数的菌株，能保留抗原的天然状态，因此能激发出抵抗感染性微生物的保护性免疫应答。” [0010] 相应地，本领域需要有效激发抗牛支原体的免疫应答的免疫原性组合物。还需要有效减轻牛支原体感染症状的严重程度或减少牛支原体感染症状的发生率的免疫原性组合物。还需要有效减少或消除牛支原体感染症状的发生率的疫苗。还需要能安全给予有需要的动物、有效减轻牛支原体感染症状的严重程度或减少牛支原体感染症状的发生率的免疫学组合物。还需要诱导交叉保护的上述免疫学组合物，而且所述组合物激发针对与所述组合物中所用菌株或分离物不同的牛支原体菌株和分离物的免疫应答。还需要适于单剂或两剂或多剂(先初次剂量再加强剂量)免疫接种方案的安全有效的免疫学组合物，适于且便于经多种途径给药的免疫学组合物，以及能与其它免疫原和免疫学组合物相容以制备联合疫苗的免疫学组合物。最后，还需要对有需要的动物快速启动保护并提供长期保护的上述免疫学组合物。 发明内容[0011] 本发明的免疫原性组合物或疫苗通过提供无毒力的和减毒的牛支原体菌株，优选多次传代的，能与可药用或可兽用载体组合的菌株，以便能用做效力改进的免疫原性组合物，使牛支原体感染的症状和/或牛支原体感染本身和/或发生率或严重程度，与野生型牛支原体菌株的感染相比，优选还与现有疫苗相比而减轻。换而言之，给予了本发明疫苗的小牛(calves)发生牛支原体感染的风险较低，而且感染所致任何临床症状都比未接受任何疫苗但感染了牛支原体、或接受了并非本发明的疫苗的动物中的症状更不严重或更不明显。此外，当兽群中的动物被给予了本发明的疫苗后，与未接种疫苗但感染的动物相比，优选与接种现有常规疫苗的动物相比，被感染的动物个数更少。有利的是，本发明的疫苗是稳定、高效疫苗，既能快速启动保护作用，又能使保护作用维持较长时间。根据现有技术的教导，本发明的组合物提供的意外结果是，牛支原体菌株，优选多次传代的牛支原体菌株，作为免疫原性组合物的成分，是减毒的，有活力的，而且更高效的。 [0012] 本文公开的发明提供无毒力的，以及减毒的牛支原体菌株或分离物，优选多次传代、给予动物后能激发免疫应答的牛支原体减毒菌株。有利的是，所述免疫应答给施用了本发明组合物的动物提供保护，使这些动物个体与未接受所述组合物或接受了并非按照本发明制备的疫苗或组合物的动物相比，出现牛支原体感染症状的风险更小，其症状更不严重或更不明显。 [0014] 在一个实施方案中，公开了包含多次传代的牛支原体菌株和可药用载体的免疫原性组合物。优选，所述牛支原体菌株是减毒的和无毒力的。本发明的免疫原性组合物在牛(cattle)中产生抗牛支原体感染的免疫应答。因给予所述免疫原性组合物而生成或诱导的抗牛支原体感染的免疫应答大大减轻了牛支原体感染症状的严重程度或减少了其发生率。在另一实施方案中，公开了制备免疫原性组合物的方法，所述组合物包括多次传代的牛支原体菌株，优选多次传代的、减毒、无毒力牛支原体菌株。在另一实施方案中，公开了用所述免疫原性组合物在小牛中刺激快速、长效血清学体液免疫应答、并因此针对疾病提供保护作用的方法。在另一实施方案中，公开了通过给予有效量的本发明免疫原性组合物使小牛对牛支原体感染产生免疫力的方法。本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物给予小牛后，用野生型牛支原体菌株攻击，表现出牛支原体感染症状减少，包括通常与牛支原体感染有关的临床症状、肺病理学、跛、关节病理学减少。特别是，在疫苗接种组观察到肺病理学减轻，关节临床症状和与之相关的跛大大减轻。在本发明另一实施方案中，公开了减少牛支原体感染的症状的方法，优选通过施用本发明所述和/或本申请所公开的任一种减毒的、无毒力的牛支原体细菌来实现。牛支原体感染症状的减轻通过给予本发明的免疫原性组合物来实现。 [0015] 在本发明一优选实施方案中，给小牛施用三种活疫苗或免疫原性组合物之一，其中每一种均含有多次传代的减毒牛支原体菌株和可药用载体。所述牛支原体多次传代的菌株优选传代10次以上，优选至少20次，更优选至少30次，还更优选至少40次，更优选至少50次，还更优选至少55次，更优选至少60次，还更优选至少70次，更优选至少80次，还更优选至少90次，更优选至少95次，还更优选至少100次，更优选至少102次，最优选至少106次，优选在体外的细胞培养中传代。所述疫苗或免疫原性组合物中用到的牛支原体菌株可以是任何菌株或分离物。三种代表性菌株包括052823A106，2007年10月16日按布达佩斯条约保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏号PTA-8694；05249A102，2007年10月16日按布达佩斯条约保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏号PTA 8696；0519021B106，2007年10月16日按布达佩斯条约保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏号PTA8695。这三种菌株在传代前都是致病性的，但如上述传代后，特别是传代100次以上之后，所得菌株变为减毒、无毒力的，并且在接受所述菌株的免疫原性组合物的动物中产生免疫应答。随后用得自天然爆发的疾病的牛支原体分离物攻击小牛。在本文所述的所有情况中，所述攻击分离物具有与用于接种疫苗的分离物不同的“指纹”(下文将确认)(即异源攻击)。有利的是，给予经传代的菌株导致的免疫应答使得用致病性菌株或野生型牛支原体菌株攻击后，牛支原体感染的临床症状严重程度减轻和/或发生率下降。 [0016] 因此，本发明另一方面涉及ATCC保藏号为PTA-8694、PTA 8695、或PTA 8696的任一种减毒牛支原体菌株，优选也涉及上述任一种保藏的牛支原体菌株的任何下述减毒后代牛支原体菌株，它们可用在免疫原性组合物中，具有改进的效力，使得牛支原体感染症状和/或牛支原体感染本身和/或发生率或严重程度，与野生型牛支原体菌株感染相比，优选也与现有疫苗相比而减轻，并具有快速启动保护作用和提供长期保护作用的高效力。 [0017] 本发明另一方面还提供本文所述免疫原性组合物，其包含以ATCC保藏号PTA-8694、PTA 8695、或PTA 8696保藏的任一种减毒牛支原体菌株，或上述任一种保藏的牛支原体菌株任何减毒的后代牛支原体菌株。优选包含以ATCC保藏号PTA-8694、PTA 8695、或PTA 8696保藏的任一种减毒牛支原体菌株的免疫原性组合物。可以采用上述任一种具体的牛支原体菌株。而且，本发明还涉及本文所述任一种特异性减毒牛支原体菌株的兽用用途，例如用于减少牛支原体的致病性菌株或野生型菌株攻击后牛支原体感染临床症状的严重程度和/或发生率。 [0018] 本发明另一方面还涉及与以ATCC保藏号PTA-8694、PTA 8695、或PTA8696保藏的牛支原体菌株具有相同特性的减毒牛支原体。术语“与以ATCC保藏号PTA-8694、PTA 8695、或PTA 8696保藏的牛支原体菌株具有相同特性”是指，所述菌株是减毒的，经皮下或鼻内途径给小牛施用一剂2.1E9 CFU后的14天内，能在小牛中引起体液免疫应答，且不引起通常由致病性牛支原体野生型菌株感染引起的临床症状。作为一种参考方法，体液免疫应答采用BIOVET牛支原体ELISA-试剂盒按说明书进行测定。优选，这些菌株每一种都在经皮下或鼻内途径给小牛施用一剂2E9 CFU后的14天内诱导出体液免疫应答，该应答的相对ELISA评分在BIOVET牛支原体ELISA试剂盒中用该试剂盒提供的方法测定、并以光密度(O.D.)读数表示时，为至少1.5。 [0019] 本发明的组合物可以用任何常规方式施用。施用方式的例子包括任何能使免疫系统的细胞接触免疫原性组合物的方式：口服，经皮/皮内，静脉，皮下，肌肉，眼内(intraocular)，腹腔(intraperitoneal)，直肠(intrarectal)，阴道(intravaginal)，鼻内，胃内，气管内(intratracheal)，肺内(intrapulmonarial)，或它们的任何组合。施用方式优选肌肉，皮下和鼻内，特别优选皮下和鼻内。需要时或必要时，可以间隔不同时间给予一或多次加强免疫。施用这样的疫苗后，在所述动物体内激起免疫应答，当用有毒力的牛支原体攻击后，能减少暴露于野生型菌或分离物时牛支原体感染症状的发生率和/或严重程度。此外，本发明的疫苗或免疫原性组合物对于为减毒目的进行传代、并随后被用作抗原成分的菌株以外的牛支原体菌株表现出有效的交叉保护作用。 [0020] 在优选实施方式中，所述疫苗的剂量体积不超过5ml，更优选不超过3ml，更优选不超过2ml。在最优选实施方案中，所述剂量为2ml，优选鼻内施用，每个鼻孔1ml，还更优选皮下施用，最优选在同一次作为单个剂量对鼻内和皮下都施用。在一些优选形式中，在第一次施用后，第二次或随后施用所述免疫原性组合物。所述随后施用优选发生在首次施用的至少10天后，更优选至少10-32天之间，更优选至少12-30天之间，更优选至少14天，最优选至少14-28天之间。在最优选形式中，所述疫苗既可以是在第0天作为单个剂量施用，或者，在备选形式中，在第0天施用，并在14-28天后未暴露于病原性牛支原体的期间施用，直至免疫接种方案完成后。在最优选形式中，无需加强免疫，所述疫苗仅施用一次。接种这种疫苗的动物从1日龄到成年都可，优选从1日龄到2岁的幼年小牛，更优选从1日龄到16周龄的小牛，最优选从6周龄到12周龄的小牛。这样的施用如下述减少牛支原体感染症状。事实上，本文所述研究表明，如上述免疫的接种组与未接种组相比，牛支原体感染症状减少至少50％，更优选至少60％，还更优选至少70％，还更优选至少75％。验尸后，进行肺部病理学评估，特别是，按照针对不同物种的评分惯例，对因牛支原体引起损伤所导致的肺实变(lung consolidation)评出百分比，发现与未接种组相比，减少至少33％，更优选至少50％，还更优选至少70％，还更优选至少80％，还更优选至少90％，最优选至少95％。 [0021] 在另一优选实施方案中，本发明疫苗与合适的佐剂(adjuvant)组合。“佐剂”在本文中可包括，氢氧化铝和磷酸铝，皂苷(saponins)如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂。所述乳剂尤其可以基于轻质液体石蜡油(light liquid paraffin oil)(欧洲药典(European Pharmacopea)类型)；类异戊二烯(isoprenoid)油如角鲨烷(squalane)或角鲨烯(squalene)；烯烃(alkenes)尤其异丁烯(isobutene)或癸烯(decene)寡聚化产生的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更尤其是植物油，乙基油酸酯，丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖酯，二缩甘露醇酯(如无水甘露醇油酸酯(anhydromannitol oleate))，乙二醇酯，聚甘油酯，丙二醇酯以及油酸酯，异硬脂酸酯，蓖麻油酸(ricinoleic)酯或羟基硬脂酸酯(它们都可选乙氧基化)，和聚氧亚丙基(polyoxypropylene)-聚氧亚乙基(polyoxyethylene)嵌段共聚物(copolymer block)，尤其Pluronic产品，特别是L121。见Hunter等，TheTheory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.).JohnWiley and Sons，NY，pp51-94(1995)和Todd 等，Vaccine 15：564-570(1997)。 [0022] 例如，有可能使用SPT乳液和MF59乳液，前者见″Vaccine Design，TheSubunit and Adjuvant Approach″第147页，M.Powell和M.Newman编，Plenum Press，1995，后者见该书第183页。 [0023] 佐剂的另一个例子是从丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酐(maleic anhydride)和链烯基衍生物的共聚物中选出的化合物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚(polyalkenyl ether)或聚醇交联的聚合物。这些化合物被称为卡波姆(carbomer)(Phameuropa Vol.8，No.2，June 1996)。本领域技术人员也可以参见美国专利2,909,462，其描述了与聚羟基化合物交联的这种丙烯酸聚合物，所述聚羟基化合物带有至少3个羟基，优选不超过8个，所述至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团(radical)替换。优选的基团是含有2-4个碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其它亚乙基化不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。这种不饱和的基团自身可包含其它取代基，如甲基。以卡巴普(Carbopol)；(BF Goodrich，Ohio，USA)的名称出售的产品尤其合适。它们与烯丙基蔗糖交联或与烯丙基季戊四醇交联。其中可提及卡巴普974P，934P和971P。最优选使用卡巴普971P。在马来酐与链烯基衍生物的共聚物中，优选马来酐与乙烯(ethylene)的共聚物EMA(Monsanto)。这些聚合物溶于水形成酸性溶液，可以对其进行中和，优选中和至生理pH，从而提供可以掺入免疫原性、免疫性或疫苗性组合物的佐剂溶液。 [0024] 其它合适的佐剂包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、Blockco-polymer(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、阿夫立定(Avridine)脂-胺佐剂、大肠埃希氏菌不耐热肠毒素(重组型或其它形式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽(muramyl dipeptide)，或者天然或重组的细胞因子或其类似物，或内源细胞因子释放的刺激物，等等。 [0025] 优选，佐剂添加量为约100μg-约1g/剂。还更优选佐剂添加量为约100μg-约500mg/剂。还更优选佐剂添加量为约500μg-约250mg/剂。还更优选佐剂添加量为约750μg-约100mg/剂。还更优选佐剂添加量为约1mg-约50mg/剂。还更优选佐剂添加量为约1mg-约 10mg/剂。最优选佐剂添加量为约1mg/剂。 [0026] 此外，本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物可包括一或多种可兽用载剂。本文中，“可兽用载剂”包括任何和所有的溶剂，分散介质，包衣(coating)，佐剂，稳定剂，稀释剂，保存剂，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂，吸收延迟剂，等等。在一些优选实施方案中，尤其在那些包括冻干免疫原性组合物的方案中，本发明所用的稳定剂包括用于冻干(lyophilization或freeze drying)的稳定剂。 [0028] “免疫原性组合物或免疫学组合物”是指包含至少一种抗原的组合物，其在已有抗目标组合物或疫苗的细胞性和/或抗体介导性免疫应答的宿主体内激发免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一或多种以下效应：产生或活化特异性针对所述目标组合物或疫苗中所含一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒T细胞和/或gamma-delta T细胞。优选，宿主表现出治疗性免疫应答或保护性免疫应答，结果增强对新感染的抵抗力和/或减少疾病的临床严重程度。如果通常出现在受感染宿主中的临床症状减少或未出现，或者，受感染宿主的恢复时间加快和/或感染持续时间缩短或者组织或体液或排出液中的菌滴度降低，都可以确认有这类保护作用。 [0029] “牛支原体感染症状”是指因牛支原体引起的感染或疾病的表现，包括受野生型牛支原体感染的牛所通常经历的临床症状和病理表现。感染或疾病的这些症状可以有多种形式，包括但不限于，发烧、抑郁症、厌食、呼吸吃力、流鼻涕和流眼泪、咳嗽、打喷嚏、喘、打呼噜、跛和关节肿胀、中耳感染、内耳炎症有排出物、流产和其它生殖疾病、慵懒、呼吸道感染、歪头(head tilt)、共济失调(ataxia)、关节炎、乳腺炎、耳炎、角膜结膜炎、滑膜炎、胸膜炎(pleuritis)、肺损伤、肺实变和肺内形成节结、滑液增加、关节囊增厚、以及甚至死亡。 [0030] “多次传代的菌株”在本文中是指，已在体外细胞培养中传代10次以上，优选至少20次，更优选至少30次，还更优选至少40次，更优选至少50次，还更优选至少55次，更优选至少60次，还更优选至少70次，更优选至少80次，还更优选至少90次，更优选至少95次，还更优选至少100次，更优选至少102次，最优选至少106次的牛支原体菌株。 [0031] “肺部病理学评估(Lung Pathology Assessment)”是指，验尸后对肺的观察，包括但不限于，评估实变(consolidation)，损伤，和节结形成，以及评估胸腔(thoracic cavity)包括胸膜炎和积液(fluid accumulation)。 [0032] “减毒”是指减小病原体的毒力。在本发明中，“减毒”与“无毒力的”是同义词。在本发明中，减毒菌是毒力已减弱因而不引起牛支原体感染的临床症状但能在目标动物中诱导免疫应答的微生物，也可指受减毒牛支原体感染的动物与受非减毒牛支原体感染且未接受所述减毒病毒的“对照组”动物相比，临床症状的发生率或严重程度减小。在该语境中，术语“减少/减小”是指如上述与对照组相比，减少至少10％，优选25％，还更优选50％，最优选100％以上。因此，经减毒的无毒力牛支原体菌株适于掺入包含经修饰的活牛支原体菌的免疫原性组合物。 [0033] 为本发明目的的“有效量”是指免疫原性组合物能诱导出免疫应答的量，所述免疫应答是减少动物体内牛支原体感染的发生率或减轻其严重程度的免疫应答。特别地，有效量是指，每剂10E3至10E10、优选至10E6至10E10菌落形成单位(CFU)。 [0034] “改进的效力，使得与现有疫苗相比，当疫苗接种者暴露于牛支原体或被野生型牛支原体菌株感染时，与牛支原体感染相关的临床症状和/或牛支原体感染本身减轻”是指，将本发明的经过多次传代的菌株制得的疫苗与本发明之前的牛支原体疫苗相比，牛支原体感染的临床症状的发生率或严重程度减小。在该语境中，未接种的动物，或者用本发明之前的牛支原体疫苗接种的动物，其牛支原体感染的临床症状比接种本发明所述牛支原体免疫原性组合物的动物更严重或多流行(prevalent)至少30％，可能最多更优选至少40％，更优选至少50％，还更优选至少60％，更优选至少70％，还更优选至少75％，更优选至少80％，还更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％。 [0035] “长期保护作用(Long-lasting protection)”应该是指，“改进的效力”在肉牛(beef animals)中持续至少3周，更优选至少6个月，更优选至少1年，还更优选至少2年，在奶牛(dairy animals)中持续至少6个月，更优选至少1年，更优选至少2年，更优选至少3年，还更优选至少4年。更优选，对肉牛的长期保护作用应持续直至肉牛上市售肉的平均年龄，对奶牛的长期保护作用应持续直至奶牛不再产奶的年龄。 [0036] 术语“需要所述给药”或“需要所述给药治疗”在本文中是指，给药/治疗与增强或改善接受本发明免疫原性组合物的动物的健康或任何其它有利健康的医疗效果有关。 [0037] “DNA指纹分析”在本文中是指，按WO2008-030619所述，通过扩增插入序列之间的DNA和测量扩增产生的模式(pattern)来快速鉴定细菌菌株。简言之，用PCR和一组针对细菌插入序列(可转座元件)设计的外向性引物，产生细菌性物种分离物特有的模式。这些模式然后可与诸如流行病学或发展史(phylogeny)等信息进行比较。DNA指纹分析的一种优选方法利用PCR和一组针对单个或多个细菌插入序列设计的外向性引物。这样的方法从邻接IS产生扩增产物。PCR扩增完成后，将产物分离(琼脂凝胶)，按照细菌性物种分离物特有的扩增产物的分子量，得到电泳带模式。优选的方法是用外向性引物进行多重PCR。多重PCR是PCR的一个变化形式，它通过使用多套引物，能在一个反应中同时扩增多个目标。当然，本领域已知的其它基于分子的指纹分析方法也是可以用的。 [0038] “插入序列(IS)”是起可转座元件的作用的短DNA序列。IS一般约700-2500bp长，比其它类型的可转座元件相对要小。它们编码与转座活性有关的蛋白，所述蛋白催化酶促反应，使IS移动。IS元件是特定物种特有的，或者可以在分类学组别中共有。这些插入序列常常有多个拷贝，但它们都位于特异性可转座元件的特有位置。 [0039] 因此，本发明另一方面涉及如上述通过多次传代或连续减毒而被减毒的牛支原体菌株作为药物，优选作为兽药的用途。 [0040] 根据本发明另一方面，如上述减毒的牛支原体菌株可用于制备药物组合物，所述组合物如本文所述可用于预防或治疗牛支原体引起的感染。如上所述，这些药物组合物/疫苗组合物可用于治疗和/或预防对牛支原体感染易感的动物。 [0041] 在本发明另一方面，是治疗或预防方法，包括减轻牛群中野生型感染的发生率，或在给予了本发明免疫原性组合物的动物中减少与野生型牛支原体感染有关的牛支原体感染症状的严重程度，是与未接种的动物或与接种本发明之前的疫苗的动物相比。进一步地，给予本发明疫苗使牛群中被牛支原体感染的动物的数量减少。这样的方法一般性涉及，对需要这种治疗的单个或一群受试者，给予治疗有效量的、经上述方法减毒的牛支原体菌株。优选，与未接种的动物或与接种了本发明之前的牛支原体免疫原性组合物、但随后被野生型牛支原体感染的动物相比，临床症状在发生率或严重程度方面减少至少10％，更优选减少至少20％，更优选减少至少30％，还更优选减少至少40％，更优选减少至少50％，还更优选减少至少60％，更优选减少至少70％，还更优选减少至少80％，更优选减少至少90％，最优选减少至少95％。 附图说明 [0042] 图1：从鼻、扁桃体和肺样品回收培养物的频率(第0，14，28，35天及以后)[0043] 图2：鼻、扁桃体和肺样品的PCR检测频率(第0，14，28，35天及以后)[0044] 图3：来自血清样品的牛支原体特异性抗体的平均组评分(第0，14，28，35和42天)[0045] 图4：活疫苗I，II，III组和无疫苗组(仅有SQ+IN)血清学的比较 [0046] 图5：活疫苗I组用不同施用途径的血清学比较 [0047] 优选实施方案详述 [0048] 以下实施例代表了本发明的优选实施方案。但应理解，本文任何内容都不应被当作对本发明总体范围的限制。 [0049] 实施例1 [0050] 该实施例评估了目标物种中用两种不同攻击模式评估的实验性活牛支原体疫苗的效力。 [0051] 材料和方法 [0052] 使用35只禁食初乳(colostrum deprived，CD)的4-8周龄Holstein小牛。所有动物符合入选标准，即它们经测试为牛支原体阴性，攻击时健康状况良好。首先将这些小牛随机分为4组。组1-3各有9只小牛，组4有8只小牛。组1和2的小牛接种活疫苗1(活Vac 1)，这是传代106次的牛支原体分离物052823(05-2823-1A-3A P106+)(ATCC PTA-8694)的粗培养物，组3和4的小牛接种单独的培养基。组1和2的疫苗分离物从天然爆发的疾病中分离，然后在牛支原体合适培养基中连续传代106次。所述培养物在用事先确定的适当量的接种培养物(seed culture)接种后在37℃培养24±2小时。分离物不经稀释便投入使用。接种前、后的平均浓度为2.1E9 CFU/ml。所述疫苗皮下接种剂量为2ml，鼻内接种剂量为2ml(每个鼻孔各1ml)。参与研究的所有小牛用有毒力的牛支原体攻击，以诱导天然感染和疾病，组1和3接受较高剂量攻击，组3和4接受较低剂量攻击。 [0053] 测试物质的剂量和给药方案见表1概述。 [0054] 表1 [0055] [0056] 鼻拭子和血样在第0、14、28、35、和42天时取得。尸检时取肺部样品，所有小牛都取扁桃体拭子(Tonsil swab)，有临床异常的动物取关节拭子(joint swab)。此外，有些表现出区域累及(area involvement)的动物还从其它部位取样。在所有病例中，三支无菌拭子围绕所述区域擦拭数秒后取出，尽可能无菌操作。其中两支拭子置于不同的装有介质的转运容器中，一支置于未装介质的转运容器中。表2概述了每只小牛所取的样品。 [0057] 表2 [0058] [0059] 测试 [0060] 为了进行微生物学测试，将拭子置于转运介质中，组织样品送去分离牛支原体。简言之，将拭子旋入5ml支原体选择性肉汤(broth)中。从肺组织切取一小份样品(约5mm)，在2ml支原体培养基中匀浆。将100μl匀浆物添加到所述支原体选择性肉汤中。将培养物在37℃/5％CO2中保温。4-14天后，检查肉汤的生长情况，在培养板上进行再培养(subculture)，以便进行分离。所有阳性再培养样品在-70℃贮存。 [0061] 为进行PCR，将每只小牛的未放入转运介质中的拭子，还有组织样品都送去提取DNA，用特异于牛支原体uvrC基因的引物和探针通过PCR进行测试。PCR测试结果表示为牛支原体DNA检测的阳性或阴性。 [0062] 为进行血清学测试，用商品化ELISA(Biovet，Canada)，按照其提供的方案，对血清样品进行测试。将ELISA结果表示为光密度(OD)读取值。用该测试试剂盒中所含的阳性对照确定阳性水平(平均ODpx0.3)，将样品的OD与该阳性水平比较。再将阳性结果用下表解释： [0063] 范围(interval) 解释 OD样品＜阳性水平 阴性(0) 阳性水平＜OD样品＜1.75*阳性水平 +1 1.75*阳性水平＜OD样品＜2.3*阳性水平 +2 2.3*阳性水平＜OD样品＜3*阳性水平 +3 OD样品＜3*阳性水平 +4 [0065] 为了进行临床测试，从第0天到第28天每天进行总体观察，然后从第28天到实施安乐死和尸检期间每天进行临床观察。将偏离正常的临床观察结果和总体观察结果记录在案。 [0067] 为了检查肺病理学，对每个肺叶进行目测和触诊，以便确定每个肺叶有多少(以百分比计)因牛支原体所致的病理学。然后将每个肺叶的百分比加权(weighted)并总和(summed)，以确定病理学肺的总百分比。 [0068] 关节病理学测试通过检查受累关节并记录目测结果来进行。 [0069] 为进行数据分析，先将数据汇总。临床症状和目测病理学(grosspathology)的减轻百分比用下式计算：％减少＝[1-(治疗/非治疗)]*100。 [0070] 此外，在第37天，因人为原因从第2和第3组各除去1个动物，从第4组除去2个动物。 [0071] 结果 [0072] 从第1天至第26天进行攻击前临床评估。在该研究阶段观察到稀便/水便，抑郁症，耳下垂(ear droop)，和昏睡(lethargy)。给予合适的兽医学护理。任何组在观察期内的任一天都未观察到不良的部位反应(adverse sitereaction)或支原体特异性临床症状。第27-43天进行攻击后临床评估。该研究阶段观察到的全部临床表现是：咳嗽、呼吸吃力(labored respiration)、抑郁症、厌食、关节肿胀、跛、以及耳下垂。攻击后阶段的临床评分的发生率见表3。组1的9只小牛中，2只出现感染的至少一种临床症状，2只有呼吸道症状，1只有关节感染迹象。组3的所有小牛都有至少一种临床症状，7只小牛有呼吸道症状，3只小牛在它们的关节中有感染迹象。组2的9只小牛中，4只有至少一种临床症状，无一只小牛仅有呼吸道症状，4只小牛有关节感染迹象。组4有7只小牛有至少一种临床症状，1只有呼吸道症状，7只有关节感染迹象。 [0073] 表3 [0074] [0075] 组1＝疫苗/高剂量呼吸道攻击 [0076] 组2＝疫苗/低剂量呼吸道攻击 [0077] 组3＝无疫苗/高剂量呼吸道攻击 [0078] 组4＝无疫苗/低剂量呼吸道攻击 [0079] 尸检时收集肺，观察与牛支原体感染有关的损伤。动物们表现出病理学特征诸如实变和节结形成的差异。肺受累(lung involvement)结果表示为百分数，所用的评分系统反映出具有与牛支原体感染相关的目测病理学的肺总体的百分比。在一些例子中，对肺百分比的确定因粘附或因损伤特性不典型而受到妨碍。表4显示了有任何肺损伤的个体所占比例以及肺受累的百分比范围/平均百分比。在肺部病理学评分时，组3的受累小牛最多(9/9)，组2的受累小牛最少(2/9)。 [0080] 表4肺部病理学评分汇总 [0081] [0082] 尸检时，对那些先前已有临床症状(肿胀或跛)的动物目测检查其关节的病理。不同动物的受累区不一样，可能累及腕(carpus)，跗(hock)，后腿膝关节(Stifle)，球节(fetlock)和/或肘(elbow)。动物们有明显可见的肿胀，滑液增加，液体表观特征异常，且关节囊增厚。在大多数严重受累的小牛中，发现血纤蛋白(fibrin)，而且关节面有侵蚀(erosion)。关节液和/或表面拭子的样品通过培养测试牛支原体的存在。关节中的目测病理学表现在表5中汇总。 [0083] 表5目测有无关节病变特征(0＝正常；1＝异常) [0084] 组 动物 关节 目测 滑液 滑液 血纤蛋白 关节 关节 测到牛 肿胀 体积 表观 存在 囊 表面 支原体 1 5982 右后腿膝关节 1 1 1 1 1 1 是 1 5887 左后腿膝关节 NR 1 0 0 0 0 否 1 5007 右后腿膝关节 NR 1 0 0 0 0 否 1 0007 右后球节 0 0 0 0 0 0 否 2 5987 右肘 0 0 0 0 0 0 是 2 5989 右跗 NR 1 NR 1 1 0 是 3 5995 右跗 1 1 1 1 1 0 是 3 5990 左后腿膝关节 0 1 1 0 0 0 是 4 5985 左后球节 1 1 1 0 1 0 是 4 5991 左后球节 1 0 1 0 1 0 否 4 0004 左后腿膝关节 1 1 NR 1 1 0 是 4 0000 左腕 1 1 0 0 0 0 是 4 0011 右肘 1 1 1 0 0 0 是 4 0011 右后腿膝关节 1 1 1 0 1 0 是 4 0013 左后腿膝关节 0 0 1 0 0 0 否 4 6015 右跗 0 1 1 1 0 0 是 [0085] 组1＝疫苗/高剂量呼吸道攻击；2＝疫苗/低剂量呼吸道攻击； [0086] 3＝无疫苗/高剂量呼吸道攻击；4＝无疫苗/低剂量攻击(NR＝未记录)[0087] 鼻传代(nasal passage)在第0、14、28和35天以及在尸检时(第43天)用拭子取样。此外，在死后检查(post-mortem)期间，用拭子取扁桃体样品，并回收代表性肺组织。图1和2显示了支原体选择性培养基的回收率或牛支原体特异性PCR的检测频率。如图1所示，所有组在尸检后取扁桃体样有100％的回收率。组1和组3的尸检后肺部有100％的回收率。组2的肺回收最少(约60％)，组4的回收率约90％。直至第35天取鼻样，无一组回收到牛支原体，唯一一个在第35天显示回收的组是组4(25％)。除组2以外，所有组在尸检后的鼻样品中都有回收。 [0088] 表6：PCR和血清学汇总 [0089] [0090] 培养 PCR ELISA [0091] 0＝无牛支原体生长 0＝牛支原体阴性 0＝阴性 [0092] 1＝牛支原体生长 1＝牛支原体阳性 1＝阳性达到1.75x[0093] M＝混合/或其它 2＝1.75x至2.3x[0094] 3＝2.3x至3.0x[0095] NS＝无样品 4＝3.0x或更高[0096] NT＝未测试 [0097] 所有样品都在Biovet牛支原体ELISA中检测，以便监控对牛支原体的血清学应答。根据阳性OD倍增分组(grouped multipliers of positivity ODs)，对血清转换进行评分。 下面的表格显示各组在第0、14、28、35和42天检测到的平均血清学评分。图3显示血清样品的牛支原体特异性抗体的平均组评分。指示有效体液免疫应答的血清转换在接种一剂之后不超过14天时检测到，且该免疫应答持续情况较好，表现为一次接种后至少42天、两剂接种后至少28天都能测出对牛支原体的血清学应答。从第28天开始，组1的评分一直高于所有其它组。组1和组2在第14天时持平(1.5个ELISA分).组4在第14-35天期间是最低的，到第42天时变为第三(约2.2)。 [0098] 结论 [0099] 该研究评估了牛支原体活疫苗，在小牛中给予两剂，经皮下和鼻内途径给予，在目标物种的攻击模型中的效力。该攻击模型包括高剂量呼吸道给药和低剂量呼吸道给药。该研究还采用间接评估方式，通过在单剂和两剂疫苗后的血清转换或体液免疫应答，评估了免疫力的效力、产生(onset)，以及免疫力持续时间。接种后免疫力的产生和持续时间也如此证实。 [0100] 进行攻击和用作疫苗的牛支原体分离物源自不同的天然感染动物。用于攻击的分离物之前已显示在实验性攻击期间引起肺和关节两方面的疾病，并且在混合分离物攻击研究中占优势。疫苗分离物是最初来源于确诊样品的多次传代的分离物(传106代)。而且，攻击物和疫苗分离物的基因型用本文所述指纹分析方法测得并不相同。 [0101] 在高剂量呼吸道攻击组(1和3)中，疫苗接种组的呼吸道临床症状减少(72％)且肺部病理学减少(33％)。未接种组在攻击后的第2-3天大都出现呼吸道临床症状。如表3所示，所述疫苗还减少因牛支原体引起的关节疾病的发生。 [0102] 在低剂量呼吸道攻击组(2和4)中，疫苗接种组的肺部病理学减少(96％)。而且，疫苗接种组的关节临床症状大大减少(50％)。 [0103] 肺样品的实验室测试(IHC，PCR和培养)和关节样品的实验室测试(PCR和培养)在大多数情况下与目测的病理学一致。不一致之处可能是由于取样部位或由于所测样品之间的细菌分布造成。在为检测疫苗候选物、不检测攻击分离物而设计的实验性PCR测定法中，所测试的任何肺样品都未测出疫苗分离物。 [0104] 这种新的多次传代的减毒活牛支原体疫苗候选物(05-2823 P106)经鼻内和皮下途径以2周的间隔施用2次，结果表明，它是安全且有效的，在禁食初乳的小牛中受到不同的攻击后，牛支原体感染的症状，包括与牛支原体感染相关的临床症状和病理学(呼吸道和关节)，都减少。所述牛支原体疫苗和免疫学组合物还能在单剂施用后不超过14天就有效刺激免疫力的产生，并且维持至少42天。 [0105] 实施例2 [0106] 该研究的目的是确定三种活疫苗候选物的安全性和效力。 [0107] 材料和方法 [0108] 该研究所用小牛为6±2周龄，分为6组。如表7所示，组1有10只小牛，它们在该研究的第0天(D0)和第14天(D14)接种了牛支原体活疫苗I。组1在D0和D14皮下接种2ml和鼻内接种2ml。组2有10只小牛，在该研究的D0和D14皮下接种2ml牛支原体活疫苗I。组3有9只小牛，在D0和D14接种牛支原体活疫苗I。组3用2ml进行鼻内接种。组4是对照，未接种任何疫苗。组5有2只小牛，接种了牛支原体活疫苗II。组5在D0和D14皮下接种2ml和鼻内接种2ml。组6有2只小牛，接种牛支原体活疫苗III。组6的小牛在D0和D14皮下接种2ml和鼻内接种2ml。所有组随后用120ml攻击物进行攻击。所有动物在D28被攻击。 [0109] 如表8所示，所有小牛在第0、14、27、35和41天收集鼻拭子。尸检时，从所有小牛收集扁桃体拭子。有临床异常的动物还收集关节拭子。此外，一些显示区域累及的动物还收集其它部位的样品。所有小牛在第0、14、27、35和41天采血。从每只小牛的颈静脉无菌采血。尸检后，给肺损伤评分。 [0110] 表7处理组 [0111] [0112] 表8样品列表 [0113] [0114] 结果和讨论 [0115] 攻击前的临床症状 [0116] 临床评估在第1-28天进行。在该研究阶段观察到稀便/水便，流眼泪，抑郁症和昏睡，它们无一归因于接种的影响。对注射部位进行观察，除了第6134号小牛(组6)在第14天发现第一个注射部位肿胀以外，未记录到不良的部位反应。 [0117] 攻击后的临床症状 [0118] 临床观察在第28-42天进行。在该研究阶段观察到咳嗽，呼吸吃力，抑郁症，关节肿胀，跛和耳下垂。将临床症状分为牛支原体感染的典型三大类(呼吸道，关节和其它)。呼吸道症状包括咳嗽，快速/吃力的呼吸和流鼻涕。关节症状包括关节肿胀和跛。其它症状包括，耳下垂，歪头，抑郁症和厌食。表9显示了个体的结果： [0119] 表9 [0120] [0121] 关键临床症状： 8 抑郁症 [0122] 9 厌食 [0123] 1 咳嗽 4 关节肿胀 6 耳下垂 [0124] 2 快速(吃力)呼吸 5 跛 7 头歪 [0125] 3 流鼻涕 A 腹泻 [0126] B 流眼泪 [0127] C 腿裂伤(laceration)[0128] 黑块＝退出研究的动物 [0129] 表10-攻击后阶段的临床评分发生率 [0130] [0131] 表10进一步分为牛支原体感染典型的呼吸道临床表现和经确认(培养和/或PCR)的牛支原体感染典型的关节临床表现。此外，表中还记载了因严重关节受累而在早期退出研究的动物比率。 [0132] 肺部病理学 [0133] 尸检时收集肺，观察与牛支原体有关的损伤。动物们表现出病理学特征诸如实变和节结形成的差异。肺受累结果表示为百分数，所用的评分系统反映出具有与牛支原体感染相关的目测病理学的肺总体的百分比。在一些例子中，对肺百分比的确定因粘附或因损伤特性不典型而受到妨碍。下面的表格显示了有任何肺损伤的个体所占比例以及肺受累的百分比范围/平均百分比。 [0134] 表11-肺部病理学评分汇总 [0135] [0136] 关节病理学 [0137] 尸检时，对那些先前已有临床症状(肿胀和/或跛)的动物目测检查其关节的病理。不同动物的受累区不一样，可能累及腕，跗，后腿膝关节，球节和/或肘。动物们有明显可见的肿胀，滑液增加，液体表观特征异常，或关节囊增厚。在大多数严重受累的小牛中，发现血纤蛋白，而且关节面有侵蚀。关节液和/或表面拭子的样品通过培养和PCR测试牛支原体的存在。用任一种减毒活疫苗进行接种成功减少了受累小牛的总数。 [0138] 表12-经实验室确认的临床关节炎发生率 [0139] [0140] 组1＝Vac I(SQ+IN)；2＝Vac I(SQ单独)；3＝Vac I(IN单独)；4＝无疫苗；5＝Vac II(SQ+IN)；6＝Vac III(SQ+IN) [0141] 注：当样品经PCR和/或培养为牛支原体阳性时，将该样品记为经实验室确认的样品。 [0142] 从鼻、扁桃体和肺样品经PCR检测牛支原体 [0143] 鼻传代在第0、14、27、35天和41或尸检当天对每一动物取样。此外，在验尸期间，用拭子取扁桃体样品，并回收代表性肺组织。以下各表显示了用靶向通用的牛支原体标记物(uvrC)的实时PCR检测到的频率。此外，扁桃体和肺组织用近期开发的、靶向未见于牛支原体攻击分离物但见于所有疫苗候选物的标志物的终点PCR测定法进行分析。象预计的一样，PCR在各种鼻拭子样品中检测到牛支原体疫苗和/或攻击微生物。 [0144] 表13-从鼻拭子样品经PCR检测到牛支原体的频率 [0145] [0146] 组1＝Vac I(SQ+IN)；2＝Vac I(SQ单独)；3＝Vac I(IN单独)；4＝无疫苗；5＝Vac II(SQ+IN)；6＝Vac III(SQ+IN) [0147] 注：用靶向通用的牛支原体标记物(uvrC)的实时PCR进行PCR检测。 [0148] 表14-扁桃体样品和肺组织样品的PCR检测频率(通用牛支原体和非攻击的测定法) [0149] [0150] 组1＝Vac I(SQ+IN)；2＝Vac I(SQ单独)；3＝Vac I(IN单独)；4＝无疫苗；5＝Vac II(SQ+IN)；6＝Vac III(SQ+IN) [0151] 注：通用＝用靶向通用的牛支原体标记物(uvrC)的实时PCR进行PCR检测；非-攻击＝用靶向未见于牛支原体攻击分离物但见于所有疫苗候选物的标志物的终点PCR进行PCR检测。 [0152] 同样，象预计的那样，PCR成功检测到鼻内接种后出现在扁桃体中的减毒活疫苗，而在肺和扁桃体的样品中都检测到高百分比的攻击微生物。 [0153] 牛支原体血清学 [0154] 所有样品都在Biovet牛支原体ELISA中检测，以便监控对牛支原体的血清学应答。根据阳性OD倍增分组，对血清转换进行评分。下面的表格显示各族在第0、14、27、35天和以后(以后代表第37-41研究日，因为有些动物早期退出)检测到的平均血清学评分。接种后观察到的血清转换更进一步证实了我们的结论：这些新疫苗确实在免疫接种的动物如小牛中很快激起了适当的免疫应答并维持了较长时间(见图4)。 [0155] 讨论 [0156] 本研究的目标是，评估三种新的实验性活牛支原体疫苗，包括疫苗(05-2823 P106)(PTA-8694)，用各种2mL给药途径(SQ、IN、SQ+IN)，间隔14天，在目标物种的双重攻击模型中的效力。攻击模型所用的经呼吸道的给药还附加胃肠道外给药。此外，另两种活疫苗候选物(05-249 P102(PTA-8696)和05-1902-1 P106(PTA-8695))仅用SQ+IN途径评估效力。 [0157] 作为攻击物和疫苗候选物的牛支原体分离物来自不同的受天然感染的农场。用总体积120mL的攻击分离物进行的程序之前已显示在实验性攻击期间引起肺和关节两方面的疾病，并且在混合分离物攻击研究中占优势。活疫苗候选物是最初来源于确诊样品的多次传代的分离物。疫苗候选物通过在合适的支原体培养基中连续的有限稀释进行多次传代。应注意，多次传代的疫苗候选物05 2823 P106已被证实在某些支原体选择性琼脂配制物上生长受限，但传代较少的亲本分离物未发现这种特性。而且，攻击物和疫苗分离物的基因型(用本文所述指纹分析方法)测得并不相同。 [0158] 本研究调查了多个参数，以便评估疫苗的益处。这些参数中，动物退出率和关节临床症状主要用于指示关节保护作用。肺部病理学(目测肺损伤百分比)主要用于指示肺部保护作用。其它数据如来自组织的生物的检测结果，关节分布，和血清学则提供了起到证实作用的额外信息，接种后针对牛支原体的血清转换也有此作用。 [0159] 所有组，不管采用何种给药途径或给药途径的组合，都在接受疫苗候选物牛支原体活疫苗I(05-2823 P106)后显示出使疾病减轻的肺部和关节保护益处，表现为，肺损伤、关节临床症状和动物退出率都减少。SQ和IN组合给药(组1)与仅采用单一给药途径的组相比，肺损伤减少得最多(86％)。此外，另两种疫苗候选物，活疫苗II(05-249 P102)和活疫苗III(05-1902-1P106)经SQ和IN途径组合给药后，肺损伤、关节临床症状和退出率都减少，也证实了所述益处。所有疫苗候选物的ELISA结果证实了针对接种的强体液应答，表明单一接种后的免疫力可以早在14天就产生，并维持至少41天(见图5)。 [0160] 所有疫苗候选物都被证实是安全的。任一个接种组都没有动物在免疫接种期间出现临床症状，仅有一例接种活疫苗III(05-1902-1 P106)的动物在注射部位出现反应，但该反应不明显。此外，PCR结果表明，仅在经IN途径接种疫苗候选物的组检测到来自扁桃体组织的非-攻击牛支原体，并且仅在经IN和SQ两种途径接种活疫苗I(05-2823 P106)的一个动物中检测到来自肺组织的非-攻击物。 [0161] 这些信息支持我们的结论：总体上，根据本发明制备的新的减毒活牛支原体疫苗经各种途径施用都是安全且有效的，能快速产生保护作用并将该作用维持较长时间，用于接种小牛的免疫学组合物阻止并减少了有毒力野生型牛支原体引起的各种疾病表现。 [0162] 实施例3 [0163] 本实施例描述了用于区分牛支原体菌株的DNA指纹分析方法，其采用WO 2008-030619所述的方法和引物来分离、扩增并检测DNA。 [0164] 材料和方法 [0165] 在这些研究中使用支原体分离物。分离物得自公司内部，或者田野分离物(field isolate)得自受感染的动物。分离物用支原体-选择性琼脂和肉汤(broth)组合培养1-7天。为分离DNA，将肉汤培养物旋转并沉淀成团。从沉淀团提取DNA(用Qiagen DNeasy Tissue Kit提取，并重悬在分子级水(molecular grade water)中)。基因组DNA用Picogreen(Invitrogen)定量。引物根据出现在细菌基因组(牛支原体)中、且公开在WO 2008-030619中的已知的插入序列(可转座元件)来设计。从该元件末端(除末端重复区以外)手工选择外向性引物，Tm为55-58℃。PCR反应用multiplex PCR master mix(QiagenMultiplex PCR Kit)进行。反应中包括1x Master mix，每种引物各300nM，1ng模板DNA。热循环条件是：95℃ 15分钟，再按照94℃30秒，56.1℃90秒，72C 2分钟运行35个循环，最后在72℃延伸4分钟，并在4℃维持。所扩增的产物在添加了溴化乙锭的4％琼脂糖凝胶(Invitrogen E-gel)上室温电泳50分钟，在UV光下成像。 [0166] 结果和讨论 [0167] 这些结果显示，本申请所用的每一种分离物都有独特的指纹。但正如实施例2所示，每种分离物也都是有效的减毒活培养疫苗，对于指纹不同于任一种疫苗候选物的攻击分离物能提供交叉保护。培养三种田野分离物：05-2823 P106(PTA-8694)、05-249 P102(PTA-8696)、05-1902-1-P106(PTA-8695)，按上述方案分离DNA。每种分离物取2-5ng DNA，按上述方案，用4组IS引物(WO 2008-030619中的SEQ ID Nos 1-8)进行扩增。扩增产物在含溴化乙锭的Invitrogen E-gel 4％琼脂糖凝胶上(按厂家建议)电泳50分钟，在UV光下观察。所有分离物都产生特有的模式。这些模式用不同的试样在相同的PCR反应条件下可再现。 |
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