【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、オレフィンマクロライド生産性微生物であって、エポキシダーゼ酵素活性を含まない該微生物を単離するまたは他の方法で入手する方法に関する。 本発明は、更に、本明細書中においてｒｏｓＸと称されるエポキシダーゼ活性を欠いた突然変異微生物であって、野生型微生物から得られる該突然変異体を発酵させることによる、前記オレフィンマクロライドの製造方法に関する。 本発明は、更に、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体、およびＡＴＣ
Ｃ５５７０９とも称される該突然変異体の識別特性を有する任意の微生物に関する。 【０００２】 【従来の技術】式（Ｉ） 【化１】 を有する化合物であるロサマイシン（ｒｏｓａｍｉｃｉ
ｎ）は、ミクロモノスポラ・ロサリア、ＡＴＣＣ５５７
０８を発酵させることによって製造される抗細菌性マクロライドである。
【０００３】現在、ロサマイシンの生合成におけるその中間前駆体は、式（ＩＩ）を有する化合物であるレプロマイシン（ｒｅｐｒｏｍｉｃｉｎ）であることが知られている。 レプロマイシン 【化２】 は、ロサマイシンとは構造的に一つだけ異なり、すなわち、レプロマイシンはＣ−１２／Ｃ−１３位に二重結合を有するが、ロサマイシンはエポキシドを有する。 野生型ミクロモノスポラ・ロサリアは、レプロマイシンのＣ
−１２、Ｃ−１３オレフィンをエポキシ化してロサマイシンのＣ−１２、Ｃ−１３エポキシドを生成するのに関与するエポキシダーゼ酵素を有するので、該微生物によって生産された発酵ブイヨンからレプロマイシンを有意の量で直接単離することはできない。
【０００４】レプロマイシンは、ロサマイシンの脱エポキシ化によって化学的に製造される。 その反応には、収率が極めて低い欠点がある。 レプロマイシンは、レプロマイシンと同様のまたは類似の環構造を有する各種抗生物質の合成において周知の重要な中間体であるので、高収率のレプロマイシン製造法が望まれる。 【０００５】本発明は、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体を発酵させることによって、特に、
ＡＴＣＣ５５７０９と称されるミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体から、そして発酵ブイヨンからレプロマイシンを単離することによってレプロマイシンを製造することができることを開示する。 ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体は、野生型ミクロモノスポラ・ロサリアにおいて見出されるエポキシダーゼ酵素活性を含まない。 それゆえ、該突然変異体は、
エポキシ化マクロライドロサマイシンを生産することができない。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、オレフィンマクロライドを生産しうる微生物の製造方法であって、
野生型エポキシマクロライド生産性微生物のエポキシダーゼ活性を不活化させることを含む上記方法に関する。 【０００７】本発明は、具体的に、前記オレフィンマクロライドがジエノンマクロライドである前の段落に記載の方法に関する。 【０００８】本発明は、更に、オレフィンマクロライドを生産しうる微生物の製造方法であって、野生型エポキシマクロライド生産性微生物のエポキシダーゼ活性を不活化させることを含み、そして更に、前記エポキシダーゼ活性をコードしている遺伝子を前記野生型エポキシマクロライド生産性微生物から単離し且つ該遺伝子を不活化させることを含む上記方法に関する。 【０００９】本発明は、具体的に、前記オレフィンマクロライドがジエノンマクロライドである前の段落の方法に関する。 【００１０】本発明は、更に具体的に、オレフィンマクロライドを生産しうる微生物の製造方法であって、該微生物に対応する野生型微生物からエポキシダーゼ活性をコードしている遺伝子を単離し且つ該エポキシダーゼ活性を不活化させることを含み、前記エポキシダーゼ活性をコードしている前記遺伝子を前記野生型微生物から相補性によって単離する上記方法に関する。 【００１１】本発明は、更に、オレフィンマクロライドの製造方法であって、第一微生物に対応する野生型微生物中に存在するエポキシダーゼをコードしている遺伝子の不活化によって製造された該第一微生物を、同化しうる炭素源および窒素源を含む水性栄養培地中で発酵させることを含む上記方法に関する。 【００１２】本発明は、更に、前記オレフィンマクロライドを前記発酵ブイヨンから単離することを更に含む前の段落に記載の方法に関する。 【００１３】本発明は、具体的に、前記オレフィンマクロライドがジエノンマクロライドである前の段落に記載の方法に関する。 【００１４】本発明は、更に、上記式（ＩＩ）を有する化合物であるレプロマイシンの製造方法であって、突然変異微生物であって、いずれのエポキシダーゼ活性も不存在のためにレプロマイシンを生産しうるがロサマイシンを生産することができない該突然変異微生物を、同化しうる炭素源および窒素源を含む水性栄養培地中で発酵させて発酵ブイヨンを製造することを含む上記方法に関する。 【００１５】本発明は、更に、前記レプロマイシンを前記発酵ブイヨンから回収することを更に含む前の段落に記載の方法に関する。 【００１６】本発明は、具体的に、前記突然変異微生物がミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体である前の段落の方法に関する。 【００１７】本発明は、更に具体的に、前記突然変異微生物がミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体であり、該突然変異体をＡＴＣＣ５５７０９と称する前の段落の方法に関する。 【００１８】本発明はまた更に、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体に関する。 【００１９】本発明は、具体的に、ＡＴＣＣ５５７０９
と称されるミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体に関する。 【００２０】本発明は、更に具体的に、ＡＴＣＣ５５７
０９の識別特性を全て有するミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体に関する。 【００２１】本発明は、更に具体的に、単離しうる量のレプロマイシンを生産することができるミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体に関する。 【００２２】本発明はまた更に、上記式（ＩＩ）を有する化合物であるレプロマイシンの製造方法であって、ロサマイシン生産性微生物を突然変異させて突然変異微生物を提供し、該突然変異微生物は、いずれのエポキシダーゼ活性も不存在のためにレプロマイシンを生産しうるがロサマイシンを生産することができず、そして次に、
該突然変異微生物を、同化しうる炭素源および窒素源を含む水性栄養培地中で発酵させて発酵ブイヨンを製造することを含む上記方法に関する。 【００２３】本発明は、具体的に、前記ロサマイシン生産性微生物がミクロモノスポラ・ロサリア ＡＴＣＣ２
９３３７またはミクロモノスポラ・ロサリア ＡＴＣＣ
５５７０８である前の段落に記載のレプロマイシンの製造方法に関する。 【００２４】本発明は、更に、レプロマイシンを前記発酵ブイヨンから単離することを更に含む、前の二つの段落に記載の方法に関する。 【００２５】本発明はまた更に、レプロマイシンの製造方法であって、突然変異微生物を、同化しうる炭素源および窒素源を含む水性栄養培地中で発酵させることを含む上記方法に関する。 【００２６】本発明は、具体的に、前記突然変異微生物がミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体である前の段落に記載の方法に関する。 【００２７】本発明はまた、更に具体的に、ミクロモノスポラ・ロサリアの前記ｒｏｓＸ突然変異体をＡＴＣＣ
５５７０９と称する前の段落に記載の方法に関する。 【００２８】本発明は、更に、前記レプロマイシンを回収することを更に含む、前の三つの段落のいずれか一つに記載のレプロマイシンの製造方法に関する。 【００２９】本発明はまた更に、オレフィンマクロライドの製造方法であって、（ａ）エポキシマクロライド生産性微生物を突然変異させて突然変異微生物を提供し、
該突然変異微生物は前記エポキシマクロライドに対応するオレフィンマクロライドを生産することができ；そして（ｂ）該突然変異微生物を、同化しうる炭素源および窒素源を含む水性栄養培地中で発酵させることを含む上記方法に関する。 【００３０】本明細書中で用いられる場合、「野生型微生物」という用語は、対応する突然変異微生物において欠失しているエポキシダーゼ活性を有する微生物を意味する。 更に、本明細書中で用いられる場合、「野生型ミクロモノスポラ・ロサリア」という用語は、エポキシダーゼ活性を有し、したがって単離しうる量のロサマイシンを生産することができるミクロモノスポラ・ロサリアの培養物を意味し、ここにおいて、エポキシダーゼ活性は、ミクロモノスポラ・ロサリアの対応するｒｏｓＸ突然変異体において欠失している。 【００３１】 【課題を解決するための手段】ミクロモノスポラ・ロサリアは、本明細書中上記の式（Ｉ）を有するエポキシド含有マクロライド抗生物質である強力な抗生物質ロサマイシンを産生する微生物である。 ミクロモノスポラ・ロサリアのゲノム中には、レプロマイシン（本明細書中上記の式ＩＩを有する化合物）のＣ−１２／Ｃ−１３二重結合をエポキシドに変換する酵素をコードするエポキシダーゼ遺伝子が存在する。 それゆえ、ミクロモノスポラ・ロサリアからのＤＮＡは、本発明の方法によって、他のエポキシマクロライド生産性微生物においてエポキシダーゼ酵素をコードするＤＮＡセグメントを決定するプローブを開発するのに用いられる。 【００３２】ミクロモノスポラ・ロサリア ＮＲＲＬ３
７１８（ＡＴＣＣ２９３３７）の凍結乾燥試料は、ブダペスト条約の条件に基いて、１９９５年９月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）、パークローン・ドライブ１２３０１、ロックビル、メリーランド州、２０８５２、米国に寄託された。 この新規に寄託された培養物は、ＡＴＣＣ５５７０
８の新受託番号を与えられた。 そのように寄託された微生物培養物の公的利用可能性に対する制限はいずれも、
本出願による特許の発行によって決定的に排除されるであろう。 【００３３】ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体は、Ｃ−１２およびＣ−１３炭素間にエポキシドよりもむしろオレフィン結合を有するロサマイシンの誘導体である強力なマクロライド抗生物質レプロマイシンを産生する微生物である。 ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体は、ミクロモノスポラ・ロサリア中に存在するエポキシダーゼ酵素を欠いている。 したがって、中間体Ｃ−１２／Ｃ−１３オレフィンマクロライドは、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体によってエポキシマクロライドロサマイシンに変換されることはできない。 それゆえ、ミクロモノスポラ・
ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体を本発明の方法にしたがって用いて、該ｒｏｓＸ突然変異体を発酵させることによっておよび当業者に周知の方法にしたがってその発酵ブイヨンからレプロマイシンを単離することによってレプロマイシンを製造する。 この単離は、発酵ブイヨンから直接的に該レプロマイシンを抽出することによってまたは該発酵ブイヨンを濾過して全細胞を除去し且つ該レプロマイシンを濾液から抽出することによって達成されうる。 概して、濾液を抽出することによって大部分のレプロマイシンが回収される。 しかしながら、濾過によって得られたかたまりの細胞を更に抽出して、少量のレプロマイシンを回収することができる。 概して、レプロマイシンを発酵ブイヨンの濾過後の濾液から抽出するのが好ましい。 【００３４】ｒｏｓＸ突然変異体ミクロモノスポラ・ロサリア（Ｒ９４−３０４−９９ＳＣ２３）の凍結乾燥試料は、ブダペスト条約の条件に基いて、１９９５年９月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、パークローン・ドライブ１２３０１、ロックビル、
メリーランド州、２０８５２、米国に寄託された。 この寄託された培養物は、ＡＴＣＣ５５７０９の新受託番号を与えられた。 そのように寄託された微生物培養物の公的利用可能性に対する制限はいずれも、本出願による特許の発行によって決定的に排除されるであろう。 【００３５】本発明は、上記式（ＩＩ）を有する化合物であるレプロマイシンの製造を開示する。 本発明の方法によってレプロマイシンを製造するために、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体、好ましくは、
ＡＴＣＣ５５７０９と称される突然変異体を適当な増殖培地中に接種し、そして生産を確実にするのに十分な時間、例えば、２〜４日間振とうさせる。 ３日間の振とうが好ましい。 好ましい増殖培地は、セレロース（１０ｇ
／Ｌ）、コーンスターチ（５ｇ／Ｌ）、トウモロコシ浸漬固形物（２．５ｇ／Ｌ）、ＮＺ−アミンＹＴＴ（５ｇ
／Ｌ）、ＣｏＣｌ 2・６Ｈ 2 Ｏ（０．００２ｇ／Ｌ）、Ｐ
２０００（１ｍＬ／Ｌ）およびＣａＣＯ 3 （３ｇ／Ｌ）
を混合し且つ水を加えて最終容量１リットルにすることによって製造されるＪＤＹＴＴである。 ＮＺ−アミノＹ
ＴＴは、加水分解タンパク質（カゼイン）標品でありシェフィールド・プロダクツ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ）、ウッズ・コーナー、ノリッジ、ニューヨークから購入することができる。 当業者は、微生物の増殖を確実にするのに十分な栄養素を提供するであろう多数の他の代替製品または培地があることを理解するであろう。 使用前に、増殖培地は、ｐＨが塩基性である場合は塩酸の弱無水溶液またはｐＨが酸性である場合は水酸化ナトリウムの弱無水溶液を用いてｐＨ７．０に調整される。 好ましい培地を用いる場合、培地のｐＨは酸性であり、したがって、希水酸化ナトリウム水溶液の添加によって調整される必要がある。 次に、増殖培地を高温で約２０分間〜１時間、好ましくは３０分間滅菌する。
好ましい滅菌温度は、１２１℃の標準的なオートクレーブ温度を用いて約１２０℃である。 概して、微生物および増殖培地の混合物を２００〜３００ｒｐｍの２インチ行程振とう機において僅かに高温で振とうさせる。 好ましい温度は３０℃である。 「２インチ行程」という用語は、振とう機によって軌道上で振とうされるフラスコの水平変位を意味する。 当業者は、混合物を十分に振とうさせるいずれの方法も成分を混合するのに十分であることを理解するであろう。 培地の容量当たり約２０容量％
のグリセロールなどの適当な凍結保護剤を微生物増殖培地混合物に対して加え、そして培養物を−８０℃で短期間（１年未満）および液体窒素下において長期間貯蔵する。 【００３６】必要な時に、凍結培養物を十分な量の適当な増殖培地、例えば、ＪＤＹＴＴが入っているフラスコに入れ、そして実質的な量の微生物が現れるまで培養物を増殖させる。 フラスコの内容物を２インチ行程振とう機において２５０ｒｐｍおよび３０℃で３日間振とうさせるのが好ましい。 しかしながら、他の振とう機ｒｐ
ｍ、温度および時間は、所望の微生物を有効に増殖させるのに十分であることを示しうる。 【００３７】この発酵の内容物を十分な量の生産用培地、例えば、ＲＳＭ−６に対して加える。 ＲＳＭ−６
は、コーンスターチ（５０ｇ／Ｌ）、セレロース（１０
ｇ／Ｌ）、アルダミンＰＨ（５ｇ／Ｌ）、ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）（１０ｇ／Ｌ）、Ｍｇ
ＨＰＯ 4・３Ｈ 2 Ｏ（１０ｇ／Ｌ）、カゼイン加水分解産物（２．５ｇ／Ｌ）、アスパラギン（０．５ｇ／Ｌ）、
ＦｅＳＯ 4・７Ｈ 2 Ｏ（０．０２８ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ 4
・７Ｈ 2 Ｏ（０．５ｇ／Ｌ）、Ｋ 2 ＨＰＯ 4 （０．７５ｇ
／Ｌ）、ＣｕＳＯ 4・５Ｈ 2 Ｏ（０．００３ｇ／Ｌ）、Ｐ
２０００（１ｍＬ／Ｌ）を混合し且つ水を加えて最終容量１リットルにすることによって製造される。 当業者は、ＲＳＭ−６に代わりうる同様の結果を有する他の生産用培地があることを理解するであろう。 ＲＳＭ−６
は、用いられる場合、水酸化ナトリウムの希水溶液によってｐＨ７．０に調整され且つ使用直前に約１２１℃で約１００分間オートクレーブ処理される。 発酵は、任意の適当な発酵容器、例えば、フラスコ、ニュー・ブランズウィック発酵装置ジャー（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフッイック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃ
ｋ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ニュー・ブランズウィック、ニュージャージー州）、タンク等中で行ってよい。
この発酵は、僅かに高温で、概して約３０℃で約１００
〜１０００ｒｐｍの撹拌速度によって行われる。 概して、好ましい撹拌速度は約４５０ｒｐｍである。 発酵容器の撹拌によってその内容物に通気する。 通気は、混合物中に空気を吹込むことによっても達成されうる。 好ましくは、発酵ブイヨンのｐＨは、発酵中にｐＨが６．７
〜７．３のままであるように必要に応じてＮａＯＨまたはＨ 2 ＳＯ 4の添加によって調節される。 発酵は、概して、発酵を開始後約６０〜１２０時間で最高力価のレプロマイシンを生じるであろう。 レプロマイシン含有試料は、当業者に周知の方法を用いて発酵混合物から単離される。 発酵ブイヨンからレプロマイシンを抽出するのに適当な溶媒は、望ましくない発酵副生成物からレプロマイシンを分離し、そして単離されようとしているレプロマイシンと反応しないしまたはさもなければ悪影響を与えない任意の溶媒または溶媒混合物である。 この抽出に好ましい溶媒混合物は、メタノールおよび０．１Ｍリン酸二水素カリウム（ＫＨ 2 ＰＯ 4 ）の混合物である。 この混合物のｐＨが３．５であること、そしてメタノールおよび０．１Ｍ ＫＨ 2 ＰＯ 4の相対量が３５％メタノールおよび６５％ＫＨ 2 ＰＯ 4であることが特に好ましい。 【００３８】本発明は、更に、通常はエポキシマクロライドを生産する野生型微生物に由来するオレフィンマクロライドを生産することができる微生物の製造に関する。 本発明の方法において用いられる野生型微生物は、
エポキシマクロライドを生産し、したがって、オレフィンマクロライドを対応するエポキシマクロライドに変換する細胞内反応を触媒することに関与するエポキシダーセ酵素を有する微生物である。 この細胞内反応を触媒する未変化の状態のエポキシダーゼ酵素は、通常、全てのまたはほとんど全ての中間体ジエンをエポキシドに変換するであろう。 この細胞内過程の効率は、これらの微生物の発酵ブイヨンから感知しうるほどの量のオレフィンを単離することができないことで明らかになる。 したがって、これらのオレフィンを得るためには、微生物がオレフィンをエポキシドに変換するのを妨げる必要がある。 これを本発明の方法によって達成する。 【００３９】野生型ミクロモノスポラ・ロサリア ＡＴ
ＣＣ５５７０８中に存在するエポキシダーゼ酵素は、おそらくは通常の細胞過程、例えば、ＤＮＡセグメントからの転写に続くＲＮＡ転写物の翻訳を用いてミクロモノスポラ・ロサリアによって生産される。 この過程によるエポキシダーゼタンパク質の生産に関与するＤＮＡセグメントは、相補性などの当業者に周知の方法によって野生型ミクロモノスポラ・ロサリアのＤＮＡから単離され、該ＤＮＡセグメントは、エポキシダーゼ欠損突然変異ミクロモノスポラ・ロサリア ＡＴＣＣ５５７０９を相補することができる。 【００４０】相補性によってエポキシダーゼタンパク質の生産に関与するＤＮＡセグメントを得るために、以下の相補プロトコルを行う。 レプロマイシンのＣ−１２、
Ｃ−１３オレフィンをエポキシ化してロサマイシンのＣ
−１２、Ｃ−１３エポキシドを生成することに関与するエポキシダーゼの生成を支配する遺伝子を、ショットガンクローニングおよびトランス突然変異相補性によって野生型ミクロモノスポラ・ロサリアからクローン化する。 「ショットガンクローニング」という用語は、細菌プラスミド中へのＤＮＡの多数の異なる制限フラグメントのランダム挿入を意味することが当業者によって十分に理解されている。 相補性とは、ここで、ミクロモノスポラ・ロサリアｒｏｓＸ細胞においてトランス立体配置に導入された場合に、エポキシダーゼの合成を支配し且つ野生型表現型を生じるクローン化ゲノムフラグメントの能力を意味する。 トランス立体配置とは、細胞内においてＤＮＡの二つの異なる分子上に二つのエポキシダーゼ遺伝子が存在することを意味する。 トランス相補性分析において、突然変異エポキシダーゼ遺伝子は、宿主培養物のゲノムまたは染色体の一部分を形成し、そして正常なまたは野生型エポキシダーゼ遺伝子はベクターまたはプラスミド分子上に位置する。 トランス相補性は好ましいが、当業者は、シス相補性もまたこの相補性プロトコルにおいて用いることとができることを理解するであろう。 【００４１】ミクロモノスポラ・ロサリアｒｏｓＸ細胞は、該微生物がレプロマイシンのＣ−１２、Ｃ−１３オレフィンのエポキシ化に関与するエポキシダーゼ酵素を欠いているので、ロサマイシンを生産することができない。 その結果、レプロマイシンが突然変異細胞中に蓄積する。 しかしながら、エポキシダーゼ酵素の合成を支配する能力を有する特定のＤＮＡフラグメントを標準的な形質転換法によってミクロモノスポラ・ロサリアｒｏｓ
Ｘ細胞中に導入した場合、突然変異によって失われたまたは不活化した成分（エポキシダーゼ酵素機能）が回復する。 したがって、相補実験の結果として、突然変異培養物は、レプロマイシンをエポキシ化してロサマイシンを生成する能力を回復し、そしてここで野生型表現型を示す。 この相補試験を用いて、エポキシダーゼ遺伝子を有するＤＮＡフラグメントをミクロモノスポラ・ロサリアゲノムライブラリーから識別し且つクローン化する。 【００４２】エポキシダーゼタンパク質の生成を支配する遺伝子をミクロモノスポラ・ロサリアからクローン化する第一工程は、ゲノムライブラリーを作成することである。 このライブラリーは、野生型ミクロモノスポラ・
ロサリア（例えば、本出願に記載された菌株ＡＴＣＣ５
５７０８）から製造されたＤＮＡ染色体フラグメントから成る。 ゲノムまたは染色体ライブラリーという用語は、ここでは同義語として用いられ、野生型ミクロモノスポラ・ロサリアのゲノム全体を表わすと同時に、一組のクローン化ＤＮＡフラグメントを意味する。 ミクロモノスポラ・ロサリアが、その染色体ＤＮＡ中に極めて高いＧ＋Ｃ含量（約７０％）を有するグラム陽性微生物であることは当業者に周知である。 他の放線菌（Ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）種と同様、ミクロモノスポラ・ロサリアは、比較的大きいゲノノムを有すると考えられる。 このゲノムコンプレキシティーにより、ミクロモノスポラ・ロサリアＤＮＡライブラリーを構築する場合に大きいフラグメントのクローニングが特に有用になる。
コロニーライブラリー中の染色体のランダムＤＮＡ切断および最適存在量を前提とすると、スクリーニングされるクローンの数は、正比例によってゲノム寸法にも、反比例によってＤＮＡインサートの平均寸法にも関係している。 したがって、エポキシダーゼ遺伝子についてスクリーニングされるクローンの数を減少させるには、大きいＤＮＡ片をクローン化するのが好都合である。 更に、
これは、隣接したまたは重なり合ったクローンを識別することによって大きい染色体部分の制限地図を決定するのに必要な分析および操作の数を最小限にするのに極めて有益である。 ゲノムライブラリーを作成する技法は当業者に周知である。 ゲノムライブラリーの作成についての一般的な説明は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ），Ｊ． 、Ｅ． Ｆ． フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ． マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、「 Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ 」，１９８９年，第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー，
ＮＹに開示されている。 放線菌類染色体ライブラリー作成についての完全な説明は、ホプウッド（Ｈｏｐｗｏｏ
ｄ）ら、「 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 」，１９８５年，ザ・ジョン・
インス・ファンデーション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎ
ｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），ノリッジ，ＵＫに開示されている。 【００４３】染色体ＤＮＡは、上記の液体培地中で増殖されたミクロモノスポラ・ロサリアＡＴＣＣ５５７０８
の培養物から製造される。 菌糸体を遠心分離によって回収し、そしてゲノムＤＮＡを、ホプウッドら、上記に見られるプロトコルにしたがって製造する。 通常、ＤＮＡ
ペレットを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）などの水性緩衝液中に再懸濁させる。 次に、染色体ＤＮＡを、ＨａｅＩＩＩまたはＳａｕ３Ａなどの制限酵素によって部分的に消化する。 Ｓａｕ３Ａは、それが、インサートフラグメントのランダム集合を生じる４塩基配列を認識するので好ましい。 ６塩基配列を認識する酵素もまたこの操作で用いることができるが、このような酵素は、４塩基配列を認識する酵素の場合よりもインサートフラグメントの少ないランダム集合を認識するので、あまり好ましくない。 フラグメントを、ベクターの多クローニング部位中に存在する独特のＢａｍＨＩ部位に連結させる。 好ましいベクターは、コスミドシャトルベクターｐＣＤ４２５であるが、他のシャトルベクターを用いうることは当業者によって理解されるであろう。 放線菌類におけるクローニングに有用なｐＣＤ４２５および他のシャトルベクターについての十分な説明は、欧州特許公開第０６２０２８０
号明細書で見出される。 【００４４】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）およびミクロモノスポラ・ロサリア両方を形質転換しうるベクター中のゲノムフラグメントをクローン化することは好都合である。 コスミドシャトルベクターｐＣ
Ｄ４２５は、大腸菌細胞中において高コピー数および放線菌類細胞中において低コピー数を示す。 更に、ミクロモノスポラ・ロサリアにおいてゲノムにつき低または単コピー数を示すベクターを用いることは好ましい。 ｐＣ
Ｄ４２５は、大きいＤＮＡフラグメント（最大４０ｋｂ
まで）を安定に維持し且つ可能な遺伝子用量作用を避ける能力を有する好ましい低コピー数ベクターである。 当業者は、本発明において有用である別の低コピー数ベクター、例えば、欧州特許公開第０６１８２９７号明細書で開示されているｐＣＤ３９６が存在することを理解するであろう。 ｐＣＤ３９６もｐＣＤ４２５も、組換えＤ
ＮＡ実験で一般的に用いられる全ての大腸菌菌株において複製を可能にする広範に用いられるＣｏｌＥ１複製起点（サムブルック，Ｊ．ら、以下を参照されたい）、および放線菌種における低コピー数および広範な宿主範囲の維持を可能にするＳＣＰ２＊複製起点（リディエート（Ｌｙｄｉａｔｅ），Ｄ．Ｊ．、マルパルチダ（Ｍａｌ
ｐａｒｔｉｄａ），Ｆ． およびホプウッド，Ｄ． Ａ． 、
Ｇｅｎｅ ， ３５ ，２２３〜２３５，１９８５年を参照されたい）を有する。 これらのベクターはまた、放線菌細胞中への塀質転換によって抗生物質チオストレプトンに対する耐性を与えるｔｓｒ遺伝子、および大腸菌細胞中への形質転換によって抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるａｍｐ遺伝子を有する。 ｔｓｒ遺伝子およびａｍｐ遺伝子を用いて、細胞混合物から形質転換細胞を選択する。 更に、シャトルベクターｐＣＤ４２５は、Ｂ
ａｍＨＩクローニング部位に隣接したいくつかの制限酵素の高ＡＴ認識配列を有するコスミドベクターである。
高ＡＴ認識配列は、しばしば、ミクロモノスポラ・ロサリアゲノム中に現れるので、エポキシダーゼ遺伝子を含む高ＧＣゲノムＤＮＡインサートを単一制限フラグメントとして回復させるこれらの酵素の少なくとも一つを見出す可能性は大きい。 この特徴は、ミクロモノスポラ・
ロサリア中のエポキシダーゼ遺伝子を含む大きい染色体部分のインビトロ再構築および地図作成に有用である。
一般的なコスミドベクターの説明および別のコスミドベクターのリストは、サムブルックら、上記に開示されている。 この方法で、野生型ミクロモノスポラ・ロサリア培養物のゲノム全体を、シャトルベクターｐＣＤ４２５
に連結しているランダムに生じたＤＮＡフラグメントの形で表わすことができる。 次に、上記のように構築されたゲノムライブラリーを、ショットガン実験に用いることができる。 ショットガン実験とは、エポキシダーゼ遺伝子を有する特定のＤＮＡフラグメントを、ベクターに連結したランダムに生じたＤＮＡフラグメントのライブラリーから識別し且つクローニングすることを意味する。 【００４５】プラスミドＤＮＡは、バーンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）ら、 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ，１９７９年，７，１５１３〜１５２５に記載されたバーンボイムおよびドーリー（Ｄｏｌｙ）の方法の変法によって大腸菌中で構築されたミクロモノスポラ・ロサリアゲノムライブラリーから製造することができる。 プラスミドＤＮＡを製造する他の方法は、サムブルック、上記で見出される。 次に、プラスミドＤＮＡ標品を用いて、ミクロモノスポラ・ロサリアｒｏｓＸプロトプラスト化細胞を直接的に形質転換する。 ミクロモノスポラ・ロサリアｒｏｓＸ細胞のプロトプラストは、ホプウッドら、上記によって記載されたのと同様の標準法にしたがって製造される。 【００４６】或いは、大腸菌中で構築されたミクロモノスポラ・ロサリアゲノムライブラリーから製造されたプラスミドＤＮＡを用いて、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）Ｔ
Ｋ６４細胞などの中間体宿主細胞を形質転換する。 したがって、ミクロモノスポラ・ロサリアＤＮＡのゲノムライブラリーは、ストレプトミセス・リビダンスなどの中間体宿主中で得られる。 プラスミドＤＮＡは宿主ライブラリーから製造され、そしてこのプラスミドＤＮＡを用いて、本明細書中上記に記載されたのと同様のプロトコルを行うことによってミクロモノスポラ・ロサリアプロトプラストを形質転換する。 この方法は、大腸菌細胞から直接製造されたプラスミドＤＮＡを用いた場合に達成しうるよりも高い効率でのミクロモノスポラ・ロサリア細胞の形質転換を引き起こす。 ストレプトミセス・リビダンスプロトプラストの製造、ストレプトミセス・リビダンス形質転換、およびストレプトミセス・リビダンス宿主からのプラスミドＤＮＡの製造に用いられるプロトコルは当業者に周知であり、ホプウッドら、上記および国際特許出願公開第ＷＯ９５／１６７８１号明細書で見出される。 【００４７】ミクロモノスポラ・ロサリアの形質転換により、抗生物質チオストレプトンを含む寒天平板上で増殖しうる形質転換細胞（耐チオストレプトン性（ｔｓｒ
−Ｒ）形質転換細胞）を、選択因子として抗生物質チオストレプトンを含む寒天平板から最初に選択する。 これらの形質転換細胞は、寒天平板の目視観察によって検出される。 次に、耐チオストレプトン性であるそれらの形質転換細胞を、ロサマイシン産生についてスクリーニングする。 例えば、形質転換細胞によって生成された発酵産物は、抽出などによる通常の方法で回収される。 これらの形質転換細胞を、本明細書中上記のＲＳＭ−６などの適当な液体培地中で増殖させ、そして本明細書中に記載の通常のマクロライド単離法にしたがってそこからロサマイシンを抽出する。 得られたマクロライドをＨＰＬ
Ｃによって特性決定する。 ロサマイシン+表現型を示す培養物は、ｒｏｓＸ突然変異の相補性によるものであると考えられる。 次に、典型的なロサマイシン+形質転換細胞を、プラスミド減損を考慮する非選択的条件下で（プロトプラスト形成および再生後に）増殖させ、そして得られたチオストレプトン選択的（ｔｓｒ−Ｓ）コロニーを単離し且つ抗生物質生産について試験する。 これらのコロニーは、検出可能な量のロサマイシンを生産する能力を欠いていて、代わりにレプロマイシンを生産した。 後のことは、ロサマイシン+表現型が形質転換性Ｄ
ＮＡの存在によるものであってｒｏｓＸ突然変異の復帰によるものではないという強い証拠である。 【００４８】次に、形質転換されたミクロモノスポラ・
ロサリア培養物からのプラスミドＤＮＡは、大腸菌ＤＨ
−５αコンピテント細胞を、典型的なロサマイシン+形質転換細胞から回収された全ＤＮＡによって形質転換することによって救出される。 コンピテント大腸菌細胞、
例えば、大腸菌菌株ＤＨ−５α細胞（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． ），ゲイサーズバーグ，ＭＤ
から購入された）を、供給者によって指示された方法により、精製プラスミドＤＮＡによって形質転換する。 回収された耐アンピシリン性形質転換細胞は、サムブルックら、上記および当業者に知られているどこか他に記載の標準法にしたがって増殖させ、プラスミドを単離し、
そして分析する。 更に、プラスミドＤＮＡはまた、元の大腸菌ライブラリークローンから製造される。 元のライブラリープラスミドおよび再単離されたプラスミドのアガロースゲル電気泳動プロフィールの比較によって行われる制限分析は、全クラスを区別できないはずである。
この分析は、プラスミドがロサマイシン+形質転換細胞中の未変化の遊離レプリコンとして存在したかどうかを示す。 【００４９】次に、欠失分析およびサブクローニングの組合わせに続いて相補性によって、クローン化ＤＮＡフラグメント中にエポキシダーゼ活性の地図を作成する。
クローン化ＤＮＡフラグメントのエポキシダーゼをコードしている部分を決定するために、上記と同様の手順を用いて、この部分からの一連のＤＮＡセグメントをシャトルベクターｐＣＤ４２５中にサブクローン化する。 次に、これらの新規の構築物をミクロモノスポラ・ロサリアｒｏｓＸ ＡＴＣＣ５５７０９細胞中に形質転換し、
そして新規の形質転換細胞をレプロマイシン生産についてスクリーニングする。 サブクローンは、ｒｏｓＸ突然変異体培養物のロサマイシンの生産を回復するその能力によって識別される。 ｒｏｓＸ突然変異を相補する能力を示す最小のクローン化ＤＮＡフラグメントを配列順序決定する。 好ましい配列決定法は、サンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）ら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ，１９７７年，７４，５４６３〜５４６７に記載されたジデオキシ配列決定法である。 次に、配列分析プログラムを用いてその配列のエポキシダーゼコーディング領域について分析する。 この配列分析を行うのに好ましいソフトウェアは、ジェネティクス・コンピューター・
グループ・インコーポレーテッド（ｔｈｅＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ． ），マディソン，ウィスコンシン州の商標であるコドンプリフェレンス（ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ） +である。 このソフトウェアは、ジェネティクス・コンピューター・グループ・インコーポレーテッド，マディソン，
ウィスコンシン州から入手することができる。 この配列分析を行う場合、当業者は、放線菌遺伝子の特徴的なコドン使用およびＧ＋Ｃ第三位偏りをさがす。 この手順を用いて、エポキシダーゼ遺伝子全体を含む読み取り枠を識別する。 【００５０】本明細書中で用いられる場合の「読み取り枠」という用語は、終結シグナルを全く含まない遺伝情報の連続配列を意味する。 該配列は、タンパク質に翻訳可能である。 特に、本発明において、読み取り枠は、翻訳過程中にエポキシダーゼ酵素の合成を支配するのに必要な配列情報を含む。 【００５１】上記の相補手順に対する別のアプローチを用いて、レプロマイシンのＣ−１２、Ｃ−１３オレフィンをエポキシ化してロサマイシンのＣ−１２、Ｃ−１３
エポキシドを生成するのに関与するエポキシダーゼタンパク質をコードする遺伝子を野生型ミクロモノスポラ・
ロサリアからクローン化することができることは当業者に知られている。 特に、二つの別のアプローチとして、
復帰遺伝および相同プロービングがある。 復帰遺伝において、エポキシダーゼ酵素は、タンパク質精製の標準法を用いて精製され、そしてエポキシダーゼ酵素のＮ末端アミノ酸配列が決定される。 次に、このアミノ酸配列に基いて、ＤＮＡ配列を推論し且つ用いて、合成ＤＮＡプローブを製造する。 次に、このプローブを用いて、慣用的なハイブリダイゼーションに基くスクリーニングアプローチを用いることによって野生型ミクロモノスポラ・
ロサリアゲノムライブラリーからエポキシダーゼ遺伝子をクローン化する。 相同プロービングは、文献から入手可能な他の関連エポキシダーゼを比較することによって合成ＤＮＡプライマーまたは合成オリゴマーＤＮＡプローブを推論することにより行われる。 次に、これらのＤ
ＮＡプライマーまたは合成オリゴマーＤＮＡプローブを用いて、ＰＣＲか若しくはハイブリダイゼーション法または両者の組合わせを用いて野生型ミクロモノスポラ・
ロサリアゲノムＤＮＡから遺伝子をクローン化する。 これらのおよび他のアプローチは当業者に周知であり、これらの方法の一般的な説明はサムブルックら、上記で見出される。 【００５２】このＤＮＡセグメントのフラグメントをプローブとして用いて、概してエポキシマクロライドを生産する他の野生型微生物においてオレフィンの細胞内エポキシ化を触媒するエポキシダーゼ酵素の生産に関与するＤＮＡセグメントを決定する。 一つの微生物からの小ＤＮＡセグメントを、他の微生物の同様の配列を有するセグメントに対するプローブとしてどのように用いることができるかということは当業者に周知である。 この手順は、例えば、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィリー・
インターサイエンス・ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ），ＮＹ
（１９８７）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。 これらの技法を用いて、エポキシマクロライド抗生物質を生産しうる微生物で見出されるエポキシマクロライドへのオレフィンマクロライドの細胞内エポキシ化を触媒するのに関与するエポキシダーゼ酵素をコードするＤＮＡセグメントを容易に決定することができる。 以下の表は、エポキシマクロライド抗生物質を生産することができる微生物および該微生物によって生産されるエポキシマクロライド抗生物質のリストを含む。 この表は実際の例示であり、エポキシマクロライド抗生物質を生産しうる微生物を全て含むものではない。
当業者は、オレフィンマクロライドを生産しうる微生物を製造する本発明の方法が、以下の表１に記載された微生物を含むがそれに限定されないエポキシマクロライドを生産しうる微生物のいずれかを用いて行うことができる。 【００５３】 【表１】 【００５４】エポキシダーゼ酵素をコードしているＤＮ
Ａのセグメントは、当業者に周知の手順を用いて、エポキシ−ジエノンマクロライドを生産する微生物の菌株から見出される。 これを達成するために、全ゲノムＤＮＡ
を、ミクロモノスポラ・ロサリアから既に単離されたプローブＤＮＡセグメントとハイブリッド形成させる。 ハイブリッド形成は、当業者に周知の方法を用いて行われる。 例えば、概して、ゲノムＤＮＡを、制限酵素、例えば、ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１または他の周知の制限酵素を用いて切断してＤＮＡフラグメントにする。 得られるフラグメントは約１ｋｂ〜約１０ｋｂの範囲であるのが好ましい。 当然ながら、概して、特定のＤＮＡの配列および選択される特定の制限酵素に応じて１〜１０ｋｂより小さいまたは大きいフラグメントが存在するであろう。 これらのフラグメントを、概して、アガロースゲルを用いる電気泳動を用いて分析する。 分離が達成された後、フラグメントをニトロセルロースフィルターに移し、そしてＤＮＡを９０℃〜１００℃のような適当な温度を用いて融解して鎖を分離する。 ミクロモノスポラ・
ロサリアからのプローブを、周知の技法を用いて放射性にし、そして水溶液中のフィルターに加える。 温度を約４５℃〜６５℃まで低下させてＤＮＡを再アニーリングする。 当業者は、再アニーリングの最適性が、ハイブリッド形成される特定の微生物の独特のＤＮＡ配列に依ることを理解するであろう。 プローブは、実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するそのＤＮＡ鎖のみに結合するであろう。 ＤＮＡとハイブリッド形成するプローブに不可欠である相補性の程度は、ハイブリッド形成反応の温度によって調節される。 【００５５】ハイブリッドＤＮＡを得た後、フィルターを洗浄し且つ乾燥させ、そしてプローブ／ＤＮＡセグメントハイブリッドをＸ線フィルムオートライオグラフィーの使用によって検出する。 ＤＮＡフラグメントをＸ線フィルムオートラジオグラフィーによって確認されるようにハイブリッド形成させるならば、ＤＮＡライブラリーは、当業者に周知の方法を用いて目的の菌株から製造される。 次に、このライブラリー自体を、ミクロモノスポラ・ロサリアからの元の放射性プローブによってプローブして、ライブラリー中のコロニーが目的の遺伝子を含むことを確認する。 【００５６】次に、目的のコロニーからのＤＮＡを、配列決定するのに十分に小さいＤＮＡフラグメントが好都合に得られるまで、種々の制限酵素を用いて切断する。
当業者は、これが、しばしば、切断の結果をまとめる制限地図の作成を必要とすることを理解するであろう。 プローブとハイブリッド形成する目的の遺伝子を含む十分に小さいＤＮＡフラグメントが得られた場合、当業者に周知の手順を用いてフラグメントを配列順序決定して、
そのヌクレオチド配列を決定する。 概して、ＤＮＡフラグメントは、両末端に結合した数個の外来ヌクレオチド塩基を有するたった一つの遺伝子を含むのが好ましい。
しかしながら、時々、配列決定されるＤＮＡフラグメントの寸法を約２〜５ｋｂ未満まで減少させることは実際的ではないであろう。 それらの場合、更に大きいＤＮＡ
フラグメントを配列決定する。 このように、エポキシ化を触媒するタンパク質を発現する遺伝子のＤＮＡ配列はこの方法によって得られる。 【００５７】このＤＮＡ配列が目的の微生物のエポキシダーゼ酵素を発現することができないようにそれを失活させるには、その遺伝子のＤＮＡの一部分を切除する。
概して、除去されるＤＮＡの量は、約１〜３０ヌクレオチド塩基寸法であるが、失活させる特定の遺伝子および遺伝子を失活させるのに用いられる方法に応じて、更に多数の塩基を除去することができる。 ヌクレオチド塩基の遺伝子からの切除は、当業者に周知の方法を用いて行われ、例えば、限定されないが、制限酵素を単独でかまたはエキソヌクレアーゼと組合わせて用いること、およびエポキシダーゼをコードしている遺伝子に特異的に集中する１対の特異的突然変異原性プライマーと組合わせたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用がある。 切除が達成され後、ヌクレオチド塩基が遺伝子の内部部分から除去された場合、このようにして生じた二つのＤＮＡ
フラグメントを連結して、欠失のある遺伝子を生成する。 次に、この工学処理された欠損遺伝子を配列順序決定して、欠損遺伝子のヌクレオチド配列を決定する。 当業者は、欠失が、通常、活性タンパク質を発現する遺伝子の能力の失活をもたらすということを理解するであろう。 しかしながら、希に、欠失は、このような失活を引き起こさないことがある。 それらの希な状況においては、ヌクレオチド配列の別の部分を欠失させて遺伝子を失活させる必要があろう。 【００５８】或いは、エポキシダーゼ遺伝子の完全な不活化を確実にするために、抗生物質マーカーを欠失配列の代わりに挿入する。 この研究に好ましい抗生物質マーカーは、サッカロポリスポラ・エリトレア（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ）（以前はストレプトミセス・エリトレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ））のｅｒｍＥ遺伝子である。 このマーカーの説明については、ホプウッドら、上記を参照されたい。 このマーカーは、形質転換されたミクロモノスポラ・ロサリア細胞に対して耐エリスロマイシン性を与える。 ネオマイシン、ハイグロマイシン、ビオマイシンなどの他の抗生物質に対する耐性を与える更に別の有用なマーカーを同様の目的で用いることができる。 完全な制限地図情報を含めたこれらのマーカーのリストについては、Ｄ． Ａ． ホプウッドら、上記を参照されたい。 標準的なクローニング法を用いて、エポキシダーゼ遺伝子の欠失部位にｅｒｍＥマーカーを挿入する。 マーカーは、エポキシダーゼ読み取り枠のそれとは反対の配向に位置して、下流遺伝子の過発現によって起こりうる致死を回避する。 このマーカーを挿入して目的の遺伝子を分断するために、国際特許公開第ＷＯ９５
／１６７８１号明細書を参照されたい。 切断されたエポキシダーゼ遺伝子中に挿入された抗生物質マーカーは、
以下の部分で論及されるように、野生型菌株の突然変異遺伝子の置換を促進して、目的の微生物での遺伝子置換実験の成功を監視することを可能にするであろう。 【００５９】次に、失活した遺伝子が得られた菌株の野生型は、ジエンをエポキシ化してエポキシドを生成することができ、工学処理された失活した遺伝子を含むように操作される。 これは、当業者に周知の遺伝子置換法にしたがって行われる。 概して、遺伝子をＤＮＡデリバリーベクター、例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはコスミド中に挿入する。 本発明において有用な微生物に対して形質転換または接合などの当業者に周知の技法によって工学処理された遺伝子を供給するのにプラスミドを用いることは好ましい。 形質転換は、微生物のＤＮＡに対して工学処理された遺伝子を転移するプラスミドによって微生物を形質転換することにより達成される。 【００６０】目的の微生物の染色体中への突然変異遺伝子の転移は、宿主染色体とそれに対する相同部分を有するプラスミドとの間の組換えによって起こる。 プラスミド上の変更されたＤＮＡ配列によるゲノムセグメントの置換は、インビボ相同的組換えに依ると考えられる。 好ましくは、同時に起こる二つの交差、すなわち、組込みをもたらす単一交差および組込まれたプラスミドが切除される引続きの分離工程は、クローン化および内在配列間の相互交換を引き起こす。 このアプローチを用いることにより、エポキシダーゼ酵素をコードしている遺伝子の読み取り枠を分断することは可能である。 分断は、染色体の欠失か若しくは抗生物質マーカーの挿入または両方を必要とする。 得られた突然変異体菌株はエポキシダーゼ活性を欠き、安定であり、そして発酵によって単離しうる価値のあるオレフィンマクロライドを生成するのに用いることができる。 【００６１】組込みベクターとも称されるプラスミドの構築は、遺伝子置換による突然変異菌株の発生において決定的な工程を構成している。 組込みベクターの一つの重要な特徴は、放線菌染色体中の遺伝子の置換後に、ベクターが宿主細胞から完全に除去されることである。 多数のベクターが、キーサー（Ｋｉｅｓｅｒ），Ｔ． およびホプウッド，Ｄ． Ａ． 、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｙ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ，１９９１年，２０４巻，４３０〜４
５８に開示されている。 本発明において、シャトルベクターｐＣＤ２６２は、目的の微生物のエポキシダーゼ欠損菌株の構築で用いられる。 このベクターは、放線菌類および大腸菌の両方でクローニングに、並びに放線菌類の種々の遺伝子置換用途に有用な一組の変化しやすいシャトルベクターの一部分を成している。 例えば、欧州特許出願公開第０６１８２９７号明細書参照されたい。 ベクターｐＣＤ２６２は、放線菌類の中〜高コピー数を調節する複製起点を有する。 ベクターによって形質転換されたミクロモノスポラ・ロサリア細胞に、高温、胞子形成またはプロトプラスト化などのストレス、そして引続き再生を施した場合、多数のプラスミド不含コロニーを回収することができる。 【００６２】エポキシダーゼタンパク質をコードしている遺伝子の不活化変種を有するプラスミドの構築は、組込みベクター中への失活したエポキシダーゼ遺伝子のクローニングを必要とする。 失活したエポキシダーゼ遺伝子は、ミクロモノスポラ・ロサリアゲノムフラグメントのほぼ中央に位置している。 このフラグメントは、エポキシダーゼ遺伝子の交換（失活および野生型）を高頻度で促進するように、少なくとも３ｋｂ長さであるべきである。 フラグメントの寸法が、用いられる特定のシャトルベクターによって制限されるということは当業者に理解される。 組込みベクターは、いくつかのマーカー遺伝子、例えば、該ベクターが大腸菌細胞中で複製された場合に耐アンピシリン性を与えるａｍｐ、および該ベクターが形質転換によってミクロモノスポラ・ロサリア細胞に導入された場合に耐チオストレプトン性を与えるｔｓ
ｒを含む。 更に、組込みベクターは、不活化エポキシダーゼ遺伝子の中央に挿入されたｅｒｍＥマーカーを含み、これはミクロモノスポラ・ロサリア形質転換細胞において耐エリスロマイシン性を与える。 これらの操作に好ましいベクターは、シャトルベクターｐＣＤ２６２である。 しかしながら、他の組込みベクターおよび抗生物質マーカーもまた、プラスミドを構築するのに有効に用いることができることは当業者に理解されるであろう（キーサー，Ｔ．およびホプウッド，Ｄ．Ａ．、１９９
１年， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｙｚｙｍｏｌｏｇｙ ，
２０４巻，４３０〜４５８頁のストレプトミセス属の遺伝子操作：組込みベクターおよび遺伝子置換（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を参照されたい）。 形質転換の際に、形質転換されたコロニーを、エポキシダーゼ読み取り枠を不活化させるのに用いられるマーカー遺伝子を含まない微生物を全て死滅させる抗生物質によって刺激する。 残っている細胞だけが、
組込みベクターを取り込んだものである。 これらの中には、染色体中に挿入された欠損工学処理された遺伝子を有し且つ野生型エポキシダーゼ発現遺伝子を含まない細胞があるであろう。 次に、欠損工学処理された遺伝子を含む形質転換微生物を、当業者に周知の発酵法を用いて発酵させる。 微生物はエポキシド含有マクロライドを生産することが既に知られているので、この微生物の標準的な発酵法は既に確立されているであろう。 野生型微生物によって生成されるエポキシ化マクロライドの存在について発酵ブイヨンを分析する。 野生型微生物が最初に生産したエポキシ化マクロライドの不存在およびジエンマクロライドの存在は、微生物がジエンマクロライド前駆体だけを生産するようにうまく工学処理されたことを示している。 ジエンマクロライドは、当業者に周知の方法を用いて単離される。 【００６３】野生型微生物を、エポキシマクロライドを生産することができ、したがってその最終のおよび単離可能な産物としてオレフィンマクロライドを生産する微生物に変換するために、野生型微生物中に存在する遺伝子を、更に、分子レベルでの化学的突然変異誘発によってまたは遺伝子分断などの当業者に周知の他の方法によって不活化させることができる。 分子遺伝学応用に関係する方法論はいずれも、本明細書中上記の遺伝子の識別を必要とすることは当業者に理解されるであろう。 次に、不活化遺伝子は、微生物においてエポキシダーゼ酵素を合成することができない。 したがって、微生物によって行われる抗生物質合成はオレフィン段階で停止する。 オレフィンは、本明細書中においてレプロマイシンを単離するのに示された方法または当業者に周知の他の標準法を用いて単離される。 【００６４】ミクロモノスポラ・ロサリア ＡＴＣＣ５
５７０９のｒｏｓＸ突然変異体を得るために、野生型ミクロモノスポラ・ロサリアの培養物を適当な増殖培地と混合し且つ２８℃〜３０℃において２００〜２２５ｒｐ
ｍで振とうする。 この突然変異誘発法を、エポキシダーゼ活性を有するミクロモノスポラ・ロサリアの任意の培養物または突然変異体で行って、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体を製造することができるということは当業者に理解されるであろう。 適当な増殖培地は当業者に周知である。 ミクロモノスポラ・ロサリアの増殖に好ましい増殖培地はＹＰＤ−６培地である。 概して、２分の１強度ＹＰＤ−６培地を用いるのが好ましい。 ミクロモノスポラ・ロサリアの培養物は僅かに増殖した培養物であるのが好ましい。 僅かに増殖した培養物とは、密集した大量の増殖を示す十分に増殖した培養物と比較すると、僅かに目に見える濁りのある培養物である。 ２分の１強度ＹＰＤ−６は、ディフコ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ）（５ｇ／
Ｌ）、バクト（Ｂａｃｔｏ）ペプトン（５ｇ／Ｌ）、デキストロース（２．５ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ緩衝液（５ｇ
／Ｌ）を混合し且つ最終容量を１リットルにする十分な水を加えることによって製造される。 ｐＨは、希水酸化ナトリウム水溶液によってｐＨ７．０に調整される。 この培養物を、メタンスルホン酸、エチルエステル（ＥＭ
Ｓ）または重亜硫酸ナトリウムなどの適当な化学的突然変異誘発性剤によって処理する。 突然変異原性剤の濃度は、本明細書中以下に記載の基準を用いて経験的に決定することができる。 ＥＭＳを用いる場合、例えば、ＥＭ
Ｓの量は、概して、微生物の培養物の僅かに増殖した２
ｍＬアリコートに対して約１５〜４０μＬである。 好ましい突然変異誘発性剤はＥＭＳである。 突然変異誘発反応は、１５℃〜４０℃のような温度で３〜１０時間インキュベートされる。 突然変異誘発反応は、３０℃で振とうしながら４．５〜５時間行うのが好ましい。 更に、突然変異誘発反応フラスコを３０℃において２００〜２２
５ｒｐｍで振とうさせるのが好ましい。 突然変異誘発反応培養物を適当な培地、例えば、新鮮ＳＣＭ培地によって希釈し、そして遠心分離する。 概して、上澄みは除去され且つ捨てられる。 遠心分離による細胞ペレットを新鮮増殖培地中に再懸濁させる。 概して、この増殖培地は、野生型ミクロモノスポラ・ロサリアの最初の増殖中に用いられる増殖培地と同一であるのが好ましい。 これを固形培地上で滴定して、突然変異誘発生存菌の数を決定する。 １０００個またはそれ以上のコロニーが残っている場合のみ、プロトコトルを続ける。 もっと少ないコロニーしか見られない場合、概して、上記手順を繰返し且つもっと少ないＥＭＳ（１５〜２０μＬ）を用いる。
突然変異が誘発されなかった対照と比較して５０％未満のコロニーの死滅が観察される場合、上記手順を繰返してよいし且つもっと多いＥＭＳ（３０〜５０μＬ）が用いられるであろう。 生存菌の入った試験管を、培養物が十分に増殖するまで２〜３日間インキュベートする。 滅菌グリセロール（８０％、２ｍＬ）を各生存菌試験管に加え、そして各試験管を−２０℃のフリーザーに入れる。 ２４〜４８時間後、凍結培養物を将来の対照用に滴定する。 ｒｏｓＸ突然変異体を単離するために、突然変異を誘発した親培養物の凍結原液の単コロニーを増殖させ且つ発酵させて２ｍＬ培養物にする。 この培養産物は、ブイヨンを抽出用緩衝液８ｍＬによって抽出した後に試験され、ＨＰＬＣによって実験される。 突然変異体を抽出するのに用いられる抽出用緩衝液は、ＨＰＬＣ分析において用いられる「移動相」と同一である。 当業者は、ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体を生じることができる他の突然変異誘発法が存在することを理解するであろう。 【００６５】本発明の方法によって製造されるマクロライドオレフィンの抗生物質としての有用性は、ワグマン（Ｗａｇｍａｎ）ら、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ ，１９７２年， ２５ ，６４１〜６４６で開示されたような当業者に周知の方法を用いて該化合物を試験することによって実証される。 【００６６】本明細書中で用いられる場合の「ＨＰＬ
Ｃ」という用語は、当業者によって用いられる分析的および単離技術である「高速液体クロマトグラフィー」を意味する。 【００６７】本発明は、以下の実施例によって例証されるが、その詳細に限定されない。 Ｐ−２０００はポリプロピレングリコールであり、ジョージ・マン・アンド・
カンパニー・インコーポレーテッド（Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ
ａｎｎ ＆ Ｃｏ． ，Ｉｎｃ． ）、ターミナル・ロード１７５、プロビデンス、ロード・アイランド、０２９０
５から購入される。 ファーマメディアは、綿実由来タンパク質栄養素であり、トレイダーズ・プロテイン・ザ・
バッキー・セルロース・コーポレーション（Ｔｒａｄｅ
ｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｈｅ Ｂｕｃｋｅｙｅ Ｃｅ
ｌｌｕｌｏｓｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、私書箱８４
０７、メンフィス、テネシー州、３８１０８から購入される。 アルダミンＰＨは、チャンプレイン・インダストリーズ・インコーポレーテッド（Ｃｈａｍｐｌａｉｎ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｃ． ）、ステート・ストリート７９、ハーバー・ビーチ、ミシガン州、４８４４１
から購入される。 ペプチカーゼ（Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ）
は、シェフィールド・ケミカル、ノリッジ、ニューヨークから購入される。 【００６８】 【実施例】 実施例１ ＃１． レプロマイシンの製造−発酵装置規模標準接種材料として用いるための凍結ロットを製造するために、ミクロモノスポラ・ロサリアをＪＤＹＴＴ培地（セレロース１０ｇ／Ｌ、コーンスターチ５ｇ／Ｌ、トウモロコシ浸漬固形物２．５ｇ／Ｌ、ＮＺ−アミンＹＴ
Ｔ ５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ 2・６Ｈ 2 Ｏ ０．００２ｇ／
Ｌ、Ｐ２０００ １ｍＬ／Ｌ、ＣａＣＯ 3 ３ｇ／Ｌ）中に接種し且つ約３日間振とうさせた（２５０ｒｐｍ、３
０℃、２インチ行程）。 ＪＤＹＴＴ培地は約ｐＨ７．０
に調整され、使用する前に約１２１℃で約３０分間滅菌された。 細胞増殖が完了した後、グリセロール（最終濃度２０％）を凍結保護剤として加え、そして培養物を約−８０℃で貯蔵した。 【００６９】接種材料を製造するために、凍結培養物ロット５ｍｌを、２．８Ｌフェルンバッハフラスコ中のＪ
ＤＹＴＴ培地１リットルに入れた。 培養物を約３０℃で振とうしながら（２５０ｒｐｍ、２インチ行程）約３日間増殖させた。 フェルンバッハの内容物全部を、２枚の４ ３／４インチ攪拌機ブレードを有する１４Ｌ発酵装置ジャー（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフッイック、ニュー・ブランズウィック、ＮＪ）中の８Ｌ
の生産用培地ＲＳＭ−６に入れた。 ＲＳＭ−６の組成は、コーンスターチ５０ｇ／Ｌ、セレロース１０ｇ／
Ｌ、アルダミンＰＨ５ｇ／Ｌ、ファーマメディア１０ｇ
／Ｌ、ＭｇＨＰＯ 4・３Ｈ 2 Ｏ １０ｇ／Ｌ、カゼイン加水分解産物２．５ｇ／Ｌ、アスパラギン０．５ｇ／Ｌ、
ＦｅＳＯ 4・７Ｈ 2 Ｏ ０．０２８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ 4・
７Ｈ 2 Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ 2 ＨＰＯ 4 ０．７５ｇ／
Ｌ、ＣｕＳＯ 4・５Ｈ 2 Ｏ ０．００３ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ
2・４Ｈ 2 Ｏ ０．００３ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ 4・７Ｈ 2 Ｏ
０．００３ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ 2・６Ｈ 2 Ｏ ０．００３ｇ
／Ｌ、Ｐ２０００ １ｍＬ／Ｌであった。 ＲＳＭ−６
は、希水性ＮａＯＨによって約ｐＨ７．０に調整され、
そして使用前に約１２１℃で約９９分間オートクレーブ処理された。 発酵は、約３０℃、４５０ｒｐｍ、０．３
４ｖ／ｖ／ｍ空気で行われ、ｐＨは、ＮａＯＨ／Ｈ 2 Ｓ
Ｏ 4によってまたはＭＯＰＳ ６ｇ／Ｌを生産用培地に加えることによって６．７〜７．３に調節された。 レプロマイシン力価は、典型的に、６９〜１１６時間でピークに達した。 試料は、ＨＰＬＣ（イナートシル（Ｉｎｅ
ｒｔｓｉｌ）Ｃ−８カラム、Ｓｕ，２５０ｘ４．６ｍｍ
（メタケム・テクノロジーズ（Ｍｅｔａｃｈｅｍ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、トランス、ＣＡ）、３０℃、
流速０．６ｍｌ／分、ＵＶによって２８０ｎｍで検出される、移動相Ｈ 2 Ｏ：アセトニトリル：ＴＨＦ：：６
０：２８：１２、０．０５％トリフルオロ酢酸）による検定のために溶媒混合物（３．５：６．５のメタノール：０．１Ｍ ＫＨ 2 ＰＯ 4緩衝液、ｐＨ３．５）中に抽出された。 ミクロモノスポラ・ロサリア Ｒ９４−３０
４−９９ＳＣ２３（ＡＴＣＣ５５７０９）は、これらの条件下においてレプロマイシン３６８〜３９８ｍｇ／Ｌ
を生産した。 【００７０】 ＃２． レプロマイシンの製造−フラスコ規
模標準接種材料を上記のように、または３００ｍｌエレンマイヤーフラスコ中のＪＤＹＴＴ接種用培地３０ｍｌに対して凍結培養物ロット２ｍｌを加えることによって製造した。 培養物を約３０℃で振とうしながら（２５０ｒ
ｐｍ、２インチ行程）約３日間増殖させた。 接種材料２
ｍｌを、３００ｍｌエレンマイヤーフラスコ中の修飾Ｒ
ＳＭ−５培地（コーンスターチ３０ｇ／Ｌ、ファーマメディア１０ｇ／Ｌ、セレロース１０ｇ／Ｌ、アルダミンＰＨ ５．０ｇ／Ｌ、アスパラギン０．５ｇ／Ｌ、Ｆｅ
ＳＯ 4・７Ｈ 2 Ｏ ０．０２８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ 4・７Ｈ 2
Ｏ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ 2 ＨＰＯ 4 ０．７５ｇ／Ｌ、ＣｕＳ
Ｏ 4・５Ｈ 2 Ｏ ０．００２ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ 2・４Ｈ 2 Ｏ
０．００３ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ 4・７Ｈ 2 Ｏ ０．００３
ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ６ｇ／Ｌ、カゼイン加水分解産物２．５ｇ／ＬおよびＭｇＨＰＯ 4・３Ｈ 2 Ｏ １０ｇ／
Ｌ、Ｐ２０００ １ｍＬ／Ｌ、ｐＨ７．０（希水性Ｎａ
ＯＨによって調整される）、約１２１℃で約２０分間オートクレーブ処理される）約３０ｍｌ中に入れた。 フラスコ実験は、約３０℃で３〜４日間振とうされた。 発酵ブイヨンを上記のように抽出し且つＨＰＬＣ検定に供した。 ミクロモノスポラ・ロサリア Ｒ９４−３０４−９
９ＳＣ２３（ＡＴＣＣ５５７０９）は、これらの条件下においてレプロマイシン４５５ｍｇ／Ｌを生産した。 【００７１】 実施例２ ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体の製
造ミクロモノスポラ・ロサリアの新鮮な僅かに増殖した培養物（１０ｍＬ）を２分の１強度ＹＰＤ−６培地と混合し且つ２８℃〜３０℃において２００〜２２５ｒｐｍで振とうさせた。 僅かに増殖した培養物とは、密集した大量の増殖を示す十分に増殖した培養物と比較すると、僅かに目に見える濁りのある培養物である。 ２分の１強度ＹＰＤ−６は、ディフコ酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、バクトペプトン（５ｇ／Ｌ）、デキストロース（２．５ｇ／
Ｌ）、ＭＯＰＳ緩衝液（５ｇ／Ｌ）を、混合物の全容量が１リットルであるように十分な水中で混合することによって製造された。 ｐＨは、希水酸化ナトリウム水溶液によってｐＨ７．０に調整された。 【００７２】メタンスルホン酸、エチルエステル（ＥＭ
Ｓ、２５μＬ）をこの培養物／培地混合物（２ｍＬ）に対して加え、そして反応混合物を３０℃において２００
〜２２５ｒｐｍで振とうしながら４．５〜５時間インキュベートした。 培養物を新鮮ＳＣＭ培地（８ｍＬ）によって希釈した。 これを遠心分離し、そして上澄みは注意深く除去され且つ捨てられた。 【００７３】遠心分離による細胞ペレットを新鮮な２分の１強度ＹＰＤ培地（２ｍＬ）中に再懸濁させ且つ固形培地上で滴定して、突然変異誘発生存菌の数を決定した。 １０００個またはそれ以上のコロニーが残っていた場合のみ、プロトコトルを続けた。 もっと少ないコロニーしか見られなかった場合、上記手順を繰返し且つもっと少ないＥＭＳ（１５〜２０μＬ）を用いた。 突然変異が誘発されなかった対照と比較して５０％未満のコロニーの死滅が観察された場合、上記手順を繰返し且つもっと多いＥＭＳ（３０〜５０μＬ）を用いた。 この実験において、２５μＬで所望の範囲内のコロニーが得られたので、手順を続けることができた。 【００７４】生存菌の入った試験管を、培養物が十分に増殖するまで２〜３日間インキュベートした。 滅菌グリセロール（８０％、２ｍＬ）を各生存菌試験管に加え、
そして各試験管を−２０℃のフリーザーに入れた。 ２４
〜４８時間後、凍結培養物を将来の対照用に滴定した。 【００７５】ｒｏｓＸ突然変異体を単離するために、突然変異を誘発した親培養物の凍結原液からのＹＰＤ寒天培地上で単離された単コロニーを増殖させ且つ発酵させて２ｍＬ培養物にした。 培養産物は、ブイヨンを抽出用緩衝液８ｍＬによって抽出した後に試験され且つＨＰＬ
Ｃによって分析された。 突然変異体を抽出するのに用いられる抽出用緩衝液は、ＨＰＬＣ分析において用いられる「移動相」と同一である。 試料は、ＨＰＬＣ（イナートシルＣ−８カラム、Ｓｕ，２５０ｘ４．６ｍｍ（メタケム・テクノロジーズ、トランス、ＣＡ）、３０℃、流速０．６ｍｌ／分、ＵＶによって２８０ｎｍで検出される、移動相Ｈ 2 Ｏ：アセトニトリル：ＴＨＦ：：６０：
２８：１２、０．０５％トリフルオロ酢酸）による検定のために溶媒混合物（３．５：６．５のメタノール：
０．１Ｍ ＫＨ 2 ＰＯ 4緩衝液、ｐＨ３．５）中に抽出された。 レプロマイシンはＵＶ maxが２８８であり、典型的に、ロサマイシンより５０％大きい溶離時間を要する。 したがって、レプロマイシンは、この実施例の生成物試料およびレプロマイシンを一緒に同時試験することによってロサマイシンと区別することができる。 ロサマイシンのＵＶ maxは２４２ｎｍである。 ミクロモノスポラ・ロサリアのｒｏｓＸ突然変異体は、そのレプロマイシン生産およびロサマイシンが全く存在しないことに基いて検出され且つ単離された。 ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:29） (72)発明者 エドマンド・ダブリュー・ハフナー アメリカ合衆国コネチカット州06333，イ ースト・ライム，フェロ・コート 12 (72)発明者 ハミッシュ・エイ・アイ・マッカーサー アメリカ合衆国コネチカット州06335，ゲ ールズ・フェリー，フェズント・ラン・ド ライブ 19 |
