New bacillus natto and soft fermented soybeans produced by using the bacillus natto

本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、発酵の進行に伴い納豆を柔らかくする能力を有する納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された柔らかい納豆に関する。

納豆は、大豆の煮豆をバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌で発酵することによって生産される伝統食品であるが、納豆の品質を左右する因子の一つとして、硬さ（柔らかさ）がある。

近年では柔らかな納豆が好まれる傾向にある中で、例えば、柔らかく煮上がる特性を有する大豆を選別して用いたり、大豆の蒸煮強度を強めて柔らかく煮上げた煮豆を用いたりして、柔らかい納豆を製造しようとする試みが行われているが、柔らかく煮上がる特性を有する大豆を安定して調達することが難しかったり、大豆の蒸煮強度を強めた場合は豆色が黒くなりかえって品質低下をきたすなどの問題があった。

一方、納豆の硬さは、納豆菌による発酵の前後で比較すると、発酵後のほうが硬くなることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。 また、発酵が進むに伴い経時的に豆は硬くなってゆくことも報告されている（例えば、非特許文献２参照）。

このような中で、他の発酵性能は従来の納豆菌と遜色がなく、かつ、発酵が進むに伴って豆を柔らかくするような能力を有する納豆菌が取得できれば、糸引き性、旨み、色調などの他の特性は遜色なく、かつ、柔らかい納豆が安定して製造可能となることが期待できる。

しかし、これまでにこのような能力を有する納豆菌を開発したとの報告は全くないのが実情であった。
食総研報、５１巻、ｐ． ４８−５８、１９８７年 日本食品工業学会誌、４０巻、１号、ｐ． ７５−８２、１９９３年

本発明は、発酵が進むに伴って豆を柔らかくするような能力を有する納豆菌を提供し、該納豆菌を用いた柔らかい納豆の製造方法、及び該製造方法により製造された柔らかい納豆を提供することを目的とする。

本発明者らは、柔らかい納豆を製造するのに適した納豆菌を取得すべく、各方面に亘って且つ鋭意検討を重ねた結果、主に韓国で食用されている、稲わらを利用した韓国の伝統的な大豆の発酵食品であるチョングッチャン（戦国醤）より分離、選抜した納豆菌の中に、他の発酵性能は従来の納豆菌と遜色がなく、かつ、発酵が進むに伴って豆を柔らかくするような能力を有する納豆菌が存在することを見出し、選抜した該納豆菌を用いて納豆を製造することによって柔らかい納豆の製造が可能になることを検証して、本発明を完成した。

すなわち、請求項１に記載の本発明は、発酵が進むに従い納豆を柔らかくする能力を有するバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌に関する。

また、請求項２に記載の本発明は、１６ｓＲＮＡ遺伝子が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるものであること、を特徴とする請求項１に記載の納豆菌に関する。

また、請求項３に記載の本発明は、バチルス・サチリスＫ３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｋ３）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０１）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の納豆菌に関する。

さらに、請求項４に記載の本発明は、請求項１〜３のいずれか1項に記載の納豆菌を用いることを特徴とする柔らかい納豆の製造方法に関する。

さらにまた、請求項５に記載の本発明は、請求項４に記載の納豆の製造方法により製造されたことを特徴とする納豆に関する。

そして、請求項６に記載の本発明は、請求項４に記載の納豆の製造方法により製造され、且つ、対照納豆菌株であるバチルス・サチリスＯＵＶ２３４８１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＯＵＶ２３４８１）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５９）を用いて製造された納豆に比して、硬度が低いものであること、を特徴とする請求項５に記載の柔らかい納豆に関する。

さらにまた、請求項７に記載の本発明は、請求項４に記載の納豆の製造方法により製造され、硬度が０．２〜０．４Ｎであることを特徴とする請求項５に記載の柔らかい納豆に関する。

本発明により、発酵の進行に伴い納豆を柔らかくする納豆菌（柔らかい納豆を製造する納豆菌）が提供され、その納豆菌を用いて納豆を生産することにより近年その需要が高まってきている柔らかい納豆の製造が可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明では納豆菌の分離を行った。
納豆菌の分離源には特に制限はないが、稲わら、枯葉、土壌、世界各国の発酵食品等があるが、例えば、韓国で食用されている大豆の発酵食品であるチョングッチャン（戦国醤）が好適である。

納豆菌の分離は、以下のとおりにして実施することが可能である。 すなわち、納豆菌分離源となるサンプルを滅菌水等に懸濁し、適当な濃度に希釈した後、標準寒天培地（１リッター当たり、酵母エキス ２．５ｇ、トリプトン ５．０ｇ、ブドウ糖 １ｇ、寒天 １５ｇ、ｐＨ ７．１：栄研化学株式会社製）にプレーティングし、３７℃で一夜培養し、生じたコロニーを分離する。

この際、コロニーの形状を指標に、納豆菌と思われる菌を選択するのが好ましい。 さらに、選択したコロニーをＳＧ培地（シュークロース ５％、Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム塩 １．５％、ＫＨ ₂ ＰＯ ₄ （リン酸二水素カリウム）０．２７％、Ｎａ ₂ ＨＰＯ ₄・１２Ｈ ₂ Ｏ（リン酸水素二ナトリウム（１２水））０．４２％、ＮａＣｌ ０．０５％、ＭｇＳＯ ₄・７Ｈ ₂ Ｏ（硫酸マグネシウム七水和物）０．０５％、 ビオチン０．１μｇ／ｍｌ、寒天 １．６％、ｐＨ ６．４：例えば、特開平１０−２１５８６１号公報参照）に塗布後、３７℃一夜培養し、粘質物を生成するコロニーを選択する。

得られたコロニーより、常法に従い胞子液を作成して（例えば、特開平１０−２１５８６１号公報参照）、納豆製造用の種菌とすることができる。

納豆の製造は、常法通り行えばよい。 例えば、浸漬した大豆を水切りし、０．１８ＭＰａで１８分間蒸煮して得た蒸煮大豆１ｇあたり１０００から４０００個の胞子を植菌し、４０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温３７〜４２℃、高湿度下で発酵を行う。 発酵終了後、熟成させた後、出来上がった納豆の品質を評価する。 なお、納豆の硬さの評価は、官能評価および硬度測定にて実施することができる（例えば、特開２００４−２４１９７号公報参照）。

目的の納豆菌の選抜は、以下のようにして実施することが出来る。 すなわち、選択した納豆菌を種菌に用いて納豆を製造し、まず糸引き性の弱い納豆しか製造できない納豆菌を除外する。 次に、既存の納豆菌バチルス・サチリスＯＵＶ２３４８１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＯＵＶ２３４８１）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５９）（以下、ＯＵＶ２３４８１株と称する場合もある。）（例えば、特開２０００−２８７６７６号公報参照）を用いて生産した納豆を対照とし、それよりも柔らかな納豆が製造できる納豆菌を選択することができる。 さらに、選択した納豆菌を用いて製造した納豆の品質の評価を行い、硬さ以外の品質指標に関しても優れた納豆菌を選抜することができる。

バチルス・サチリスＯＵＶ２３４８１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＯＵＶ２３４８１）株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）、現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６））に、１９９９年（平成１１年）２月２３日付けで寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６６５９である。

このようにして選抜された柔らかい納豆を製造できる優れた納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、特に制限がない。

例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。

丸大豆納豆の製造方法は、原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（０．１５〜０．２０ＭＰａ）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入し、室温３７〜４２℃で所定時間（１５〜２０時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。

また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。

このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって選抜した優れた納豆菌に代えて使用することによって製造することができる。 このようにして、従来の納豆と比べ柔らかい納豆が製造可能となる。

本発明の製造方法によって製造した納豆は、製造直後において柔らかく、対照株（ＯＵＶ２３４８１株）による納豆の硬度（Ｎ）に対して５０〜７５％程度の硬度（Ｎ）しか示さない（換言すれば、対照納豆に比してそれだけ柔らかいことを示す）。 なお、発酵時間の経過とともに対照株は硬度（Ｎ）が増加するのに対し、本発明に係る納豆はこれとは全く逆に硬度（Ｎ）が低下する点が特徴的である。

発酵１２時間目において、本発明に係る納豆の硬度（Ｎ）は対照納豆の７５〜８５％であるが、１８時間目においては対照納豆の４０〜５０％となり、本発明に係る納豆の硬度（Ｎ）は対照納豆のそれよりも低く、しかも発酵時間の経過とともに低くなっている。 また、双方の納豆について時間の経過に伴う硬度（Ｎ）は、対照納豆の場合は、１８時間目においては、１２時間目に比して１１０〜１３５％に増加するのに対して、本発明に係る納豆の場合は、これとは全く逆に、５５〜７５％（通常、６０〜７０％）に低下する。

したがって、本発明によれば、対照に比して柔らかい納豆が得られるだけでなく、対照納豆が発酵時間の経過とともに硬くなっていくのに対して、本発明に係る納豆は逆に柔らかくなっており、製造直後の柔らかな納豆も充分に期待することができ、きわめて特徴的である。 もちろん、本発明に係る納豆は、糸引き性、硬さ（官能評価）、旨み等に関しては、対照納豆とはいささかも遜色がないことも確認されており、本発明に係る納豆は新規にしてきわめて有用な食品ということができる。

以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明する。

（実施例１）
（１）納豆菌の分離 チョングッチャンを適量滅菌水に懸濁し、滅菌水にて希釈した後、標準寒天培地（栄研化学株式会社製）プレートにプレーティングし、３７℃、１夜培養した。 出現したコロニーをＳＧ培地に植菌し、３７℃、２４時間培養し、粘質物を作る菌を選択した。 得られた菌より胞子液を作成し、定法に従い納豆を製造した。

（２）納豆の評価 製造した納豆の糸引きを官能評価し、弱いものを排除した。 次に、納豆の硬さを官能評価し、柔らかいものを選択し、さらに以下のようにして硬度計で硬度を確認した。

すなわち、硬度計は、直径１．５ｍｍのプランジャーを装着したデジタルホースゲージ（型式：ＦＧＣ−０．２、日本電産シンポ社製）を、電動式縦型簡易試験スタンド（型式：ＦＧＳ−５０Ｖ−Ｌ、日本電産シンポ社製）に、プランジャー部を下方にしてセットしたものを用いた。

そして、まず測定すべき納豆を１５〜２５℃に温めた後、豆粒を潰さないように箸で良くほぐし、任意の１粒を上記の電動式縦型簡易試験スタンドの台上に置いた。

その後、該デジタルホースゲージを６０ｍｍ／分の速度で降下させ、プランジャーで豆粒の中心を突き刺すように押潰した。 プランジャーが豆粒底面から１±０．２ｍｍのところまで降下したところで、デジタルホースゲージの降下を停止し、この時の表示値（単位：ニュートン（Ｎ）、ピーク値）を記録した。

以下、同様にして合計１４粒について表示値を計測した後、最上位２つ、及び、最下位２つの表示値を除いた１０粒分の表示値の平均をとって、納豆の硬度（Ｎ）を求めた。

納豆の評価に際しては、同じ蒸煮条件、発酵条件でＯＵＶ２３４８１株を用いて製造した納豆を対照とした。

表１に、上記方法で選抜した納豆菌を用いて製造した納豆の糸引き性、硬さ（官能評価）、及び硬度を示す。

これらの納豆菌で煮豆を発酵するとＯＵＶ２３４８１株で製造した場合に比べ柔らかい納豆が製造できた。

（実施例２）
実施例１で得られた納豆菌のうち最も柔らかい納豆を作ることが出来たＫ３株と、ＯＵＶ２３４８１株を用いて定法に従い納豆を製造した。 発酵開始時から、経時的に納豆の硬度を測定した。 その結果を表２に示した。

既存の納豆菌ＯＵＶ２３４８１株を用いて発酵した場合は、発酵の最後の段階で硬度が増していった。 即ち、硬くなっていった。 一方、Ｋ３株を用いて発酵した納豆は発酵時間全体を通してＯＵＶ２３４８１株を用いて製造した納豆よりも柔らかかった。 また、発酵時間の経過とともに一貫して硬度が低下し、柔らかくなっていった（表２）。 尚、Ｋ３株を用いて製造した納豆は、味、旨み、糸引き性ともに、ＯＵＶ２３４８１株を用いて製造した納豆と同等であった。

（実施例３）
Ｋ３株の菌学的な特徴を、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と比較した結果を表３に示す。 なお、各指標については、「Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８ｔｈ （ Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ ｃｏｍｐａｎｙ， １９７４）」、「食品微生物学ハンドブック（技報堂出版（株）、１９９５年）」、「好気性芽胞形成菌の図鑑（日本ベクトン・ディッキンソン（株）、２００４年）を参照して検査した。

また、図１及び配列表の配列番号１にＫ３株の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す。 １６ｓＲＮＡ遺伝子は、図２に示すプライマーを用いて増幅し、塩基配列を決定した。

すなわち、Ｑｕｉｃｋｌｙｓｅ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔｓ（キアゲン社製）を用いて抽出したＫ３株のＤＮＡを鋳型とし、図２に示すプライマーを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム ２４００（アプライドバイオシステムジャパン社製）によってＰＣＲ反応を行って得られた増幅断片について、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００（アプライドバイオシステムジャパン社製）を用いて塩基配列を決定した。

プライマーとしては、２７Ｆ（配列番号２）、５２０Ｒ（配列番号３）、５２０Ｆ（配列番号４）、９２０Ｒ（配列番号５）、９２０Ｆ（配列番号６）、１４９２Ｒ（配列番号７）を使用した。 なお、これらプライマーの塩基配列はまとめて図２に示した。

Ｋ３株の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のタイプ株であるバチルス・サチリス ＤＭＳ１０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＳＭ１０）株の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９９．９％以上の相同性を有していた。

以上の結果より、Ｋ３株を既存の納豆菌と同様に、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属すると同定した。

このようにＫ３株は、柔らかい納豆を製造しうる点できわめて特徴的である。 そこでＫ３株は、バチルス・サチリス Ｋ３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｋ３）株として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成１９年（２００７年）３月１９日付けで、寄託した。 その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０１である。

また、Ｋ３株は、特開２００２−２３３３９１号公報に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ株と異なり、容易に胞子化した。 即ち、Ｋ３株は栄養培地（酵母エキス２％、食塩０．５％、ｐＨ７）で３７℃、４８時間、振とう培養した場合でも、もしくは、胞子形成培地（例えば、特開平１０−２１５８６１号公報参照）で３７℃、２４時間振とう培養した場合でも、いずれにおいても、９０％以上が胞子化することが確認できた。 したがって、Ｋ３株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇとは異なることが確認できた。

Ｋ３株の１６ｓＲＮＡの塩基配列を示す図である。

各種プライマーの塩基配列を示す図である。