化合物ECO-04601(以下简称ECO-4601)是一种新型法尼基化二 苯并二氮杂酮，即10-法尼基-4，6，8-三羟基-二苯并二氮杂-11-酮， 其具有如下式1所示的结构。

式1
ECO-4601已经从放线菌(actinomycete)小单孢菌属 (Micromonospora sp.)的新菌株的发酵培养物中分离，如2004年1 月21日提交的美国专利申请第10/762,107号中所公开的(2005年2 月24日作为US 2005-0043297公布，2006年9月5日作为美国专利第 7,101,872号公告)，也如2004年8月5日PCT国际申请WO2004/065591 中所公布的。ECO-4601的结构随后由查兰(Charan)等人(2004)，J.Nat. Prod.，vol.67，p.1431-1433所公开，该化合物已经从小单孢菌株DPJ12 的发酵液收集的固体中提取，所述小单孢菌株DPJ12从日本狮子岛 (Shishijima Island)的海洋海鞘戴得姆普科特(Didemnum proliferum Kott.)中分离。查兰等人称这些分离的法尼基化二苯并二氮杂酮为 “戴兹平诺米辛(diazepinomicin)”。化合物ECO-4601随后由岚结花 (Igarashi)等人(2005)，J.Antibiot.，vol.58，p.350-352所公开，该 组通过提取放线菌小单孢菌属TP-A086培养物的发酵液来分离所述化 合物，所述小单孢菌属TP-A086从日本大沢野(Osawano)收集的固 体样品中分离。已经显示ECO-4601拥有抗菌和抗癌活性，且从动物模 型研究结果表明了ECO-4601的体内抗癌性能(参见2004年9月27 日提交的美国专利申请第10/951,436号(2005年5月19日作为US 2005-010736 A1公布，2007年3月6日作为美国专利第7,186,713号公 告)，以及2005年5月16日提交的美国专利申请第11/130,295号(2006 年4月13日作为US 2006-0079508 A1公布))。
已经公开了经由发酵方法可生产限量的ECO-4601。美国专利申请 第11/130,295号公开了ECO-4601能够通过如下方法来生产：给培养基 接种能够生产ECO-4601的微生物样品，例如小单孢菌株046-ECO11 或菌株[S01]046；然后在水浴或发酵罐中通过搅拌(如振荡)通风，或 者通过向培养基中注射空气、氧气或合适的气体混合物给所述已接种 的培养物接种。接种能够在约18至400℃和pH值约6至9条件下合 适的培养基中持续大约3至4天，所述培养基包含可同化的碳、氮、 任意无机盐和其它已知生长因子源。完成培养后，能够通过如离心、 吸附、层析和过滤等本领域已知技术来分离ECO-4601。有机溶剂例如 乙酸乙酯、正丁醇、乙酸正丁酯或4-甲基-2-戊酮等可以与所培养的培 养基混合，离心分离有机层，接着通过蒸发干燥或通过真空蒸发干燥 除去溶剂，生成含残余物的ECO-4601。通过以下方法能够进行下游纯 化：选择地重组所述残余物和乙醇、乙酸乙酯、甲醇或它们的混合物； 使用合适的有机溶剂例如己烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇和四氯化碳、 二氯甲烷或它们的混合物在二相体系中二次提取；接着采用本领域中 已知技术如层析进一步纯化。
用于生产本发明的限量法尼基化二苯并二氮杂酮的发酵方法已 经在本领域中描述。例如，岚结花等人(见前)描述了一种方法，其 中，使用正丁醇提取5升发酵液，真空浓缩有机层生成17克油性提取 物。层析纯化所述提取物(先硅胶后LH-20)生成16毫克淡黄色针状 物。在查兰等人(见前)的文章中描述了一种方法，其中离心4升小 单孢菌DPJ12发酵液，用水洗涤所生成的细胞群和HP20树脂(50g/L 发酵液)并用甲醇(3×250mL)提取。在真空中浓缩合并的甲醇提取 物并用乙酸乙酯(4×60mL)提取以生成278毫克的提取物。进一步 纯化(先葡萄糖凝胶LH-20柱后反相HPLC)产生4.8毫克戴兹平诺米 辛产物。
由于ECO-4601向商业药物产品的发展，将要求所述化合物的发酵 生产在一定规模以便产生所述化合物的数量足以满足用于临床试验测 试方案，以及其后用于制剂和剂量(其将开给需要治疗的病人)的后 续商业制备的要求。同样，对于与小单孢菌属(其用于生产对临床测 试和药物产品的商业生产有用数量的ECO-4601)的发酵有关的稳健的 和商业实用的发酵方法有需求。有利的是，所述发酵方法应当在从实 验室水平到各种水平的商业生产方面提供了若干好处，尽管同时不要 求增加发酵容器的数目或其他种类的设备和/或参与下游处理和纯化步 骤的步骤也不要求超出与增加的发酵体积直接成比例的增加体积的提 取溶剂。也存在用于ECO-4601的生产(其从发酵液提供高产率的化合 物)的发酵方法的需求，其允许所述化合物从所述发酵液中高效提取， 并且以一定形式，优选地为浓缩形式(其是稳定的，方便运输的)提 供，且其随后易受用于ECO-4601晶型生产的下游处理的影响，所述 ECO-4601晶型随后可被制为药物可接受的组合物，供需要这种组合物 的病人使用。
发明概述
本发明提供用于回收和浓缩结构式1的法尼基化二苯并二氮杂 酮的方法，

式1
包括以下步骤：a)在水培养基中发酵能够产生所述法尼基化二苯 并二氮杂酮的微生物菌株，从而产生包含所述结构式1的法尼基化二 苯并二氮杂酮的发酵液；b)通过酸化调节所述发酵液允许所述法尼 基化二苯并二氮杂酮与存在于所述发酵液中的颗粒物相缔合 (associate)；c)从所述发酵液中收获所述颗粒物以获得收获颗粒物； d)以体积是所述收获颗粒物的体积大约2∶1至大约5∶1的比例的合 适的有机溶剂提取所述收获颗粒物，从而形成提取物；以及e)处理所 述提取物以形成包含所述法尼基化二苯并二氮杂酮第一浓缩物，其中 所述第一浓缩物包含所述法尼基化二苯并二氮杂酮，所述法尼基化二 苯并二氮杂酮的浓度比所述a)发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂 酮高大约50倍，并且其中所述法尼基化二苯并二氮杂酮从所述a) 的发酵液中回收，其数量至少大约是所述发酵液中所述法尼基化二苯 并二氮杂酮数量的50％。另一方面，本发明的方法进一步包括处理 所述第一浓缩物以便降低所述第一浓缩物中的杂质的水平，从而产生 第二浓缩物。根据本发明的一方面，第二浓缩物中除了式1的法尼基 化二苯并二氮杂酮外实际上没有分子。根据本发明的另一方面，本发 明的方法还进一步包括从所述第二浓缩物中结晶式1的法尼基化二苯 并二氮杂酮的步骤，从而产生适合用于制备药物制剂的式1的结晶法 尼基化二苯并二氮杂酮。
根据本发明的另一方面，所述法尼基化二苯并二氮杂酮从所述 a)的发酵液中回收，其数量至少大约为所述发酵液中所述法尼基化二 苯并二氮杂酮数量的60％，另一方面，所述法尼基化二苯并二氮杂 酮从所述a)的发酵液中回收，其数量至少大约为所述发酵液中所述法 尼基化二苯并二氮杂酮数量的65％。
根据本发明的方法的另一方面，所述颗粒物包含存在于发酵液中 的发酵微生物。根据本发明的方法的另一方面，所述颗粒物进一步包 含吸附树脂(absorbent resin)。根据本发明方法的另一方面，所述发酵 液被调节至pH值为大约2至大约4，且根据本发明方法的另一方面， 所述发酵液进一步被调节至大约2℃至大约4℃的温度范围，而根据本 发明的另一方面，所述发酵液在所述温度范围内维持大约16小时至大 约72小时。根据本发明方法的另一方面，所述发酵在大约48小时至 110小时内完成。
根据本发明方法的另一方面，微生物是细菌，更进一步，所述细 菌是放线菌，且更进一步所述放线菌是小单孢菌(Micromonospora)、 链霉菌(Streptomyces)或红球菌(Rhodococcus)属，且更进一步，所 述放线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有 IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。
根据本发明方法的另一方面，所述合适的有机溶剂包括至少一种 低级烷基醇，另一方面所述低级烷基醇是甲醇、或乙醇、或丙醇、或 异丙醇或丁醇或这些低级烷基醇中两种的混合物。另一方面，所述合 适的有机溶剂为乙酸乙酯或乙腈。
根据本发明方法的另一方面，微生物菌株在其中发酵的水培养基 是AP、CA、DZ、GP、HI、JA、MI、PI、QI、QP或YB，另一方面， 所述水培养基是QB、MA、KH、RM、JA、FA或HI。
根据本发明方法的另一方面，从所述发酵液中收获颗粒物使用超 滤系统来进行，另一方面，所述超滤系统具有一个或多个过滤元件， 所述过滤器元件具有孔径尺寸大约0.2至大约0.45微米。根据本发明 方法的另一方面，从所述发酵液中收获颗粒物通过离心来进行。
根据本发明的另一方面，收获颗粒物的提取包括一至三轮使用合 适的有机溶剂的提取，另一方面，提取进一步包括在温度大约39℃至 大约45℃，以流速(flow rate)大约30Hz至大约50Hz，循环体系中 所述颗粒物和合适的有机溶剂，且更进一步，循环大约50分钟至120 分钟。另一方面，提取包括使所述颗粒物与合适的有机溶剂一起离心 处理。根据本发明方法的另一方面，用于提取的合适的有机溶剂的体 积按与收获颗粒物质量成比例(体积∶质量)或按与收获的颗粒物体 积成比例(体积∶体积)来计算。
根据本发明方法的另一方面，提取、收获的颗粒物的处理是蒸发 处理，另一方面，蒸发处理在减压下进行，另一方面，当以吸附树脂 (例如，HP20树脂)培养提取物时进行蒸发，其中蒸发处理在减压下 进行。
根据本发明方法的另一方面，提取、收获的颗粒物的处理包括以 吸附树脂培养提取物以形成混合物，接着通过向混合物中添加水而将 式1的法尼基化二苯并二氮杂酮置换(displace)至树脂上。另一方 面，与所述提取物混合的所述吸附树脂以比率(W/W)是所述提取物 中所述式1的法尼基化二苯并二氮杂酮的大约10倍至大约40倍来提 供。根据本发明方法的另一方面，所述水以体积比(V/V)是混合物体 积的大约0.5％至大约20％添加到所述混合物中，另一方面，体积流速 (volume flow rate)是所述混合物体积的大约0.5％至大约5％。另一 方面，所述添加到混合物中的总体积为是混合物体积的大约1.0至大约 1.5倍。另一方面，所述添加到所述混合物中水的总体积是所述混合物 的体积的大约1.2至大约1.5倍。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了包含结构式1的法尼 基化二苯并二氮杂酮的浓缩物，

式1
其中，所述浓缩物根据本发明的方法而获得。
另一方面，本发明提供的浓缩物包含式1的法尼基化二苯并二氮 杂酮，其中所述式1的法尼基化二苯并二氮杂酮从所述a)的发酵 液中回收，其量是所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂酮的量的 至少大约60％，另一方面，所述法尼基化二苯并二氮杂酮从所述a) 的发酵液中回收，其量是所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂酮 的量的至少大约65％。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了能够在发酵期间在水 培养基体积中生产结构式1的法尼基化二苯并二氮杂酮的微生物，

式1
其中在所述发酵期间平均产率是大约0.073mg/L/h至大约5.065.06 mg/L/h。根据本发明的另一方面，当在发酵期间平均时，微生物的产 率大约为2.15至5.06mg/L/h，根据本发明的另一方面，当在发酵期间 平均时，所述微生物的产率是大约3.00mg/L/h至大约5.06mg/L/h。另 一方面，所述微生物是细菌，更具体地，所述细菌是放线菌，更具体 地，所述放线菌是小单孢菌、链霉菌或红球菌属；更具体地，所述放 线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有 IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。
在另一实施方式中，本发明提供放线菌属，即具有IDAC保藏号 070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。
在另一实施方式中，本发明提供各种用于培养细菌的培养基组合 物和用于培养细菌的方法，其中，根据本发明的另一方面，例如，这 样的培养基和方法可用于在水环境下生长细菌从而产生发酵液培养 物。一方面，所述培养基组合物包含10g/L葡萄糖、20g/L可溶性淀 粉、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨(Bacto-peptone)和2g/L CaCO3。 另一方面，所述培养基组合物包含10g/L葡萄糖、40g/L马铃薯糊精、 5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨和2g/L CaCO3。另一方面，所述 培养基组合物包含10g/L葡萄糖、25g/L可溶性淀粉、5g/L酵母提取 物、5g/L细菌蛋白胨和3g/L CaCO3。另一方面，所述培养基包括12g/L 葡萄糖、10g/L马铃薯糊精、5g/L玉米浆(corn steep liquor)、10g/L 药用培养基(Pharmamedia)和4g/L Proflo(美国的一种食用商品名， Trader Oil Mil.Co.出品)油。另一方面，所述培养基包含20g/L马铃 薯糊精、8.34g/L酵母提取物、30g/L甘油、2.5g/L细菌蛋白胨和3g/L CaCO3。
附图简述
图1至4表示参与ECO-04601生物合成路径的不同步骤。图1至 4分别表示三种生物合成基因座A、B和C，其中ORF由箭头表示。 加深表示的(highlighted)ORF参与示意图中所述的步骤。参与示意图 中所描述的步骤的生物合成酶由它们的家族名称和每个基因座A、B 和C中的各自的ORF号(例如，8/7/7)来显示。
图1表示用于生产提供ECO-04601的法尼基基团的法尼基焦磷酸 的生物合成路径的示意图。
图2表示用于生产二苯并二氮杂酮基团的3-羟基邻氨基苯甲酸- 腺苷酸(3-hydroxy-anthranilate-adenylate)前体的生物合成路径的示意 图。
图3表示用于生产核心二苯并二氮杂酮的2-氨基-6羟基-[1，4]苯 醌前体的生物合成路线的示意图。
图4表示ECO-04601前体、法尼基焦磷酸、3-羟基邻氨基苯甲酸- 腺苷酸和2-氨基-6羟基-[1，4]苯醌组合的生物合成路径的示意图。
图5是描述参与制备用于中试发酵生产的主种子(seed)储备物和 工作种子储备物的程序的多个步骤的流程图。
图6是描述参与种子摇瓶发酵、用于与中试发酵一起使用的接种 体发酵和中试发酵的准备生产的程序的多个步骤的流程图。
图7是描述在收获之前调节发酵液、收获颗粒物、提取收获颗粒 物和处理提取物以便形成浓缩物的多个步骤的流程图。
图8是描述参与将ECO-4601从混合提取物置换至树脂程序的多个 步骤的流程图。
发明详述
本发明提供一种用于法尼基化二苯并二氮杂酮的发酵生产的可 计量(scalable)方法。
1、定义。
除非另外指出，本文所使用的技术和科学术语具有如本发明所属 技术领域的技术人员普遍理解的含义。
为了方便，下面提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中所 用的某些术语和短语的含义。
本文所用的术语“法尼基化二苯并二氮杂酮”是指一类包含法尼 基部分的二苯并二氮杂酮化合物。该术语包括，但不限于，本发明所 列举的化合物10-法尼基-4，6，8-三羟基-二苯并二氮杂-11-酮，其在本 文中表示为“ECO-04601”。本文所用的术语“法尼基化二苯并二氮杂 酮”包括这类在化学合成中能够用作中间体的化合物。
本文所用的术语“浓缩物”表示液体、半固体或部分包含大量法 尼基化二苯并二氮杂酮，即ECO-4601的固体。如果以半固体或固体 的形式，所述浓缩物可基本上不含水和/或基本上不含任何用以生产浓 缩物的溶剂。应该理解无论是半固体还是固体，所述浓缩物可以采取 高粘液状的形式。以固体形式存在的浓缩物基本上不含任何可被提供 与吸附树脂相混合的溶剂。
本文所用的术语“第一浓缩物”是指部分包含式1的法尼基化二 苯并二氮杂酮，即ECO-4601的浓缩物，其中所述第一浓缩物通过处 理包含式1的法尼基化二苯并二氮杂酮的发酵液的提取物而形成。随 后，可以使所述第一浓缩物或这些第一浓缩物的混合经过处理，以降 低存在于第一浓缩物中杂质的水平，例如，在包含至少一轮纯化的柱 纯化程序中处理，从而使得包含式1的法尼基化二苯并二氮杂酮的第 二浓缩物形成。第二浓缩物除式1的法尼基化二苯并二氮杂酮之外， 基本上不含其它分子。随后，可使第二浓缩物结晶处理，以产生适合 用于制备药物制剂的结晶ECO-4601。
本文所用的术语“比率(W/W)”表示彼此成相对比例的两个质量 的比。优选地，该术语表示相对于存在于发酵液中ECO-4601的质量而 言，存在于浓缩物中法尼基化二苯并二氮杂酮，即ECO-4601的质量。 此外，术语“比率(W/W)”包括，并且可以与相对于彼此根据两个质 量百分数表示的比率的表达式互换，例如，通过存在于浓缩物中 ECO-4601的质量的表达式作为存在于发酵液或混合发酵液中 ECO-4601的质量分数。所述发酵液可以为单一发酵液，或可以为两种 或多种分离的发酵液(其在提取之前已经被组合)的组合。应当理解 相对于存在于发酵液中ECO-4601的质量，在描述存在于浓缩物中 ECO-4601的含量时，将使用当量质量单位，例如，微克(μg)对微克 (μg)、毫克(mg)对毫克(mg)、克(g)对克(g)、或千克(kg) 对千克(kg)。这样，应当理解，用于表达比率(W/W)的质量单位不 受单位具体量级或大小的限制(例如仅为kg)，且当表示浓缩物中 ECO-4601的重量(第二质量)相对发酵液中ECO-4601重量(第一质 量)的比率W/W时，应当理解包括所有的单位。
本文所用的“菌株”含义是具有给定类型微生物(例如细菌)，或 特定种类、种属和血型的普遍特征的一个细胞或多个细胞。如果所述 菌株包括多个细胞，本领域技术人员将承认所述细胞将来自单一微生 物或纯培养分离物。
本文所用的术语“能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮的微生物” 是指携带了产生法尼基二苯并二氮杂酮化合物必需的基因信息的微 生物，不管所述微生物是否自然产生所述化合物。该术语同样适用于 当微生物存在于其自然环境时，其中产生法尼基二苯并二氮杂酮化合 物的基因信息在微生物中被发现的那些微生物中，以及其中基因信息 由重组技术引入的那些微生物中。本文预期的具体微生物包括，但不 局限于，小单孢菌科(Micromonosporaceae)，其中优选的菌属包括小 单孢菌、游动放线菌(Actinoplanes)和指孢囊菌(Dactylosporangium)； 链霉菌科(Streptomycetaceae)，其中优选的菌属包括链霉菌和北里孢 菌(Kitasatospora)；假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)，其中优选 的菌属包括拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)和糖多孢菌 (Saccharopolyspora)；束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)，其中优 选的菌属包括糖丝菌(Saccharothrix)和束丝放线菌(Actinosynnema)； 以及红球菌种属类；然而所述术语意图囊括所有包含产生法尼基二苯 并二氮杂酮化合物必需的基因信息的微生物。优选的法尼基二苯并二 氮杂酮化合物的制造者包括小单孢菌属菌株[S01U02]046，其于2005 年9月7日，在加拿大R3E 3R2，马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街 1015的加拿大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构作了保藏，保藏号 为IDAC 070905-01。
本文所用的“水培养基”含义是包含一种或多种可同化的碳、氮 和无机盐源的培养基，且其能够支持能够合成ECO-4601的微生物的生 长。
本文所用的术语“调节”表示变化，所述变化在完成发酵培养期 间，在一个或多个物理或化学条件或包含法尼基二苯并二氮杂酮发酵 液的条件中诱导。所述发酵液的化学条件的调节包括，但不限于，诱 导所述发酵液酸化。所述发酵液的物理调节包括，但不限于，降低所 述发酵液的温度。可以使用本领域熟知的技术或试剂完成具体调节， 例如，用来降低所述发酵液温度的不同机械手段。所述术语同样适用 于由一系列与单一调节相对的分级或分步调节产生的一种或多种条件 的调节。另外，所述术语应当理解包括一个以上条件的同时调节，不 论各条件是否由一系列与单一调节相对的分级或分步调节产生。
本文所用的术语“颗粒物”表示一种或多种类型的微颗粒物，其 存在于包含法尼基化二苯并二氮杂酮的发酵液中。所述术语包括，但 不限于，能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮的微生物，其将缺省地(by default)存在于发酵液中。应当理解所述术语同样适用于能够至少结合 法尼基化二苯并二氮杂酮的吸附树脂。所述吸附树脂在开始发酵过程 时可存在于发酵液中，或者可在规定时间期满时或发酵液达到预定条 件例如，具体密度或时期时加入发酵液中。许多种类的吸附树脂为本 领域所熟知，并可用于本发明。这样的树脂包括，但不限于，XAD 2、 XAD 4、XAD 7、XAD 8和XAD 16(罗姆(Rohm)和哈斯(Haas))； HP20、HP20S、HP20SS和SP70和反相硅胶如C-8、C-10 和C-18。
本文所用的术语“相缔合”表示化学或物理作用，该作用可以发 生在法尼基化二苯并二氮杂酮的分子与存在于发酵液中颗粒物的一 个或多个表面之间，这样使得法尼基化二苯并二氮杂酮通过颗粒物而 保持或基本保持。所述术语包括，但不限于，弱的相互作用，其可以 发生在法尼基化二苯并二氮杂酮分子与存在于发酵液中颗粒物的一 个或多个表面之间，例如，氢键、静电吸引、范德华力、疏水力或分 配。举例来说，所述术语应当理解包括通过合成吸附树脂(例如 HP20树脂)吸附法尼基化二苯并二氮杂酮。
本文所用的术语“合适的有机溶剂”表示法尼基化二苯并二氮杂 酮，即ECO-4601在其中易溶的有机溶剂。对于易溶，其含义是所述溶 剂将以足够的浓度溶解大多数ECO-4601，要求提取浆液(由本发明包 含ECO-4601的发酵液提供)的溶剂体积将在所述浆液体积的大约2 至大约5倍范围内。应当理解所述术语同样适用于法尼基化二苯并二 氮杂酮，即ECO-4601在其中易溶的有机溶剂的混合物。用于从浆液 提取法尼基化二苯并二氮杂酮的具体合适的有机溶剂或合适的有机 溶剂的混合物的选择可依赖与溶剂中法尼基化二苯并二氮杂酮的溶 解度相关的各种因素。这样的因素可包含，但不限于，溶剂成本、实 用性、加工容易性、环境效应、危险潜力(例如，爆炸性)和可处理 性。本领域所属技术人员将理解可以选择许多不同的合适的有机溶剂。 优选地，所述合适的有机溶剂可以是1碳至4碳溶剂或芳香族溶剂。 更优选地，所述合适的有机溶剂或合适有机溶剂的混合物可选自如下 一种或多种溶剂类或具体溶剂：低级烷基醇(例如，甲醇、乙醇、丙 醇、正丁醇、异丁醇、丙二醇)；乙腈；甲苯；含氧有机溶剂如二烷基 酮(例如丙酮、2-丁酮)、四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙酸烷基酯(例 如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；和二烷基醚(例如二异丙基醚、 叔丁基甲基醚)。
本文所用的术语“按比例合适的有机溶剂的体积”表示当测量相 对于所述溶剂混合的溶解物的质量或体积时的溶剂的体积数。应当理 解为了本发明，当相对于从发酵液收获的颗粒物的体积或质量来描述 合适的有机溶剂的体积时，将使用当量体积单位。例如，对于1L体积 的颗粒物，将使用3L体积的合适的有机溶剂，如果从发酵液收获100 克质量的颗粒物，将使用300mL体积的合适的有机溶剂。本领域所属 技术人员将理解，所述收获的颗粒物可使用相等或不等体积的合适的 有机溶剂、溶剂或它们的混合物、预提取进行两或三轮提取。此外， 本领域所属技术人员应当理解倘若法尼基化二苯并二氮杂酮，即 ECO-4601溶于混合物，则合适的有机溶剂可以是两种或多种有机溶剂 的混合物。
本文所用的术语“处理”表示使本发明的提取物经过物理或化学 处理或它们的组合。所述物理或化学处理或它们的组合可以物理或化 学方法的形式发生，其可应用于提取物，其中所述方法部分要求以一 种或多种具体物质培养提取物。所述物理或化学处理或它们的组合应 当足以实现从所述提取物中除去或基本除去合适的有机溶剂、溶剂或 它们的混合物。所述术语包括，但不限于，蒸发过程，优选地当所述 蒸发过程在减压下进行时，更优选地当所述蒸发过程结合提取物的升 温操作时。此外，所述术语包括向提取物中添加吸附树脂，不管这种 添加是选择的或与提取物蒸发过程相结合。此外，所述术语包括微过 滤以除去大量溶剂，接着蒸发来干燥。此外，所述术语包括离心以从 发酵液分离如菌丝体，以及在所述溶剂存在下从菌丝体中协助提取法 尼基化二苯并二氮杂酮。
本文所用的术语“置换”含义是从一种环境或条件向另一种环境、 条件或状态移动或转换对象或分子(例如法尼基化二苯并二氮杂酮)， 其可以包括某一分子的物理或化学状态的变化，例如通过进行一步或 多步，不论这样的步骤是机械还是化学步骤，从而导致这样的分子从 溶液或浆液中移除。从溶液中除去这样的分子可以通过例如将这样的 分子从溶液或浆液置换至吸附树脂上来实现。
本文所用的术语“基本上不含其它分子”含义是包含式1的法尼 基化二苯并二氮杂酮的浓缩物或化合物或混合物，以重量计，其是 100％纯式1的法尼基化二苯并二氮杂酮的至少60％、至少70％、至 少大约80％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少 大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大 约97％、至少大约98％、至少大约99％。
2、通过发酵生产法尼基化二苯并二氮杂酮
A微生物、基因和重组微生物
i)微生物
本发明的法尼基化二苯并二氮杂酮可通过各种微生物生物合成。 可以合成本发明的化合物的微生物包括，但不限于，放线菌目细菌， 也称为放线菌。属于放线菌的非限定性实施例包括诺卡氏菌属 (Nocardia)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)、游动放线菌属 (Actinoplanes)、小单孢菌、嗜盐碱放线菌(Nocardioides)、糖丝菌 (Saccharothrix)、拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)、库特那尼亚 (Kutzneria)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌 (Saccharopolyspora)、北里孢菌(Kitasatospora)、链霉菌、小双孢菌 (Microbispora)、链孢囊菌(Streptosporangium)和马杜拉放线菌 (Actinomadura)。放线菌的分类是复杂的，参考古德菲勒(Goodfellow) Suprageneric Classification of Actinomycetes(1989)；Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.4(威廉斯(Williams)和威尔金斯 (Wilkins)，巴尔的摩(Baltimore)，pp.2322-2339)；以及爱伯利 (Embley)和斯戴克勃兰特(Stackebrandt)，“The molecular phylogeny and systematics of the actinomycetes，”Annu.Rev.Microbiol.(1994)48： 257-289，各文献在此整体引入作为参考，用作可以合成本发明的化合 物的菌属。
优选地，根据本发明的方法用于ECO-4601发酵生产的微生物将具 有对于所述微生物固有的基因信息，该信息对于允许所述微生物生物 合成所述化合物是必需的。优选地，所述微生物是小单孢菌属，更优 选地是小单孢菌属046-ECO11，其于2003年3月7日，在加拿大R3E 3R2，马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015的加拿大卫生局微生物 署加拿大国际保藏机构(the International Depository Authority of Canada (IDAC)，Bureau of Microbiology，Health Canada，1015 Arlington Street， Winnipeg，Manitoba，Canada R3E 3R2)作了保藏，保藏号为IDAC 070303-01；更优选地是小单孢菌属[S01]046，其于2003年12月23日， 在加拿大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构(加拿大R3E 3R2，马 尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015)(the International Depository Authority of Canada (IDAC)，Bureau of Microbiology，Health Canada)作 了保藏，保藏号为IDAC 231203-01；更优选地是小单孢菌菌株，其因 其大量生产ECO-4601的能力而被选择；最优选地是小单孢菌菌株 [S01U02]046，其于2005年9月7日，在加拿大卫生局微生物署加拿 大国际保藏机构(加拿大R3E 3R2，马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿 街1015)(the International Depository Authority of Canada(IDAC)， Bureau of Microbiology，Health Canada，1015 Arlington Street，Winnipeg， Manitoba，Canada R3E 3R2)作了保藏，保藏号为IDAC 070905-01，以 及棘孢小单孢菌查利斯(Micromonospora echinospora challisensis) NRRL 12255和制癌菌素链霉菌新抗霉菌素(Streptomyces carzinostaticus neocarzinostaticus)ATCC 15944。
已经根据“国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约” 对保藏菌株进行了保藏。当专利公布时所述保藏菌株将对公众不能取 消且没有限制或条件。所述保藏菌株仅作为方便提供给本领域技术人 员，并不承认保藏对于授权是必需的，例如35 U.S.C.§112所要求的。 制备、使用或销售所述保藏菌株以及由此获得的化合物要求许可，且 没有据此授予这样的许可。
根据指定的发酵条件生产能够生物合成较高水平的具体生物活性 化合物的微生物菌株的方法是本领域熟知的，例如，拥有抗菌活性或 抗癌活性的化合物。这样的方法可依赖由于自然发生的突变或由于使 用诱变剂诱导的突变产生的突变菌株的选择。合适的诱变剂的实例包 括，但不限于，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸、 紫外辐射、X-射线和伽马辐射、UV和补骨脂素的结合、以及转座子诱 变。使用这样的诱变剂处理放线菌的方案和参数是本领域所熟知的， 能够通过参考以下文献来找到：Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，2nd edition(1999)，(由德曼A.L.(Demain A.L.)和戴 维斯J.E.(Davies J.E.)编著)(American Society of Microbiology， Washington，D.C.)第353-361页和第717-724页。对于能够大量产生 感兴趣的生物活性化合物的突变放线菌菌株的产生和选择，其中导致 显型大量产生的突变事件作为自然发生事件而发生，可以参考希玛 (Shima)等人(1996)“Induction of Actinorhodin Production by rpsL (Encoding Ribosomal Protein S12)Mutations That confer Streptomycin Resistance in Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor A3(2)” Journal of Bacteriology，volume 178，p.7276-7284，该文献描述了获取 变铅青链霉菌(S.lividans)和天蓝色链霉菌(S.coelicolor)菌株的方 法，所述菌株通过筛选产生供自然发生的突变(其对抗生素链霉菌显 示自动抑阻)的高水平抗菌化合物放线紫红素(actinorhodin)。随后通 过欧次(Ochi)等人的研究组(参见赫斯克斯A.(Hesketh，A.)和欧 次K.(Ochi，K.)(1997)“A Novel Method for Improving Streptomyces coelicolor A3(2)for Production of Actinorhodin by Introduction of rpsL (Encoding Ribosomal Protein S12)Mutations conferring Resistance to Streptomycin”，J.Antibiotics，volume 50，p.532-535)所公开的某个转 录相关联的突变的出现(核糖体蛋白S12中88位点赖氨酸残基的改变， 其能够通过筛选被选择为链霉菌菌株来抑阻链霉素)和所选择的生物 合成较大量放线紫红素的菌株的能力之间的似乎可信的关联来进行工 作。也可以使用方法的组合来产生能够产生高水平感兴趣的生物活性 化合物的放线菌菌株。在一个实施方式中，本发明的能够在发酵培养 基中产生高水平化合物ECO-4601的小单孢菌通过将亲代小单孢菌菌 株暴露于抗生素链霉菌的浓缩物中来产生，其中所用的浓度的范围大 于最小抑制浓度。链霉素的最小抑制浓度范围的实例为大约0.5μg/mL 至大约1.0mg/mL。优选地，用于选作对抗生素自然发生抑阻的链霉素 的浓度范围是大约10mg/ml至大约100mg/ml。更优选地，抗生素的 浓度是达到至少95％的杀伤率的浓度，最优选地，抗生素的浓度是达 到至少99％的杀伤率的浓度。使暴露于一定水平的链霉菌保持存活的 细菌菌落进一步突变处理，例如暴露于紫外线，所述一定水平的链霉 菌提供至少95％的杀伤率，更优选地提供至少99％的杀伤率。适用于 放线菌中诱导突变的紫外辐射的水平是本领域所熟知的。(参见上述， Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology)，在本发明的一个 实施方式中，因其对高浓度链霉菌抑阻的能力所选择的小单孢菌菌株 的处理包括暴露于暴露水平大约40Joles/m2至大约45Joles/m2的紫外 辐射中。在本发明的一个实施方式中，当与从中获得5倍水平的生产 菌株的未经紫外辐射的菌株相比时，这样紫外辐射突变处理导致能够 增加至少5倍范围ECO-4601发酵产品的小单孢菌菌株。
ii)重组微生物
在另一个实施方式中，能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮 ECO-4601的微生物可通过重组核酸分子来提供，所述核酸分子编码在 生产法尼基化二苯并二氮杂酮中有用的蛋白。具体来说，能够产生法 尼基化二苯并二氮杂酮ECO-4601的微生物可通过提供重组DNA载 体和编码菌株046-ECO11(其引导ECO-04601产生，在本文称为 “046D”)中全部或部分生物合成基因座的核酸分子来提供。大肠杆菌 (E.coli)DH10B载体的保藏，分别包含来自小单孢菌属菌株 046-ECO11用于法尼基化二苯并二氮杂酮的部分生物合成基因座的 柯斯质粒克隆(分别代表046KM和046KQ)和共同跨越用于ECO-04601 生产的全部生物合成基因座，其已经在2003年2月25日保藏于加拿 大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构(加拿大R3E 3R2，马尼托巴 湖，温尼伯湖，阿林顿街1015)。指定为046KM的柯斯质粒克隆被分 派保藏号IDAC 250203-06，指定为046KQ的柯斯质粒克隆被分派保藏 号IDAC 250203-07。
包含柯斯质粒克隆的所包藏的柯斯质粒克隆已经根据“国际承认 用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约”作了保藏。当专利公布时 所述保藏克隆将对公众不能取消且没有限制或条件。所述保藏克隆仅 作为方便提供给本领域技术人员，并不承认保藏对于授权是必需的， 例如35 U.S.C.§112所要求的。制备、使用或销售所述保藏菌株以及由 此获得的化合物要求许可，且没有据此授予这样的许可。
此外，本发明可使用常规基因重组技术例如核酸的突变、灭活、 置换通过进一步包括046D的一种或多种基因修饰以产生ECO-04601 的化学变体来提供。
法尼基二苯并二氮杂酮化合物可通过如下方法来提供：其中转化 的宿主细胞包括编码ECO-4601的生物合成所必需的一个或多个多肽 的重组DNA载体，并且在使法尼基二苯并二氮杂酮化合物产生的条 件下培养宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是原核生物。在另 一个实施方式中，宿主细胞是放线菌。在另一实施方式中，宿主细胞 是链霉素宿主细胞。在又一实施方式中，宿主细胞是非链霉菌放线菌， 例如，红球菌属、分枝杆菌属(Mycobaterium)、拟无枝菌酸菌属 (Amycolatopsis)，或非放线菌细菌如短杆菌(Brevibacterium)或黏液 球菌(Myxococcus)属如黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)(参见朱莉 B.(Julien B.)和莎哈S.(Shah S.)(2002)“Heterologous Expression of Epothilone Biosynthetic Genes in Myxococcus xanthus.”Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46：2772-2778)。
在又一实施方式中，本发明可结合重组核酸被利用，所述重组核 酸产生许多法尼基二苯并二氮杂酮化合物、或带有酰基而非法尼基部 分的二苯并二氮杂酮，其不能够单独通过化学方法容易地合成。根据 本发明，本发明允许经由参与法尼基二苯并二氮杂酮或其类似物生物 合成的霉基因工程直接操作046D生物合成基因座。
法尼基二苯并二氮杂酮和类似物能够通过以下方法产生：向包含 编码本发明的一种或多种多肽的重组DNA载体的宿主细胞输送一种或 多种关键中间体或生物合成前体或相近结构的类似物，以及在产生法 尼基二苯并二氮杂酮或类似物条件下培养宿主细胞(如图1至4所定 义的)。关键的中间体与本发明的分离蛋白直接接触以进行用于法尼基 二苯并二氮杂酮生产的必需步骤(例如，法尼基二磷酸和二苯并二氮 杂酮能够使用本发明的IPTN蛋白而耦合)
关键中间体可是商业可行的或可使用标准化学程序或使用本发明 的蛋白质来制备。例如，法尼基二磷酸和3-羟基邻氨基苯甲酸是商业 可行的。(例如，Fluka F6892和Aldrich 148776)。3-氨基-5羟基苯甲 酸，2-氨基-6-羟基苯醌的前体，如赫尔特(Herlt)等人(1981)，Aust.J. Chem.，volume 34，pages1319-1324中所述来制备。
iii)重组DNA载体
可以结合本发明使用的载体通常包括传递剂的DNA，外源DNA 插入其中。普通的将DNA的一个片段插入DNA的另一个片断的方法 涉及使用特定的称为限制性酶的酶，该酶在称为限制性位点的特定位 点(核苷的特定基团)剪切DNA。“盒”表示DNA编码序列或编码能 在指定的限制位点插入载体的表达产品的DNA片断。指定盒限制位点 以确保盒在合适的阅读框中插入所述盒。通常，编码在法尼基二苯并 二氮杂酮生产中有用的蛋白的核酸分子被插入一个或多个载体DNA 的限制位点，然后通过转染或转化由载体携带进入原核生物例如放线 菌(参见下文)。已经插入或添加DNA的DNA片断或序列，例如表达 载体，也能够称为“DNA结构”。常见的载体的类型是“质粒”，其通 常为双链DNA的自含分子，通常为细菌成因，能够易于接受另外的(外 源)DNA且其能够易于引入合适的宿主细胞。质粒载体通常包含编码 DNA和启动子DNA，其具有一个或多个适合插入外源DNA的限制位 点。合适的载体系统也可包含细菌人工染色体(BAC)例如在马丁尼 兹(Martinez)等人(2004)，Applied and Environmental Microbiology， volume 70，p.2452-2463中所述。编码DNA是编码特定蛋白或酶的特 定氨基酸序列的DNA序列。在一个本发明的实施方式中，所述编码 DNA编码对法尼基二苯并二氮杂酮的生物合成有用的多肽。
重组载体的启动子DNA是启动、调节或其他调节或控制编码DNA 表达的DNA序列。启动子DNA和编码可来自相同或不同的生物体。 重组克隆载体将通常包括一种或多种供克隆或表达的复制系统、一种 或多种供宿主内选择的标记物，例如抗生素耐药性、以及一种或多种 表达盒。载体结构可在本领域技术内使用传统分子生物学和重组DNA 技术来生产。这样的技术在文献中充分说明。参见，例如，Sambrook， Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， New York(此处“Sambrook等人，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II (D.N.Glover ed.1985)；F.M.Ausubel等人 (eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc. (1994)。
用在放线菌(例如链霉菌)中启动子的实例在美国专利第5,830,695 和5,466,590中教导。在放线菌表达载体中有用的转录启动子的实例为 tipA，其是抗生素硫链丝菌(thiostrepton)诱导的启动子。[c.f.Murakami， T.，等人，(1989)，J.Bacteriol，171，1459]。
iv)放线菌的转化
供放线菌使用的合适的转化方法包括使用溶解酵素使放线菌培养 基形成原生质球。然后例如通过使用汤普森(Thompson)或凯瑟(Keiser) [c.f.Thompson，C.J.，等人，(1982)，J.Bacteriol.，151，668-677或 Keiser，T.等人(2000)，″Practical Streptomyces Genetics″，The John Innes Foundation，Norwich]的方法添加包含重组DNA载体和聚乙二醇的缓 冲溶液以便将载体引入宿主细胞。在转化质粒中硫链丝菌素抗性基因 常常用作选择性标记物[c.f.Hopwood，D.A.，等人，(1987)，″Methods in Enzymology″153，116，Academic Press，New York]，但是本发明并 不限于此。放线菌转化的其他方法在美国5,393,665中所教导，也参见 Martinez等人(2004)(参见上文)，其教导了通过结合放线菌的转化。
链霉菌和非链霉菌放线菌的转化的方案是本领域所熟知的。[参见， 例如，Dijkhuizen，L.“Genetics of Non-Streptomyces Actinomycetes”in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，2edition，A.L. Demain and J.E.Davies(ed.)[1999，ASM Press，Washington，D.C.]第 368-378页；以及Nakashima N.等人(2005)“Actinomycetes as host cell factories for production of recombinant proteins”Microbial Cell Factories 4：7]。穿梭载体，其可用于克隆参与法尼基化二苯并二氮杂酮生物 合成路径的一个或多个基因至非链霉菌放线菌宿主。这样的穿梭载体 通过已知分子基因技术，通过从一个或多个非链霉菌，例如红球菌、 质粒DNA到大肠杆菌质粒或衍生质粒重组基因序列以产生质粒载体来 制备，所述质粒载体能够在大肠杆菌或红球菌(尽管携带了感兴趣的 插入的基因)中复制。这样的宿主可包括红球菌属，例如红平红球菌 (Rhodococcus erythropolis)、马红球菌(Rhodococcus equi)和圆红球 菌(Rhodococcus globerulus)。其他非链霉菌放线菌包括分支杆菌属(例 如，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis))，和拟无枝菌酸菌属(例 如，amycolatopsis lactamdurans(Nocardia)和amycolatopsis methanolica)，和棒杆菌属(Corynebacterium)，所述非链霉菌放线菌 可使用对细菌的特定基因具有特异性的穿梭载体转化并可用于参与法 尼基化二苯并二氮杂酮生物合成的一种或多种基因的异源表达。参与 小单孢菌属中第二代谢物生物合成的基因的异源表达已经成功完成。 例如，红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)(巨霉素非生产者) 使用小单孢菌巨霉素(Micromonospora megalomicea)基因转化，编码 用于生产麦戈赛明(megosamine)。通过所转化的宿主细胞经转化的红 色糖多孢菌的培养导致巨霉素的产生。(参见，Volchegursky Y.等人 (2000)“Biosynthesis of the anti-parasitic agent megalomicin： transformation of erythromycin to megalomicin in Saccharopolyspora erythaea”Molecular Microbiology 37：752-762)。
已经报道了供基因簇异源表达的放线菌的用途，所述基因簇编码 用作抗癌剂的微生物第二代谢物的生产。(参见Sánchez C.等人(2002) “The Biosynthetic Gene Cluster for the Antitumor Rebeccamycin： Characterization and Generation of Indolocarbazole Derivatives” Chemistry & Biology 9：519-531；以及Sánchez C.等人(2005) “Combinatorial biosynthesis of antitumor indolocarbazole compounds” Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)102(2)：461-466)。此外，用于克隆向放 线菌转化的DNA巨大片段(高达100千碱基)的细菌人工染色体是本 领域所熟知的(参见Sosio M.等人(2000)“Artificial chromosomes for antibiotic-producing actinomycetes”Nature Biotechnology 18：343-345)， 其可用来克隆全部基因簇，所述基因簇编码用于生产微生物第二代谢 物或它们的自然生物类似物。
v)法尼基二苯并二氮杂酮或生物合成中间体的检测
在法尼基二苯并二氮杂酮生物合成中有缺陷的放线菌可使用在 法尼基二苯并二氮杂酮生物合成路径中编码一种或多种蛋白的一种 或多种表达载体来转化，从而通过特定缺陷的遗传互补修复(以顺式 或以反式)法尼基二苯并二氮杂酮生物合成。
在重组放线菌中，生物合成路径(参见图1至4)中有或无法尼基 二苯并二氮杂酮或中间体能够使用本领域技术人员所熟知的方法来 测定。例如，可以产生用于重组放线菌培养基的发酵培养基的乙酸乙 酯提取物，如实施例1所述，并且得到的包含法尼基二苯并二氮杂酮 或中间体的级份可通过TLC在商业Kieselgel 60F254平板上检测。法尼 基二苯并二氮杂酮和中间体化合物通过在UV光下观测平板或通过 使用包含乙醇中香草醛(0.75％)和浓硝酸(1.5％，v/v)的喷雾剂喷 所述平板并且加热所述平板而观察到。然后使用液相色谱-质谱测定由 TLC分离的化合物的确切身份。质谱方法在公开的美国专利公开第 US2003/0052268号中教导。
vi)突变
在另一实施方式中，能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮或其类似 物的微生物(其可与本发明结合使用)可经由参与ECO-4601法尼基二 苯并二氮杂酮的生物合成的酶基因工程部分提供用于直接操作046D 生物合成基因座。
本领域所熟知的许多方法允许本发明中DNA序列随机和定位突变 (例如参见，奥苏伯尔(Ausubel)等人Short Protocols in Molecular Biology(1995)3rd Ed John Wiley & Sons，Inc.)。此外，存在许多供定 点突变的商业可行试剂盒，包括传统和以PCR为基础的方法。实例包 括得自Stratagene公司(货号200502)的EXSITETM PCR-Based定点突 变和得自Stratagene公司(货号200509)的双链定点 突变试剂盒。
此外，根据本领域技术人员所熟知的方法，在046D基因座的核苷 序列中的突变可通过插入突变或切断(N-末端、内部或C-末端)来产 生。
本领域所熟知的定点突变的较老的方法依赖将突变为载体，如 M13抗菌素载体的序列的亚克隆，所述载体使得单链DNA模板分离。 在这些方法中，人们退火单链模板的突变引物(即，能够退火将要突 变位点但包含一种或多种在将要突变位点错配的核苷的引物)然后聚 合起始于突变引物3’端模板的补码。然后将得到的双方转化为宿主细 菌并为期望的突变筛选斑块。
最近，定点突变已经使用了PCR方法，其具有不要求单链模板的 优点。此外，已经发展的方法不要求亚克隆。当进行以PCR为基础的 定点突变时，必须考虑若干问题。首先，在这些方法中，需要减少PCR 循环数以防止由聚合酶引发的不期望突变的扩增。第二，为了减少存 在于反应中非突变亲代分子数，必需使用选择。第三，为了允许使用 单PCR引物套件，优选为延伸长度PCR方法。第四，由于某些耐热聚 合酶的非模板依赖末端延伸活性，常常必需在PCR产生突变产物的钝 端连接之前将端抛光步骤合并入所述程序。
以下所述方案通过以下步骤适合这些考虑。首先，所用的模板浓 度大约比在传统PCR反应中所用的高1000倍，其在不大量降低产物产 量情况下使得循环数从25至30降低至5至10。第二，限制性核酸内 切酶Dpn I(识别目标序列：5-Gm6ATC-3，其中残基被甲基化)用来 选择对抗亲代DNA，因为大多数普通大肠杆菌菌株Dam在序列 5-GATC-3甲基化其DNA。第三，Taq混合剂用在PCR混合物中以便 提高长(即，全部质粒长度)PCR产物的比例。最后，Pfu DNA聚合 酶用来在使用T4 DNA连接酶分子内连接之前抛光PCR产物末端。
下面详细描述突变聚核苷酸分离的非限制性实施例：
将质粒模板DNA(大约0.5皮摩尔)加入包含以下组成的PCR缓 冲液：1x突变缓冲液(20mM Tris HCl，pH 7.5；8mM MgCl2；40μg/ml BSA)；各引物12-20皮摩尔(如需要，考虑如碱基组成、引物长度和 设计的影响低聚核苷酸引物的退火特征的缓冲盐浓度等因素，本领域 技术人员可以设计突变引物；一个引物必须包含期望的突变和一个(相 同或其它的)必须包含5’磷酸盐便于随后连接)，250μM各dNTP、2.5 U Taq DNA聚合酶和2.5U Taq混合剂(得自Stratagene公司；参见尼 尔森(Nielson)等人(1994)Strategies 7：27，和美国专利第5,556,772 号)。引物可使用马特乌奇(Matteucci)等人1981，J.Am.Chem.Soc. 103：3185-3191的三酯方法来制备，在此引入作为参考。其他自动化 合成是优选的，例如，使用氰乙基亚磷酰胺(cyanoethyl phosphoramidite)化学在生物检索8700 DNA合成器上。
PCR循环进行如下：94℃下4分钟、50℃下2分钟和72℃下2分 钟的一次循环，随后94℃下1分钟、54℃下2分钟和72℃下1分钟的 5至10次循环。亲代模板DNA和线性PCR产生的合并所述突变引物 的DNA使用DpnI(10U)和Pfu DNA聚合酶(2.5U)处理。这导致 体内甲基化亲代模板和杂合DNA的DpnI消化，且通过Pfu DNA聚合 酶，线性PCR产物上非模板导向Taq DNA聚合酶延伸碱基的移除。 反应在37℃下培养30分钟，然后转移到72℃下再培养30分钟。将包 含0.5mM ATP的突变缓冲液加入DpnI消化的、Pfu DNA聚合酶抛光 的PCR产物。混合溶液，并将10ul移入心的微量离心管，并加入T4 DNA连接酶(2-4U)。在37℃培养连接酶60分钟以上。最后，根据 标准方法将经处理的溶液转化为大肠杆菌细胞。
随机突变方法存在于本领域，其将导致一组拥有一个或多个随机 定位突变的突变体。这样的一组突变体然后可筛选相对于野生型聚合 酶显示降低的尿嘧啶检测活性的那些(例如，通过测量存在200μM dUTP时和给定DNA聚合酶的最佳温度下，30分钟内10纳摩尔dNTPs 结合为多聚形)。随机突变方法的实例为所谓的“过失倾向PCR方法”。 如名称所暗示的，在DNA聚合酶不支持高保真结合的条件下所述方法 扩大了给定序列。不同DNA聚合酶鼓励过失倾向结合的条件不同，然 而本领域技术人员可以确定给定酶的这样的条件。在扩大的保真度中， 许多DNA聚合酶的关键变量，例如，为缓冲溶液中二价金属离子的种 类和浓度。因此，使用锰离子和/或镁或锰离子浓度的变化来反应聚合 酶的误差率。
由突变产生的期望突变体多肽的基因可排序以识别突变的位点和 数目。对于包含一种以上突变的那些突变体，给定突变的影响可由以 下方法来评估：在通过具体突变体从其它突变分离中，通过直接位点 突变将确定的突变的引入野生型基因。这样产生的单突变体的筛选检 测将随后允许确定单独那种突变的效果。
B培养基和设备
能够产生ECO-4601的微生物在培养基，优选地为包含已知供放线 菌的营养来源的水培养基中培养。这样的培养基包含碳、氮、各种无 机盐和其它营养物以及可由放线菌同化的生长因子源。根据本发明， 优选的能够生产法尼基化二苯并二氮杂酮的微生物发酵的培养基，优 选为小单孢菌属[S01U02]046，包括但不限于表1所列的培养基，其它 优选的合适的培养基包括但不限于表2中所列的培养基。对于将在大 体积规模上进行的发酵过程，根据本发明能够生产法尼基化二苯并二 氮杂酮的微生物接种体种子培养物的制备，优选地小单孢菌属 [S01U02]046能够通过使用培养基KH来进行，培养基HI能够用作供 大体积发酵的培养基。在本发明的另一实施方式中，种子培养基是FBB (成分配料：马铃薯糊精(24g/L)，牛肉提取物(3g/L)。细菌蛋白胨 (5g/L)，葡萄糖(5g/L)，酵母提取物(5g/L)和CaCO3(4g/L，调 节培养基pH值为7.0后添加))。在本发明的又一实施方式中，培养基 HI可被用作种子培养基。
表1优选培养基的实例
 每种培养基的组成(g/L)   AP   CA   DZ   GP   HI   JA   MI   PI   QI   QP   YB  pH   7   7   7   *   7   7.3   7   7   7   7.2   7  葡萄糖   60   10   5   30   10   10   10   12   20  甘蔗糖蜜(Cane molasses)   15   10  可溶性淀粉   15   15   20   25  玉米淀粉   30  马铃薯糊精   40   20   40   10   50  玉米浆   15   5  MOPS   15  酵母提取物   8   8.34   5   5   5   1  麦芽提取物   20   35  药用培养基   30   15   10   30  甘油   30  N-Z胺A   10  Proflo OilTM   4  鱼饲料   10  细菌蛋白胨   2.5   5   5   5  MgSO4·7H2O   1  CaCO3   2   5   7   3   2   2   2   3   5  NaCl   2  FeSO4·7H2O   0.01  MgSO4   0.1  ZnSO4·7H2O   0.01  CoCl2·2H2O   0.001
*pH没有被调节。

表2：合适的发酵培养基的实例
  每种培养基的   组成1(g/L)   AB   AC   CI   DA   FA  HA   KH   MA   MY   QB   RM   VA   VB   ZL   pH2   *   *   7.0   7.0   7.0  *   7.0   7.5   7.0   7.2   6.85   7.0   7.0   *   葡萄糖   5   10   10  10   10   12   10   50   10   3   蔗糖  340   100   20   麦芽糖   4   甘蔗糖蜜   10   15   20   玉米淀粉   可溶性淀粉   25   15   5   25   10   马铃薯糊精   20   20   40   20   10   玉米固体   5   玉米浆   10   5   玉米粉   10   玉米淀粉   大豆面粉   (Soybean flour)   5   30   大豆粉   15   干酵母   2   圆酵母   4   酵母提取物  3   5   4   5   麦芽提取物  3   10   药用培养基   10   甘油   25   20   10   甘露醇   25   N-Z胺A   10   5   L-谷氨酰胺   5.84   L-精氨酸   1.46   大豆粉   鱼饲料   10  5   10   细菌蛋白胨   5
  每种培养基的   组成1(g/L)   AB   AC   CI   DA   FA   HA   KH   MA   MY   QB   RM   VA   VB   ZL   大豆蛋白胨   (Soytone-pepto   ne)   5   KH2PO4   1   MgSO4·7H2O   0.5   0.5   1   1   CaCO3   4   2   3   2   1   4   6   2.5   5   NaCl   1   5   5   5   MnCl2·4H2O   0.1   ZnCl2   0.1   FeCl2·4H2O   0.1   (NH4)2SO4   3.5   2   2   3   K2SO4   0.25   MgCl2·6H2O   1   10.1   28   Na2HPO4   3   2   KCl   2   植酸   1   柠檬酸钠   2.5   酪蛋白氨基酸   0.1   Proflo oilTM   (mL/L)   4   MOPS   21   微量元素溶液   #13(mL/L)   2   微量元素溶液   #24(mL/L)   1
1以g/L描述的培养基组分，另有说明除外。
2添加CaCO3前如所指出的调节pH值。符号*表示未调节pH值。
3微量元素溶液#1包含(每100mL溶液，在去离子、蒸馏(dd)H2O 中制备)：ZnSO4·7H2O(10mg)，FeSO4·7H2O(100mg)，CuSO4·5H2O(10 mg)，MnSO4·H2O(10mg)，Na2B4O7·10H2O(10mg)，(NH4)6MO7O24·4H2O (10mg)。
4微量元素溶液#2包含(每1000mL溶液，在去离子、蒸馏(dd)H2O 中制备)：ZnCl2(40mg)，FeCl2·6H2O(200mg)，CuCl2·2H2O(10mg)， MnCl2·4H2O(10mg)，Na2B4O7·10H2O(10mg)，(NH4)6Mo7O24·4H2O(10 mg)。
根据本发明，用于培养能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮的微生 物的发酵程序符合设备消毒和安全操作以及技术以符合本领域技术人 员所实践的涉及微生物的培养的无菌生长条件(通常参见，Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，参见上文)。
根据本发明，用于使用能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮的微生 物接种的培养基发酵的合适容器是本领域所熟知的，且能够依赖要求 生产的发酵液的体积而选择。例如，用于在实验室规模水平生产的发 酵的容器包括消过毒的、泡沫塞2升、三角锥瓶的使用，该容器包含 大约500毫升培养基并使用能够生产法尼基化二苯并二氮杂酮的微 生物接种。包含接种培养基的容器能够被搅拌，例如通过在旋转振荡 器上或热水浴中以旋转速度大约250转/分钟振荡以维持足够接种的微 生物生长的培养基中溶解氧的水平。培养期间，也可通过向培养基中 注射空气、氧气或合适的气体混合物来实现通风。以这样的实验室规 模水平，生产包含法尼基化二苯并二氮杂酮的发酵液的合适的发酵温 度范围和时间分别为大约27℃至大约29℃，和大约72小时至大约100 小时。在培养期间，合适的培养条件也包括维持发酵液pH值范围为大 约6至大约9，更优选地为大约7至大约8。
在研究实验室设备中，自动台式发酵罐可用来生产一定量包含法 尼基化二苯并二氮杂酮的发酵液。这样的发酵罐是本领域技术人员所 熟知的，且得自许多供应商，例如新布伦兹威克科学公司(New Brunswick Scientific Inc.)或赛多利斯公司(Sartorius AG)。这样的发 酵罐可提供发酵体积范围例如，为大约1升至大约20升，工作体积范 围低于1升至大约15升。优选地，这样的发酵罐装有控制和监控发酵 条件的系统和附件，例如热毯或水套不锈钢或玻璃发酵容器或具有浸 没加热/制冷盘管；装有一个或多个合适的叶轮的机械密封搅拌轴(例 如，拉斯通(Rushton)型叶轮)，其能够以适合达到发酵液合适搅拌的 不同旋转速度来操作；一个或多个供液体添加或移除的蠕动泵；一个 或多个自动操作和监控液体添加/移除并控制发酵液泡沫的探针；监控 和调节发酵液pH值和溶解氧含量的探针和控制器；使得期望气体向发 酵液连续添加的电磁阀；以及装备(其可包括视景显示系统)有合适 软件供编程和监控发酵条件的电控单元，其可提供发酵的电子和/或打 印记录。在本发明的一个优选实施方式中，新布伦兹威克科学公司 110发酵罐用于发酵能够产生ECO-4601微生物的菌株。
在本发明的另一实施方式中，能够产生ECO-4601的微生物菌株的 发酵能够使用大体积发酵罐，更优选地使用一个或多个中试发酵容器 来发生。如本领域技术人员所公知的，中试发酵容器的体积容量大小 可在大约20升至大约7500升，更优选地为大约75升至大约3000升 容器，最优选地为大约100升至大约2000升容器范围内变化。许多大 比例发酵容器和附件系统的制造商和供应商对本领域技术人员来说是 可行的。这样的供应商和制造商可包括，但不限于，新布伦兹威克科 学公司(爱迪生，新泽西)、Chemap公司(Volketswil(地名，沃尔科 兹维尔)，瑞士)、欧谱公司(Applikon Inc.)(斯西丹，荷兰)、赛多利 斯集团贝朗国际生物工程系统公司(Sartorius BBI Systems，Inc.)(伯 利恒，宾夕法尼亚)、丸菱实验室设备有限公司(Marubishi Laboratory Equipment Co.，Ltd.)(日本)和L.H.工程有限公司(L.H.Engineering Co.) (联合王国)。如霍索布驰M.(Hosobuchi M.)和吉川(Yoshikawa) 的“微生物方法的扩大”(在工业微生物和微生物技术手册)，第2版 (1999)，(由Demain A.L.和Davies J.E.编著)(美国微生物学会，华盛 顿哥伦比亚特区)第353-361页)和Junker B在化学工程2003年2月第 1至6页“多用途发酵罐设计：批判性思考”中所说明的，为了使大规 模发酵生产条件最优化，许多因素可要求依赖选择供使用的发酵容器 的大小和类型来调节。例如，这样的因素可包括那些机械/物理性质， 例如叶轮和挡板的种类和数目、每单位体积的搅拌速度和功率、叶轮 外缘速度(其可影响在微生物上造成的剪切力)和通风速率和压力。 如本领域技术人员将理解的，依赖将被使用的大体积发酵容器的容量， 在选择的大体积发酵容器中的培养基的接种可要求作为能够产生法尼 基化二苯并二氮杂酮(其随后用于生产数量足以接种大体积发酵容器 中的培养基的接种体)的微生物的一种或多种种子培养的发酵生产。 例如，种子培养物可在一个或多个被维持作为在实验室规模水平的发 酵生产的每个条件的挡板种子摇瓶中制备，在接种体发酵罐接种之前， 在获得培养物纯度和生存力期间，一个或多个取自这样的种子培养物 的等分试样可被收回。生产一定体积的接种体发酵液应当与将在大发 酵容器中接种的培养基的体积相匹配。根据本发明，所使用的优选的 接种体发酵液的体积范围是包含在大体积发酵容器中培养基体积的大 约2％至大约10％，更优选地是包含在大体积发酵容器中培养基体积 的大约3％至大约4％，最优选地是包含在大体积发酵容器中培养基体 积的大约3.2％至大约3.5％。根据本发明，Chemap AG型M16K接种 体发酵罐可用来生产接种体培养物，其能够用来接种一定体积包含在 大体积发酵罐中的培养基。根据本发明，可以使用具有总容积为750 升，带有安装在驱动器上(当从容器底部测量时)并位于大约70升刻 度、大约200升刻度和大约340升刻度处的叶轮的Chemap AG型 CF/569。
本领域技术人员公认通过本发明的方法获得的包含式1的法尼基 化二苯并二氮杂酮的第一浓缩物可被第一浓缩物产品下游处理以便 减少第一浓缩物中杂质的水平。这样的处理可发生在本领域技术人员 所公认的各种方法中的任意一种，例如在以下一个或多个实施例中， 其不应考虑被限制为可被选择从而达到这样的下游处理的具体方法。
实施例
除非另外指出，用在以下实施例中的试剂和溶剂由西格玛奥德里 奇(Sigma-Aldrich)和/或飞世尔科技(Fisher Scientific)公司所提供。 除非另外指出，用在本说明书和权利要求书中的表示组分和性质数量 的全部数目将被理解为在全部实例中通过术语“大约”被修改。因此， 相反除非指出，在本发明和附属权利要求中所提出的数值参数为近似 值。至少，并非意图将等同原则的申请限制于权利要求范围内，各数 值参数至少应该根据有效数字的数目和通过普通舍入方法来分析。尽 管说明本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在实施例、表 格和附图中设置的数值尽可能精确地被报道。任何数值可内在地包含 一定的误差，其由实验、测试方法、统计分析等中的变化产生。
除非另外定义，本文所用的各技术和科学术语具有如本领域所属 技术人员普遍理解的相同的含义。尽管类似或等价于本文所描述的那 些方法和材料能够用在本发明的实践或测试，但是合适的方法和材料 描述如下。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非意图为限 制性的。
实施例1：小单孢菌属菌株[S01U02]的生产
1.1第一轮菌株改良
小单孢菌菌株046(保藏号IDAC070303-01)在含10至100μg/mL 链霉素的GYM琼脂培养基的培养平板上被划线。GYM琼脂培养基的 组分包含(以g/L计)：葡萄糖(4g)、酵母提取物(4g)、麦芽提取物 (10g)、N-Z胺A(1g)、NaCl(2g)、琼脂(20g)，用蒸馏水制为 1000mL，pH值为7.2(参见Shima J.等人(1996)“Induction of Actinorhodin Production by rpsL(Encoding Ribosomal Protein S12) Mutations that Confer Resistance in Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor A3(2)”J.Bacteriol.，vol.178(24)，p.7276-7284)。 在28℃下培养接种盘4至10天。获得对抗生素显示自然抗性的单菌落， 随后划线至包含相似浓度链霉素的GYM琼脂培养平板作为所选择的 具体菌落的平板。在28℃下培养所述平板15至20天。来自各平板的 表面生长被用来接种(对各平板)一个包含5mL培养基KH(种子培 养基中没有加入链霉素)的玻璃培养管(150mm×20mm)。在28℃下， 以250RPM运转的旋转混合器上培养接种的培养管70至72小时以使 得细菌培养生长。培养期后，从各培养管(种子培养基)取0.250mL 等分试样并转入包含10mL培养基CI的类似管中。
在28℃下，以250RPM运转的旋转混合器上培养接种的培养管7 天以使得细菌培养生长并产生ECO-4601。发酵完成后，向各管加入 10mL乙酸乙酯，所述管被送回混合器搅拌20min。各管的内含物被转 移进分开的45mL Falcon管中并在4500RPM下离心10min以在管中生 成上有机相和下水相。从各管取5mL有机相(上相)并转移入分开的 小玻璃管中(100×13mm)，在氮气流中蒸发溶剂以在管内获得干燥的 残余物。所述干燥残余物重新溶于0.5mL甲醇中，并通过LCMS检测 ECO-4601的含量。大约850个单菌落被筛选，从中鉴定单菌落(克隆)， 产生产量大约10至25mg/mL的ECO-4601，这样的产率大约高于对照 (亲代菌株的等价培养)所产生的10倍。所选择克隆对高浓度的链霉 素(100μg/mL)是有抵抗的，小单孢菌属菌株[S01]046(保藏号IDAC 231203-01)被指派。
1.2第二轮菌株改良
在第二轮菌株改良中，在包含GYM琼脂培养基的培养平板中划线 小单孢菌属菌株[S01]046。所述平板在28℃下培养15至20天直到丰 富的孢子形成产生。通过使用5mL无菌蒸馏水浸没所述平板、从整个 平板刮去孢子以及将悬浮孢子移入15mL锥形管，然后以5000RPM在 4℃下离心10分钟来从各平板收集孢子。上层清液通过移液管从离心 管取出丢弃，且孢子颗粒在10mL无菌蒸馏水中重悬浮，并充分振荡。 琼脂块(如果存在)通过以下方法来从孢子悬浮液中：通过放置于注 射器中的棉花过滤该重悬浮液，接着在室温下以5000RPM重离心10 分钟，然后通过移液管取出来倾析上层清液。离心的孢子使用无菌蒸 馏水重悬浮并稀释以达到浓度为8000至20000孢子/毫升。
从稀释的孢子悬浮液中(经棉花过滤或者没有)取0.5mL，液滴均 匀分散至GYM琼脂平板的琼脂表面。使平板在无菌条件下层流中干燥 10分钟，在干燥期间每个所使用的平板的盖子保持微开。然后使平板 孢子以强度为琼脂表面的40～45焦耳/立方米经历紫外(UV)辐射。 在UV处理期间从平板移除盖子。为了通过光能力预防由UV引诱的突 变的逆转，使平板经历UV处理，然后维持于28℃不透光容器至少24 小时。随后在28℃培养经照射的平板4～10或直到单菌落出现。选取 幸存的菌落(大约0.1％)，划线GYM琼脂培养平板上，并在28℃培 养15～20天或直到丰富的孢子形成出现。
筛选来自幸存菌落的克隆以生产如上所述的ECO-4601用于第一 轮筛选以获得抗生素耐药克隆。在相似条件下生长菌株[S01]046的未 经UV处理的培养用作对照。从本筛选的第二轮，单菌株被鉴定以产 生高于对照菌株4～6倍的ECO-4601。该新菌株被指定为小单孢菌属 菌株[S01U02]046(保藏号为IDAC 070905-01)。当在包含10L培养基 HI(表1)的14-L发酵罐中生长时，发现菌株[S01U02]046产生产率 大约为172±24mg/L的ECO-4601。
实施例2：小规模实验室生产
为了评估是否发酵条件的变化可导致发酵液中ECO-4601产率增 加，采用了如下小规模发酵和提取程序。
2.1摇瓶的制备
在两个中的各一个中放入3个玻璃珠，将125mL厄伦美厄 (Erlenmeyer)摇瓶和所述摇瓶高温灭菌。然后将体积为25mL经灭菌 的HI培养基无菌转移进各摇瓶。随后，向各摇瓶加入一份条件、无菌 HP20树脂悬浮液以产生每摇瓶1％HP20树脂含量(0.25g/mL无菌储 备液中1mL)。HP20树脂悬浮液的制备包括测量一定量干HP20置于大 口杯中并加入一定体积100％甲醇足以覆盖所述干树脂。彻底混合大 口杯中的内含物以从树脂中排出全部气泡，使得HP20树脂在大口杯中 沉淀。沉淀之后，轻轻倒出甲醇，且再重复一次甲醇处理步骤。然后 用蒸馏水洗涤甲醇条件HP20树脂5次，洗涤5次后，向无菌条件HP20 树脂中添加足量的水以获得含浓度0.25g/mL的储备液，制得的摇瓶在 高压灭菌器(121℃)中灭菌30min。
2.2种子培养物的制备
小单孢菌属菌株[S01U02]046的种子培养物通过将两个甘油储备 瓶(各瓶在-80℃维持直到使用并包含1.5mL冰冻细菌培养)的内含物 转移进一个2-L包含500mL水培养基KH的挡板摇瓶来制备。所述种 子培养物在28℃、以250RPM振荡下生长3天。
为了生产甘油储备管，在28℃下培养17～20天的[S01U02]046的 来自孢子GYM平板的表面生长转移入3个、2-L各包含500mLKH培 养基的挡板摇瓶中。然后培养物在28℃、以250RPM搅拌下生长3天。 通过在无菌条件下，在各无菌摇瓶(共300mL)中混合来自各摇瓶的 100mL制备混合培养物。向混合培养物中添加等体积来自无菌40％ (v/V)甘油水溶液，混合并分配于2mL螺纹盖管中的1.5mL等分试 样中，并储存在-80℃。
2.3生产培养基的接种
对于各实验，如2.1部分制备两份厄伦美厄摇瓶，使用0.5mL(2 ％V/V)如上所述在250RPM下生长的种子培养物接种各摇瓶。经接种 的摇瓶置于在250RPM下运行的旋转混合器中，在28℃下生长培养物 4天。
2.4提取
在发酵培养的第4天(96小时)，从各摇瓶移出2mL发酵液并转 入15mL添加了2mL乙酸乙酯的螺纹盖管中。所述管然后在高速下漩 涡振荡大约2分钟，接着在室温下5350RPM离心(Sorval LegendTM RT) 10分钟以在所述管内产生上有机相合下水相(包含细菌菌丝体和HP20 树脂)。移出0.5mL上相，转移入硼硅玻璃管(13×100mm)，所述玻 璃管的内含物在氮气中40℃下干燥10分钟。生成的干燥残余物在 0.5mL 100％甲醇中重悬浮(短暂漩涡振荡以确保完全重悬浮液)。取 150μL残余物重悬浮液分析ECO-4601含量。
2.4结果
从重复实验获得的结果在下表3中出示，所述重复实验为了评估 在发酵期间发酵培养液中存在一定量甲醇条件HP20树脂是否导致 ECO-4601增加的生产。
表3ECO-4601的小规模发酵液的浓度

上述结果表明发酵液中存在树脂可能与ECO-4601生产的增加相 关，从而导致提高的ECO-4601产率。
实施例3：小规模实验室生产
如以上实施例2所述，生长和提取小规模发酵培养物，与之例外 的是，每个实验生长三份摇瓶。从三份摇瓶获得的结果如下表4所示。
表4ECO-4601的小规模发酵液的浓度

上述结果进一步表明发酵液中存在树脂可能与ECO-4601生产的 增加相关，从而导致提高的ECO-4601产率。
实施例4：放大生产-台式发酵分批培养物
4.1接种体生产和台式发酵
在GYM琼脂的琼脂平板上维持小单孢菌属菌株[S01U02](保藏号 IDAC 070905-01)。通过从琼脂平板向2-L包含500mL无菌KH培养基 的摇瓶转移小单孢菌属的表面生长制备供台式发酵(benchtop fermentation)的接种体。每升KH培养基包含10g葡萄糖、20g马铃薯 糊精、5g酵母提取物、5g NZ-胺A和1gCaCO3，用水(pH7.0)补充 为1升。在大约28℃，设置为250rpm的旋转混合器上培养接种体培养 物大约70小时。培养之后，将300mL培养物转入14.5L包含10L无菌 生产培养基HI的110发酵罐(新布伦兹威克科学公司，爱迪 生，新泽西)中。每升生产培养基HI包括20g马铃薯糊精、30g甘油、 2.5g细菌蛋白胨、8.34g酵母提取物和3g CaCO3，(调剂pH值后添加) (使用0.3mL硅去沫油(化学服务)和0.05ml Proflo oilTM(商业蛋 白)作为防沫剂)。使用搅拌机以中速运转将培养基内含物混入3L蒸 馏水大约30分钟，将内含物调节至pH值为7.0，接着添加CaCO3， ProfloTM油和硅去沫剂。容器在121℃下灭菌40分钟。在28℃下通过 发酵生长培养物96±4小时，控制连续回路中溶解氧在25％处，搅拌在 350-650RPM范围变化，通风设置为固定速率0.5V/V/M。
为了测试完成发酵时，存在与发酵液中ECO-4601的量，同样移出 5mL发酵液(在发酵取样过程中，也在第2和3天早晚对各发酵培养 物进行提取)。如以上实施例2中2.3部分所述，使5mL经历乙酸乙酯 提取程序，例外的是5mL发酵液在50mL螺纹管中使用5mL乙酸乙酯 提取，且干的残余物在1mL 100％甲醇中重悬浮。甲醇重悬浮的残余物 从而经2×的因子稀释用于HPLC/UV检测以确定发酵液中ECO-4601 的产率(浓度表示为mg/L)。HPLC/UV检测使用装备有沃特斯(Waters) 双波长2487检测器沃特斯Alliance 2690分离模块(Waters公司，米尔 福德，马萨诸塞州)或装备有沃特斯双波长2487检测器的沃特斯 Alliance 2695分离模块来进行。所用的HPLC柱选自ACE 3 AQ C18， 3.0ch×100mm+3.0×10mm guard 3u(加拿大，安大略，彼德堡，加 拿大生命科学公司)或对称C18，4.6×150mm+3.0×20mm guard 5u (沃特尔公司)。对于两种管型，所用的溶剂是溶剂A-H2O+0.4％甲酸 (996∶4mL)；溶剂B-乙腈+0.4％甲酸(996∶4mL)。ACE柱的流速 和时间设置为1.00mL/min和16分钟，而对称柱的流速设置为1.30 mL/min和15分钟。对于两种柱型，在室温下注射20μL样品，设置压 力最小20巴和最大300巴，检测发生在294处。可选择地，检测可在 230nm进行。
如上所述生长许多分离发酵液培养物。如上所述，在发酵的第2 天早上和晚上，发酵第3天早上、下午和晚上和发酵第4天早上从各 发酵液取进行中样品等分试样。对于各发酵培养物，产率(其为以mg (ECO-4601)/L(发酵液)/h为单位的ECO-4601生产率)可被给定 的各发酵培养物的总时间和在发酵完成时存在于发酵液中的 ECO-4601的质量评估。另外，对于各发酵培养物，观察到ECO-4601 产率在整个发酵培养期间的数值范围内变化，但是在发酵培养的第2 和第3天增加更快。基于在发酵的第2天下午和第3天早上所取的进 行中的样品等分试样计算的，直接记录的发酵培养系列的产率值出示 于表5，直接记录如下。
表5进行中的发酵培养物分析
  BioFlo 110   发酵液批号   135   136   137   138   139   140   141   142   第2天PM   [ECO-4601   mg/L]     24.16     7.26     30.6     28     54.6     18.05     14.06     11.21   第3天AM   [ECO-4601   mg/L]     93.49     60.24     128.4     126.8     130     73.63     64.77     47.72   b/n D2-PM &   D3-AM样品   的小时数     17     17     19.5     19.5     19.5     17     17     17   [ECO-4601]   b/n D2-PM &   D3-AM之差     69.33     52.98     97.8     98.8     75.4     55.58     50.71     36.51   产率   (mg/L/hr)     4.08     3.12     5.01     5.06     3.87     3.27     2.95     2.15
表5所示的结果表明当产率能够在发酵批次之间变化时，达到 5mg/L/h以上的产率。
下面表6出示了来自如上所述生长的各分离发酵液培养物的数据， 其表示在完成各发酵液培养物的培养期时单位发酵液培养物的 ECO-4601发酵液浓度和质量。
表6ECO-4601的发酵液浓度(在发酵完成时)
BioFlo 110发酵液 批号 135  136  137  138  139  140  141  142 ECO-4601的发酵液 浓度(mg/L) 97.56  88.71  122  137.6  130.4  108.87  54.49  115.08 发酵液中ECO-4601 的质量(mg) 878  798.4  1098  1238.4  1173.6  1088.7  517.7  1093.3
4.2收获、提取和浓缩
对于各发酵批次培养物，从发酵液除去检测等分试样后，通过逐 滴添加20％的H2SO4(硫酸)水溶液将发酵液的pH值调节为3.0±0.2， 同时持续搅拌。生成的酸化的混合物通过冷却至4℃并在该温下培养 12小时～48小时(最大72小时)来进一步处理。将各批次合并入较 大的持瓶或大瓶(如需要，10L或20L体积)，该阶段保持在4℃。在 4℃培养期间完成时，冷发酵液分装放入750mL聚丙烯离心管中，在 3000～3500rpm离心(Sorval RT-7)15～20分钟。丢弃上层清液，合 并菌丝体颗粒得到总合并颗粒质量1400克。然后使用100％甲醇(HPLC 级，J.T.Baker)提取合并的菌丝体颗粒三次(90分钟、90分钟、30 分钟，以中到高速搅拌)(对于每100g菌丝体每轮提取使用甲醇体积 300±5mL)。混合所述甲醇提取物，并通过Whatman #4滤纸过滤。
如下处理经过滤的提取物以形成第一浓缩物：将330gHP20树脂装 入10L旋转蒸发摇瓶，其然后安装至旋转蒸发系统(装备有设置为40 ℃的步琪(Buchi)加热锅(模型B-490)和步琪真空泵(模型V-500) 的步琪旋转蒸发器(模型R-200))。在持续22±2小时蒸发的蒸发过 程期间，将过滤的提取物等分试样引入所述蒸发摇瓶。完成蒸发过程 时，体积为2200mL残留水留在蒸发摇瓶中，并且所述ECO-4601吸附 于HP20上。所述残留水的HPLC-UV分析表明69mg ECO-4601留在该 残留水(31.36mg/L)中，从而表明来自过滤的提取物的99％以上的 ECO-4601吸附到HP20树脂上。
实施例5：放大生产-台式发酵分批培养物
在台式发酵的另一实施例中，如实施例4所述使用110发 酵罐产生发酵培养物。当各批次发酵完成时，各发酵批次的等分试样， 如实施例4所述通过HPLC-UV分析以确定ECO-4601的浓度，从而获 得每个培养物发酵期间完成时各发酵批次培养物中ECO-4601的质量。 这些分析的结果出示于下面表7中。
表7ECO-4601的发酵液浓度(在发酵完成时)
BioFlo 110发酵液 批号 4001 x02  4001  x03  4002  105  106  107  108  109 ECO-4601的浓度 (mg/L) 101.56  139  90.43  152  91  117  157  122 发酵液中ECO- 4601质量(mg) 810.24  1320.5  723.44  1216  864.5  1111.5  1491.5  1159
当发酵完成时，在通过离心从合并的发酵液中收获颗粒物(菌丝 体)之前，如上所述酸化、合并(经合并的发酵液的总体积大约为71.5L) 和冷却发酵培养物。如实施例4所述使收获的菌丝体进行3轮甲醇提 取。甲醇提取物的HPLC-UV分析显示ECO-4601的提取质量为 7470mg。
实施例6：放大生产-大体积/中试发酵
6.1主种子储备的制备
如图5所描述的制备试制主种子储备。从小单孢菌属[S01U02]046 的冻干的主瓶获得孢子颗粒，并无菌转入消毒的、50mL已经添加2.5mL TSB培养基(胰酶大豆发酵液，得自贝迪公司)的管中。然后漩涡振 荡该管以获得冻干的孢子颗粒的均匀悬浮物。从所述管中取两份0.5mL 所述颗粒悬浮物等分试样，在分离GYM琼脂对照平板(GYM琼脂培 养基(每1000mL)：葡萄糖(4g)；酵母提取物；(4g)；麦芽提取物(10g)； NZ-胺A(1g)；NaCl(2g)；琼脂(20g)，pH 7.2)中均匀展开以评估 所述细菌的纯度和生长。接种的GYM平板在28±1℃中培养大约72小 时。伴随所述GYM对照平板的接种，0.5mL颗粒悬浮液等分试样被接 种入两个各包含25mLKH培养基和3个玻璃珠(5mm直径)的125mL 摇瓶中的每一个。接种的摇瓶在28±1℃下，以250～300RPM运转的旋 转混合器中培养大约72小时～大约96小时(直到培养基中出现桔黄 色菌丝体)。然后125mL摇瓶中的等分试样置于GYM琼脂平板上，培 养17.5±2.5天以在菌丝体表面获得暗色孢子。孢子通过使用大约5mL 无菌蒸馏水浸没各平板并使用无菌细菌学环刮擦来收集(在无菌操作 台上)，通过经由棉花塞过滤将重悬浮的孢子转移入50mL锥形管来流 动。然后离心(5000RPM，4℃10分钟)孢子悬浮液以获得孢子颗粒， 其随后使用10mL无菌水洗涤(漩涡振荡)并重离心(5000RPM，4℃ 10分钟)。然后在水中12％脱脂的悬浮液(Sigma)中重悬浮最终的孢 子颗粒得到均一的悬浮物，然后无菌分散于冻干瓶中0.5mL等分试样 中。然后冷冻所述瓶，接着冻干，冻干的主种子储备瓶在真空中密封 并在室温下储存或在冰箱中维持在5±3℃较长期保存。
6.2工作储备的制备
供中试规模发酵制备的工作储备的制备遵循图5所描述的程序(下 半部分)。将经冻干的主储备瓶中的内含物转入包含KH培养基的管中， 通过漩涡振荡悬浮。悬浮的颗粒转入包含KH培养基和玻璃珠的摇瓶 中，其如以上A部分所描述的在轨道振荡器中培养84±12小时。随后 将培养摇瓶的内含物转移至GYM琼脂平板上并且如上所述进行培养。 然后如上所述收集孢子，洗涤并无菌转移入管中，如上所述进行离心。 离心之后，颗粒物在水中重悬浮、过滤、重离心，并且除去上层清液。 然后孢子颗粒在20∶80 甘油∶水溶液中重悬浮、并在瓶中分装作为用 于生产中试发酵培养的工作储备。工作储备等分试样储备于-70±10 ℃。
6.3工作种子平板的制备
从储藏库中重新得到工作储备瓶，保持于干冰中。GYM琼脂平板 随后使用细菌学环(bacteriological loop)加条纹或划线(streak)，所 述细菌环包含从带环的瓶刮擦的工作储备。反转被加条纹平板并在28 ±1.0℃下培养大约15天～大约20天以在表面获得带有暗色柔软孢子 的菌苔。
6.4种子摇瓶的培养
供中试规模发酵制备的种子摇瓶的制备遵循如图6(上部分)所描 述的程序。来自各GYM琼脂平板的表面生长(包括细胞质量和孢子) 转移入3个2L挡板摇瓶，其中每个摇瓶包含500mL无菌KH培养基， 并且在28±1.0℃，在运转在大约300RPM的轨道振荡器上培养70小 时～72小时以产生种子培养物。所述种子培养物的纯度和生存力通过 包含在摇瓶接种后大约48小时和大约72小时取自生长培养物的等分 试样的微观检查的过程中测试，以及还通过在这些接种点的时间点划 线GYM琼脂来检验。
6.5接种体发酵罐的发酵
来自三个种子摇瓶的培养物材料被混合(图6，下部分)，在无菌 条件下，pH值为7时，将相当于出现在28L容量接种体发酵罐(Chemap AG，Type M16K)中大约3％培养基体积的混合材料的体积(450mL) 无菌转入包含15LKH水培养基的接种体发酵罐中。培养基使用3mL 硅去沫油(Chem Seervice，化学服务)和0.75mL Proflo油(商业蛋白； Southern Cotton Oil Co.)悬浮。在28±1.0℃进行发酵48±1小时，溶 解氧维持在25％(与搅拌相关联)，通风0.55(V/V/M)，混合速度110～ 400RPM。对接种体发酵罐培养物的纯度和生存力进行的测试检测，包 括在GYM琼脂平板上24小时后培养和48小时后培养等分试样的微观 检查和划线。
6.6中试发酵罐中的发酵
将接种体发酵罐的整个体积(图6，下部分)转移入750L容量包 含450L调节至pH值为7.1的HI培养基的中试发酵罐(Chemap AG，type CF/569)中。被转移的接种体的体积相应于中试发酵罐中培养基体积的 大约3.3％。在121℃杀毒40分钟之前，也向所述培养基中添加硅去沫 油(135mL)和0 Proflo油(22.5mL)。在28±1.0℃进行发酵95±1 小时，溶解氧维持在25％(与搅拌相关联)，通风0.5～0.7(V/V/M)， 发酵液的混合速度80～160RPM，优选地为100RPM，混合至溶解氧 25％。对于纯度和生长生存力的过程中控制的测试包括微观检查和48、 72和96小时后接种时间点在GYM琼脂平板上发酵液等分试样的划 线。
6.7发酵液的收获和提取
当发酵完成时(图7)，通过持续搅拌下缓慢添加99％的H2SO4在 中试发酵罐中将发酵液的pH值调节为pH 3±0.1的水平。然后将所述 发酵液在所述中试发酵罐中冷却至14±2℃，随后转入储存器中，并在 冰箱中4±2℃下保持16～72小时。当冷却期完成时，然后使用0.2～ 0.45微米孔大小的滤膜使经冷却的发酵液超滤(过滤时间大约为20分 钟)以产生收获的菌丝体的粘稠浆液。
为了确定完成发酵时发酵液中ECO-4601的浓度和质量的值，两份 0.5克分离(过滤)的菌丝体等分试样被置入分开的50mL离心管中。 然后向各管加入20mL甲醇，接着超声5分钟并在高速下漩涡振荡30 分钟。然后将管在4000～5000RPM下离心10～15分钟，各管的上层 清夜移入干净的50mL瓶中。如上所述使用20mL甲醇重新提取各管的 残留菌丝体。然后合并每管两份甲醇提取物(总体积大约40mL)，通 过0.45μm滤膜过滤1mL合并的甲醇提取物的等分试样。制备经过滤的 等分试样的10×稀释物(甲醇中)，使通过HPLC-UV进行ECO-4601 的定量分析。
作为过滤酸化的和冷却的发酵液完成后定性和定量检查，也化验 了分离的发酵液上层清液中ECO-4601的存在。将两份5mL发酵液上 层清液的等分试样置于分开的50mL离心管，接着添加5mL乙酸乙酯。 然后将管在高速下漩涡振荡1分钟，在4000～5000RPM离心10～15 分钟。从各离心管取出1mL乙酸乙酯层的等分试样，放入10mL玻璃 培养管中，在氮气流中蒸发至干。将各管中干燥的残余物重新溶解于 1mL甲醇中，过滤生成的溶液。然后使各管的滤出液进行HPLC-UV 分析以获得ECO-4601的含量。
通过以下方法来从收获的菌丝体的浆液中提取ECO-4601：向每1L 浆液中添加3L100％的甲醇，接着通过在高速(大约30～50赫兹)下 通过超滤系统循环甲醇-菌丝体浆液混合物对于初始提取大约60±20 分钟。高循环速度用来帮助破坏菌丝体聚集体，循环期间使温度增加 至42±3℃。可选择地，可以增加循环时间，例如120分钟，然而如果 利用低循环速度因此避免了提取物的可能的过热和降解。一旦菌丝体 浆液与提取溶剂适当混合，超滤系统阀门打开，使得甲醇提取物能被 收集。甲醇提取物被放于一容器，使用甲醇体积与第一次提取所用的 相同的甲醇重提取残留的菌丝体。第二轮提取的残留菌丝体使用甲醇 体积大约为第一和第二轮每次提取所用的3～8倍甲醇重新提取。与前 两轮提取相比较，用于第三轮提取的循环时间减少。混合三次甲醇提 取物并使用BüchiModel R-153(Labortechnik AG， Flawil，Switzerland)以产生粘稠的第一浓缩物。
包含在每轮提取的甲醇提取物中的ECO-4601的量化进行如下。取 两份1mL甲醇提取物等分试样，使用甲醇稀释10倍并过滤。经过滤的、 稀释的等分试样进行HPLC-UV分析以获得ECO-4601的含量。
作为菌丝体的甲醇提取完成后定性和定量检查，评估经过滤废弃 的菌丝体(第三轮提取之后的菌丝体)以获得ECO-4601的含量。将两 份1克经过滤废弃的菌丝体样置于分开的50mL离心管，接着添加10mL 乙酸乙酯。然后将管超声5分钟，在高速下漩涡振荡30分钟，在4000～ 5000RPM离心10～15分钟。从各离心管取出2mL乙酸乙酯层的等分 试样，放入10mL玻璃培养管中，在氮气流中蒸发至干。将各管中干燥 的残余物重新溶解于1mL甲醇中，过滤生成的溶液。然后使各管的滤 出液进行HPLC-UV分析以获得ECO-4601的含量。
7个分离的中试发酵的结果出示于下表8中
表8中试发酵
  中试   发酵   批号   收获使发酵   液中ECO-   4601的含量   提取物中   ECO-4601   的质量   (第一轮)   提取物中   ECO-4601的   质量   (第二轮)   提取物中   ECO-4601   的质量   (第三轮)   浓缩物中   ECO-4601   的质量)   从发酵液到   第一浓缩物   的近似浓度   因数   PE028   78.8g   (175mg/L)   54.8g   12.2g   2.7g   69.7g   57   PE029   76.5g   (170mg/L)   43.3g   12.7g   4.4g   60.4g   51   PE031   67.1g   (149mg/L)   37.4g   11.2g   3.8g   52.4g   50   PE033   66.6g   (148mg/L)   46.0g   8.4g   2.0g   56.4g   54   PE034   57.2g   (127mg/L)   33.6g   11.3g   1.8g   46.7g   52   PE036   65.3g   (145mg/L)   42.5g   10.7g   2.4g   55.6g   55   PE037   65.3g   (147mg/L)   42.5g   16.0g   3.1g   61.6g   61   PE038   76.1g   (169mg/L)   49.3g   16.3g   3.9g   69.5g   59
如上表8最后一栏所示，第一浓缩物的平均体积大约为7L。中试 发酵的结果表明在第一轮提取中，包含在从发酵液(其甚至可在初始 提取后被蒸发形成浓缩物)回收的甲醇提取物中的ECO-4601的质量为 在计算出的存在于发酵液的ECO-4601含量的大约55％～大约70％范 围内。完成全部三轮提取，合并甲醇提取物，出现在第一浓缩物中 ECO-4601的质量为在计算出的存在于发酵液的ECO-4601含量的大约 78％～大约94％范围内。
实施例7：使用不同培养基提高ECO-4601的产品
7.1普通程序
测试各种培养基的性能以提供相对于具体优选的培养基(HI)的 高水平ECO-4601的发酵生产。在上面实施例1所述的条件下，使用表 9中所提供的单独培养基生长小单孢菌属菌株[S01U02]046的小规模发 酵培养物，下面立即说明。表1说明了被测试的每种培养基的组分。 对于各小规模发酵培养，发酵液的收获和提取也遵循实施例1所提供 的程序，同样经提取的发酵液的HPLC分析是为了定量所使用的每种 培养基的ECO-4601的产品。
7.2结果
每种培养基类型生产的ECO-4601的含量表达为相对于培养基HI 的改进因数，所述改进因数以两个分开的发酵培养实验(每个实验每 种培养基两个125mL的摇瓶)中所测试的每个培养基(mg/L)的平均产 量与HI培养基中两个对照培养物生长的平均产量的比率来计算。这些 小规模发酵培养实验的结果总结于表9。
表9使用不同培养基的小规模发酵培养
培养基 JA  DZ  YB  GP AP PI  QP  QI  CA  MI HI 改进因数(相对于HI 培养基) 4.45  4.3  3.5  3.3 3 3  2.7  2.7  2.7  2.3 / 改进因数的标准偏差 2  0.4  1.3  N/A  * 0 0.4  0.4  0.1  0.9  0.4 /
*不可行-一次实验的结果
实施例8：放大生产-大体积/中试发酵
如实施例6所述，制备中试制种子储备、工作储备、工作种子平 板、种子摇瓶、接种体发酵罐的发酵和中试发酵罐中的发酵。
8.1发酵液的收获和提取
当发酵完成时，通过持续搅拌下缓慢添加99％的H2SO4在中试发 酵罐中将发酵液的pH值调节为pH 3±0.1的水平。然后将所述发酵液 在所述中试发酵罐中冷却至4±2℃，随后转入储存器中，并在冰箱中 4℃±2℃下保持16～72小时。当冷却期完成时，使冷却的发酵液连续 离心(5,000-20,000RPM)或间隙离心(5,000-20,000RPM)以产生菌 丝体膏。在发酵完成时，也在收获菌丝体浆液的后收集时，如实施例6 所述，也如图8所描述的来操作发酵液中ECO-4601质量浓度的计算。 可选择地，在完成冷却期间，如实施例6所述的方法可使冷却的发酵 液超滤以产生收获的菌丝体的浆液。
8.2菌丝体膏的提取
如前面实施例6所述，向每一千克菌丝体膏中添加8L(可使用5～ 8L的范围)100％甲醇，接着在25±3℃下，以250±50RPM混合30±10 分钟，然后在过滤体系中循环甲醇-菌丝体混合物来从收获的菌丝体膏 中提取ECO-4601。第一轮提取之后，使用与第一轮提取相符的甲醇的 体积使提取的菌丝体膏经历第二轮残留菌丝体的提取。根据实施例6 进行每轮提取包含在甲醇提取物中的ECO04601的定量。
8.3提取的ECO-4601向吸附树脂的转移
在完成提取后，合并每轮的ECO-4601甲醇提取物，混合，放入体 积大约合并提取物体积的2.5～3倍的不锈钢的大容器(与有机溶剂例 如甲醇等相兼容)中，如图8所示。预清洁、干燥，然后向所述大容 器中添加HP20树脂，在室温(5℃-40℃)下以100～300的速度与合 并的提取物相混合。根据每1克计算的将出现在合并提取物中的 ECO-4601中10克树脂，计算添加的HP20的含量，尽管对于每1克计 算的将出现在合并提取物中的ECO-4601能够添加树脂的含量在大约 10克～大约40克范围内。第二轮甲醇提取完成时，用另外250L体积 的甲醇洗涤经提取的菌丝体(和进行提取的容器和系统的内表面)以 除去残余量的ECO-4601，其可能已经保持在经提取的菌丝体或表面。 包含ECO-4601的洗液然后与第一和第二轮提取合并以形成合并甲醇 提取物。
为了将合并的ECO-4601甲醇提取物中的ECO-4601转移至被添加 到合并的甲醇提取物的吸附HP20树脂上，将水(USP-级)以体积率 为每分钟合并提取物体积的大约0.5％～大约20％(即，对于100L合 并的提取物，将水以每分钟大约0.5L～大约20L的比率抽入所述大容 器中)，更优选地为每分钟合并提取物体积的0.5％～5％。抽入所述大 容器的水的总体积为所述合并提取物总体积的大约1.2～大约1.5倍。 为了提供将ECO-4601从合并的甲醇提取物相HP20树脂的转移，抽入 所述大容器的总体积可包括大约等于所述合并的提取物的总体积。当 将水的总体积抽入包含合并的ECO-4601甲醇提取物/HP20树脂混合物 的大容器完成时，使所述合并的提取物/HP20树脂/水混合物在室温(5 ℃～40℃)搅拌(100～300RPM)下培养大约7.5分钟。可选择地， 使混合物培养大约5分钟～大约60分钟。当培养完成时，经过滤回收 包含吸附ECO-4601的HP20树脂，例如通过使用喜活袋式过滤装配单 元；装备有50μm喜活袋式过滤膜(GAF尼龙过滤器，零件#： PO2Z-E-20S)的FBF-0102-AB10型(喜活公司)，本领域技术人员可 以实现。在完成从所述树脂回收ECO-4601时，留在合并的甲醇提取物 中ECO-4601的含量通过取两份1mL甲醇提取物等分试样来化验，随 后HPLC-UV分析过滤的稀释的等分试样中ECO-4601的含量。
8.4结果
中试发酵的结果出示于表10中，其中ECO-4601被提取并使用如 上所述的水转移技术转移到吸附树脂上。
表10中试发酵(1000L)
收获时发酵液中 ECO-4601的含量 提取物中ECO- 4601的质量 (第一轮) 提取物中ECO- 4601的质量 (第二轮) 洗液中ECO- 4601的质量 废弃菌丝体 中ECO-4601 的质量 浓缩物中ECO- 4601的质量 (第二轮) 125.1g 85.3g 11.4g 25.2g 3.2g 121.9g
中试发酵的结果表明从发酵液(完成转移步骤时，如所计算的出 现在从合并的甲醇提取物中回收的提取-结合树脂)回收的ECO-4601 的质量将大约为所计算的发酵液中所存在ECO-4601含量的97.4％
实施例9：树脂吸附的法尼基化二苯并二氮杂酮的下游加工过程
包含树脂吸附的法尼基化二苯并二氮杂酮的第一浓缩物能够经 历进一步下游加工过程以便降低杂质的水平，这样的杂质潜在地对例 如ECO-4601的结晶具有不良影响或影响。为了降低这样的杂质的水 平，使得已经转移到吸附树脂上的ECO-4601经历柱纯化循环，其中对 于第一轮纯化，通过将20％甲醇水溶液中2.5±0.2kg预清洗的HP20 转移入30L容量的柱中来制备HP20柱，然后洗脱所述柱直到所述HP20 树脂固定在所述柱中从而在所述柱中形成树脂床。然后在不扰乱HP20 的洁净床条件下，将包含大约315克ECO-4601(包含ECO-4601的HP20 树脂的颜色是从微红色到呈褐色/暗褐色)的HP20树脂转移入所述柱。 所述HP20树脂包含大约315克ECO-4601，如以上实施例8所述，所 述ECO-4601由提取物的转移处理产生，所述提取物具有339.2克 ECO-4601。当包含315克ECO-4601的HP20树脂向所述柱的转移完成 时，然后以流速400mL/min使用150±5L 65％的甲醇水溶液洗脱所述 柱，丢弃使用65％甲醇水溶液洗脱的流出物。65％甲醇水溶液的洗脱 步骤之后，然后以流速400mL/min使用150±5L 70％的甲醇水溶液洗 脱所述柱，流出液收集在20L的级份(fraction)中。当70％水洗脱完 成后，然后以流速400mL/min使用100±5L 90％的甲醇水溶液洗脱所 述柱，流出液收集在20L的级份中。检测从所述70％甲醇水溶液和90 ％甲醇水溶液洗脱步骤中得到的20L级份中ECO-4601的存在，合并 大于或等于1％ECO-4601的级份以便形成甲醇水溶液级份的混合，所 述甲醇水溶液包含第一轮纯化的ECO-4601。然后使得包含大约304克 ECO-4601的甲醇水溶液级份的混合经历第二轮纯化。
对于第二轮纯化，将从第一轮纯化获得的包含大约304克 ECO-4601的甲醇水溶液级份的混合转移入350L混合槽。然后向所述 混合槽中加入数量为18±2L的预清洁的HP20树脂，搅拌器以120±10 RPM旋转。然后以体积率为2±0.5L/min向所述槽中抽入水(UPS-级) 直到总体积等于第一轮纯化的混合的甲醇级份的体积。完成将水抽入 所述槽时，使用如实施例8所述的袋式过滤装配单元和过滤器回收包 含ECO-4601的HP20。对于第二轮纯化，通过将5L 20％甲醇水溶液 中2.5±0.2kg预清洁的HP20转移到柱上来制备HP20柱，之后使用20 ％的甲醇水溶液洗涤所述柱，所述HP20被允许固定在所述柱上从而在 所述柱中形成树脂床。柱固定完成后，已经转移到HP20树脂上的 ECO-4601被转移到所述柱，使用30％甲醇水溶液洗涤所述柱。随后， 以流速400mL/min使用150±5L 65％的甲醇水溶液洗脱所述柱，丢弃 使用65％甲醇水溶液洗脱的流出物。65％甲醇水溶液的洗脱步骤之后， 然后以流速400mL/min使用150±5L 70％的甲醇水溶液洗脱所述柱， 流出液以20L级份收集。当70％水洗脱完成后，然后以流速400mL/min 使用100±5L 90％的甲醇水溶液洗脱所述柱，流出液以20L级份收集。 检测从所述70％甲醇水溶液和90％甲醇水溶液洗脱步骤中得到的20L 级份中ECO-4601的存在，合并大于或等于1％ECO-4601的级份以便 形成甲醇水溶液级份的混合，所述甲醇水溶液包含第二轮纯化的 ECO-4601。然后蒸发包含大约278克ECO-4601的甲醇水溶液级份的 混合和甲醇水溶液级份的混合以提供具有浅灰色到灰褐色的第二浓缩 物。尽管可残留在所述第二浓缩物中的任意具体杂质的水平可变化， 但是所述第二浓缩物将被认为基本不含分子，所述式1法尼基化二苯 并二氮杂酮除外。从所述第二浓缩物中，式1的结晶态法尼基化二苯 并二氮杂酮可通过使所述第二浓缩物结晶过程来生产。
实施例10：结晶
第二浓缩物可被用于结晶ECO-4601的生产。33％的乙醇结晶溶液 能够以140±20RPM搅拌下在500L结晶槽中制备。允许结晶溶液的温 度在30±2℃处平衡120±10分钟。结晶的样品溶液能够通过溶解所述第 二浓缩物(由所述两轮纯化处理所述HP20柱(如以上实施例8所述) 产生)和通过在无水乙醇中混合所述第二浓缩物(24±3g/L)来制备。 所述第二浓缩物将与所述无水乙醇充分混合以便将所述第二浓缩物溶 解于所述无水乙醇中，例如通过人工混合7.5±2.5分钟。然后当搅拌时， 向乙醇溶液中加入纯化的水，生成的溶液通过0.45～10μm膜的过滤器 来过滤。然后所述所述样品溶液可以大约10mg/min/10L结晶溶液体 积的速率抽入结晶槽中。抽所述结晶溶液期间，氮气或纯化空气以20±2 L/min流速在结晶槽上方流动。所述槽的温度被维持在30±2℃，同时 在40±10RPM处使用33％乙醇溶液混合所述样品溶液。当所述样品溶 液抽入所述结晶槽时，所述结晶槽将使用水中75±25mgECO-4601接 种，完成所述样品溶液向所述结晶槽的传输。允许ECO-4601晶体成熟 14±2小时，氮气以10±2L/min流速在结晶槽上方流动，混合发生在 40±10RPM，同时槽温度维持在30±2℃。然后将纯化的水以速率 (mL/min)大约等于以1200份来添加水的体积被抽入所述结晶槽，允 许晶体在结晶槽上方以流动速率为10±2L/min的氮气流中成熟24±4 小时，混合发生在40±10处，同时所述槽的温度维持在30±2℃。成熟 期完成时，停止混合，允许晶体沉淀18±6小时。为了从结晶槽中收获 沉淀的晶体，结晶槽中的上层清液被排入收集器，沉淀的晶体(以浆 液的形式)被排入接受器，通过10-20μm烧结玻璃砂滤漏斗过滤来回 收。然后回收的晶体在冷(大约4℃)的10％的乙醇中重悬浮，再次 过滤，重复两次重悬浮和过滤。然后允许晶体在真空炉(运行在大约 至少等于或大于25英尺Hg柱压力，68±2℃处)中退火21±5小时。退 火完成时，然后经退火的晶体可转入容器，优选地为聚丙烯容器，储 存于25±2℃。
实施例11：相对于发酵液中ECO-4601的纯化，产生增加的 ECO-4601的纯度水平的具体批次的纯化演示
作为测量从发酵液阶段到产生结晶ECO-4601中ECO-4601纯度水 平增加的实例，450L中试规模发酵液批次(记录号DR00116)(根据 实施例6所述的程序来生产)被计算出包含大约78克ECO-4601。大 约22.5kg(当完成发酵过程时，包含大约5％的发酵液质量)产生式1 的法尼基化二苯并二氮杂酮的微生物的细胞质量被计算出现在所述 发酵液中。因此，发酵期完成时，纯度水平大约0.35％的ECO-4601 被计算出现在所述发酵液中(78克除以(0.05ch3450,000克))。发酵 期完成时，发酵液中的ECO-4601的纯度水平被评估为至少在大约0.3 ％～大约1％范围内。当使第一浓缩物(从发酵液提取物的处理中产生) 经历第一轮柱纯化时，计算的从这第一轮纯化中产生的ECO-4601的纯 度大约为66％，当第二轮纯化(如以上实施例9所述)完成时，包含 如此形成的第二浓缩物的ECO-4601的纯度被计算出大约是88.5％。随 后，使第二浓缩物经历结晶过程，生成的结晶体被计算大约是99％ ECO-4601。
在冲突的情况下，本发明的说明书，包括定义，将支配。尽管已 经结合其优选实施方式对本发明作了详细说明和描述，但是本领域所 属技术人员将理解：在不脱离所附权利要求书所限定的本发明范围的 情况下，可作各种形式和细节的变化。
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申请人或代理人档案号012508-0051 国际申请号PCT/CA2007/000629
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