[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种抗菌肽制备方法的专利申请。

[0002] 抗菌肽是一类生物体内经诱导产生的具有生物活性的小分子多肽，具有广谱杀菌作用。天然的抗菌肽，已发现有A、B及D等多种。这类活性多肽多具有较好的耐酸碱性、热稳定性、以及广谱抗菌等特性。抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，尤其是对某些耐药性病原菌具有很强的杀灭作用。与传统抗生素相比，抗菌肽最大的特点在于其杀菌机理是其疏水性端螺旋直接插入细菌菌胞膜内而形成孔道，将细菌内容物泄出胞外而造成细菌死亡，具有作用迅速、对耐药菌有效且细菌不易产生耐药性的优良特点。

[0003] 已有研究还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等具有一定的杀灭作用，甚至能提高人体免疫力，加速伤口愈合。由于抗菌肽较为广泛的生物学活性，在医学上良好的应用前景，因而其应用价值巨大。

[0004] 现有应用中，抗菌肽作为饲料添加剂代替抗生素喂养小鸡、小猪及对虾预防禽畜及水产疾病已正在推广应用。

[0005] 现有技术中，抗菌肽的生产是通过注射大肠杆菌于柞蚕蛹，诱导产生抗菌肽的，然后再从柞蚕蛹提取天然抗菌肽，这种生产方式具有较为明显的得率低、成本高、大规模工业化生产困难的缺陷，一定程度限制了抗菌肽的生产和推广应用。因而极有必要开发新的抗菌肽生产制备工艺。

[0006] 本发明目的在于提供一种抗菌肽的制备方法，从而为抗菌肽的生产和推广应用奠定良好基础。

[0007] 本发明所采取的技术方案详述如下。

[0008] 一种抗菌肽的制备方法，该方法利用枯草芽孢杆菌菌株发酵制备而成，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YS439，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CICC 20445（该菌株属于一种可公开获得的菌株），制备方法具体包括如下步骤：（1）菌株复壮，具体为：
如果菌株是以冻干粉（一般在-80℃保存）形式保存，则首先应将冻干粉形式菌株接种在斜面培养基上，26℃~35℃条件下培养36~72h进行复壮生长；
所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：蛋白胨 0.4~0.8%，牛肉膏 0.2~0.3%，葡萄糖 1~4%，磷酸二氢钾0.2~0.5%，琼脂1.5~1.8%，pH=自然；
需要说明的是，如果菌株以斜面培养方式保藏，则无需进行此步骤的菌株复壮操作，可直接进入下一步生产过程；
（2）制备种子液，具体为：
将步骤（1）中复壮后菌株接种于灭菌后摇瓶培养基中，26℃~35℃、150-230 转/min摇瓶培养16~25h左右，至OD600 =3~8时，可认为菌种培养成熟，即已制备好种子液；
所述摇瓶培养基，以质量百分比计，配方为：
蛋白胨 0.4~0.8%，牛肉膏 0.2~0.3%，葡萄糖 1~4%，磷酸二氢钾0.2~0.5%，硫酸铵0.2~
0.7%，硫酸镁0.1~0.3%，pH=自然；
（3）制备一级种子罐培养液，具体为：
将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤（2）中所制备的种子液（以体积比计，接种量为
1:100~500），26℃~35℃、180-220 转/min、通风量1:0.5~0.7条件下，培养8~15h；
所述一级种子罐培养基，以质量百分比计，配方为：
玉米面3~6%，豆粕4~8%，磷酸二氢钾0.2~0.5%，葡萄糖1~4%，硫酸铵0.2~0.7%，硫酸镁
0.1~0.3%，pH=自然；
（4）菌株发酵，具体为：
将发酵培养基灭菌后，以4~8%体积比的接种量，接种步骤（3）中所制备的一级种子罐培养液，26℃~35℃、罐压0.05～0.08Mpa、通风量1:0.6~0.8条件下，发酵22~32h，至发酵效价不低于130000U/ml，且连续两小时效价不再增加时，即可认为发酵结束；
需要注意的是，发酵过程中可每2小时取样检测发酵效价，在发酵至12~15h时，补加发酵培养基，补加量为初始发酵培养基体积的15~20%；
所述发酵培养基，配方同一级种子罐培养基，即，以质量百分比计，配方为：
玉米面3~6%，豆粕4~8%，磷酸二氢钾0.2~0.5%，葡萄糖1~4%，硫酸铵0.2~0.7%，硫酸镁
0.1~0.3%，pH=自然；
（5）发酵液预处理，具体为：
将步骤（4）中发酵结束后醪液采用板框压滤机进行过滤，滤液再经超滤机浓缩；
浓缩后滤液加入淀粉、麦芽糊精或辅益粉等载体，在乳化罐内混合均匀后，使固形物含量控制在30%-40%；
超滤机浓缩时，所用超滤膜截留分子量为3000道尔顿；
（6）抗菌肽提取与精制，具体为：
将步骤（5）加入载体的浓缩后滤液经泵输送到喷雾干燥塔进行喷雾干燥，喷雾干燥时，具体参数为：
进风温度 130℃~160℃，排风温度65℃~75℃，雾化盘转速为3000~4500转/min，进料量为500~700kg/h；
干燥后，旋风分离收集菌粉，即抗菌肽粉剂；
尾气经沉降除尘、生物介质吸附、微生物分解除臭后排放；
（7）粉碎、筛分及包装，对步骤（6）中所制备的抗菌肽可进一步筛分、粉碎并包装后，以便进一步应用，具体为：
将步骤（6）中所收集的菌粉，经提升机输送到筛分机（40~80目）进行筛分，其中细粉输送到混合机，而筛分所得粗料经粉碎机粉碎后送至混合机以与细粉混合，搅拌20min~40min混合均匀后，经质检检测合格后即可进一步进行包装；
包装时，可采用自动定量包装机进行定量包装；进一步地，包装时可采用聚乙烯材质袋体作为内包装袋，而采用编织袋、纸桶或纸箱作为外包装袋；更进一步地，包装时，在将内袋捆扎后，采用封口机进行外包装袋缝包；包装时，每袋重量可设计为1~20Kg。

[0009] 本发明所制备的抗菌肽干粉，作为一种天然抗菌剂，可部分代替抗生素的应用，且无毒副作用，因而可以用作食品防腐剂、果蔬保鲜剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高等优点。

[0010] 与现有技术相比，本申请的主要技术优势体现在如下几个方面：（1）生产成本较低，实现了抗菌肽的规模化、产业化生产；本发明通过优化培养基构成，规模化生产时，以玉米面、豆粕等农副产品为主要发酵原料，代替了传统的乳糖、酵母粉、蛋白胨、蚕蛹等原料，较好降低了生产成本；同时通过特定菌株的选择，实现了抗菌肽规模化、产业化生产实现；
（2）抗菌肽生产周期较短、生产效率较高，且制备的抗菌肽的效价较高；在60吨发酵罐中批量生产时，发酵液平均抑菌效价在13~15万U/mL左右，最高达15.9万U/mL，产品综合回收率达80%以上，具有较好地生产价值。

[0011] 总体而言，本发明通过对特定发酵菌株培养基及发酵条件的优化，达到了高密度和高产量的预期效果。生产工艺简单易实现，较好缩短了抗菌肽的生产周期，加上生产成本较低、抗菌肽产量高、纯度高等优点，本发明可为抗菌肽的推广应用奠定一定基础。附图说明

[0012] 图1为所制备抗菌肽的热稳定性检测；图2为所制备抗菌肽的酶稳定性检测；
图3为所制备抗菌肽的酸碱稳定性检测。

[0013] 下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及的枯草芽孢杆菌菌株情况简要介绍如下。

[0014] 下述实施例中所采用的枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YS439，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CICC 20445，是一种可公开获得的微生物菌株；发明人在获得此菌株时，其在-80℃冰箱中以冻干粉形式存在，实际使用过程中，较为常见的还有以斜面培养基保存的形式。为较为全面的描述本发明的技术方案，下述实施例中，以冻干粉形式的菌株作为相关生产工艺的开始，但具体实施相关生产工艺时并非必须以此作为开始步骤。

[0015] 实施例1本实施例所提供的抗菌肽的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）菌株复壮，具体为：
首先将冻干粉形式菌株接种在斜面培养基上，32℃条件下培养48h进行复壮生长；
所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖 2%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.6%，pH=自然。

[0016] （2）制备种子液，具体为：将步骤（1）中复壮后菌株接种于灭菌后摇瓶培养基中，32℃、180 转/min摇瓶培养24h左右，至OD600=7时，可认为菌种培养成熟，即已制备好种子液；
所述摇瓶培养基，以质量百分比计，配方为：
蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖 2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.2%，pH=自然。

[0017] （3）制备一级种子罐培养液，具体为：在2吨规格的种子罐中配制1m3一级种子罐培养基，灭菌后，接种步骤（2）中所制备的种子液（以体积比计，接种量1:100），33℃、220 转/min、通风量1:0.5条件下，培养12h；此时显微镜检测表明，菌丝稠密、菌体正常，此时可以移种用于发酵生产。

[0018] 所述一级种子罐培养基，以质量百分比计，配方为：玉米面4%，豆粕5%，磷酸二氢钾0.2%，葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.2%，pH=自然（此时为6.5左右）。

[0019] （4）菌株发酵，具体为：在35吨规格的发酵罐中配制发酵培养基，灭菌后（121℃~123℃实消40~45分钟左右），降温到34℃时，以5%体积比的接种量，接种步骤（3）中所制备的一级种子罐培养液，33℃、罐压0.05Mpa、通风量1:0.6条件下，发酵30h，至发酵效价不低于130000U/ml，且连续两小时效价不再增加时，即可认为发酵结束；
需要注意的是，发酵过程中可每2小时取样检测发酵效价，在发酵至15h时，补加发酵培养基，补加量为初始发酵培养基体积的17%；
所述发酵培养基，配方同一级种子罐培养基，即，以质量百分比计，配方为：
玉米面4%，豆粕5%，磷酸二氢钾0.2%，葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.2%，pH=自然。

[0020] （5）发酵液预处理，具体为：将步骤（4）中发酵结束后醪液转入回收罐，并向其中加入硅藻土和珍珠岩（硅藻土、珍珠岩的添加量分别为发酵液重量的2%和3%），搅拌均匀，经板框压滤机过滤，清液再经超滤机浓缩（所用超滤膜截留分子量为3000道尔顿），加入水溶性淀粉为载体，在乳化罐内混合均匀，使固形物含量控制在36%。

[0021] （6）抗菌肽提取与精制，具体为：将步骤（5）加入载体的浓缩后滤液经泵输送到喷雾干燥塔进行喷雾干燥，喷雾干燥时，具体参数为：
进风温度 150℃，排风温度70℃，雾化盘转速为3000转/min，进料量为500kg/h；
干燥后，经旋风分离收集菌粉，即抗菌肽粉剂；
尾气经沉降除尘、生物介质吸附、微生物分解除臭后排放。

[0022] （7）粉碎、筛分及包装，对步骤（6）中所制备的抗菌肽进一步筛分、粉碎并包装后，以便进一步应用，具体为：将步骤（6）中所收集的菌粉，经提升机输送到筛分机（40目）进行筛分，其中细粉输送到混合机，而筛分所得粗料经粉碎机粉碎后送至混合机以与细粉混合，搅拌30min混合均匀后，经质检检测合格后即可进一步进行包装。

[0023] 对本实施例所制备的抗菌肽产品，发明人分别对其进行了热稳定性、酶稳定性、酸碱稳定性检测，检测结果表明，所制备的抗菌肽产品的活性不受温度、不受酶解影响，且具有较好的耐酸碱性。下面就相关实验检测过程简要介绍如下。

[0024] 抗菌肽的热稳定性检测本实验主要是检测所制备的抗菌肽产品在不同温度条件下的热稳定性，具体实验过程为：
分别称取1g抗菌肽产品，分别溶解在50mL水中，不同温度梯度水浴中保温20分钟后，测定其抗菌活性。测定结果如图1所示。

[0025] 实验结果表明，本发明所制备的抗菌肽产品易溶于水。而且从图1中可以看出，抗菌肽具有较好的热稳定性，随着温度升高，抗菌肽活性虽然受到一定影响，但即使100℃水浴20分钟后，对其杀菌作用影响并不明显，其抑菌活力仍可达到95%左右。

[0026] 酶稳定性试验本实验主要是检测所制备的抗菌肽产品在不同消化酶处理后的酶稳定性，具体实验过程为：
分别称取1g抗菌肽产品，在pH=3.0、37℃条件下，模拟动物肠胃内酶的浓度水平，分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶酶解处理抗菌肽2h，然后测定抗菌肽的抑菌效价。测定过程中，以清水处理作为对照。测定结果如图2所示。

[0027] 从图2中可以看出，抗菌肽活性在经消化酶处理后虽然出现一定程度降低，但与对照相比，这种差别并不明显，即，抗菌肽具有较好的酶稳定性，其活性不受消化酶酶解处理影响。

[0028] 酸碱稳定性试验本实验主要是检测所制备的抗菌肽产品在不同酸碱条件下活性变化情况，具体实验过程为：
分别称取1g抗菌肽产品，分别在溶解50mL具有不同酸碱度水溶液试管中，37℃水浴2h后，检测其抗菌活性。测定结果如图3所示。

[0029] 从图3中可以看出，抗菌肽在中性环境下，活性最高，在强酸或强碱环境下，活性受到一定影响，但与中性环境相比，活性受影响程度并不明显，这一结果表明，所制备的抗菌肽产品具有较好的耐酸碱环境特性。

[0030] 实施例2本实施例所提供的抗菌肽的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）菌株复壮，具体为：
首先将冻干粉形式菌株接种在斜面培养基上，31℃条件下培养48h进行复壮生长；
所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.25%，葡萄糖 1%，磷酸二氢钾0.2%，琼脂1.8%，pH=自然。

[0031] （2）制备种子液，具体为：将步骤（1）中复壮后菌株接种于灭菌后摇瓶培养基中，31℃、220 转/min摇瓶培养23h左右，至OD 600=3时，可认为菌种培养成熟，即已制备好种子液；
所述摇瓶培养基，以质量百分比计，配方为：
蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.25%，葡萄糖 1%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸铵0.4%，硫酸镁0.1%，pH=自然。

[0032] （3）制备一级种子罐培养液，具体为：在2吨规格的种子罐中配制1m3一级种子罐培养基，灭菌后，接种步骤（2）中所制备的种子液（以体积比计，接种量1:500），33℃、200 转/min、通风量1:0.6条件下，培养8h；此时显微镜检测表明，菌丝稠密、菌体正常，此时可以移种用于发酵生产。

[0033] 所述一级种子罐培养基，以质量百分比计，配方为：玉米面3%，豆粕7%，磷酸二氢钾0.4%，葡萄糖1%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.1%，pH=自然。

[0034] （4）菌株发酵，具体为：在5吨规格的发酵罐中配制发酵培养基，灭菌后（121℃~123℃实消40~45分钟左右），降温到36℃时，以4%体积比的接种量，接种步骤（3）中所制备的一级种子罐培养液，31℃、罐压
0.06Mpa、通风量1:0.6条件下，发酵25h，至发酵效价不低于130000U/mL（测定表明，发酵效价达到了150000U/mL），且连续两小时效价不再增加时，即可认为发酵结束；
发酵过程中可每2小时取样检测发酵效价，在发酵至13h时，补加发酵培养基，补加量为初始发酵培养基体积的20%；
所述发酵培养基，配方同一级种子罐培养基，即，以质量百分比计，配方为：
玉米面3%，豆粕7%，磷酸二氢钾0.4%，葡萄糖1%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.1%，pH=自然。

[0035] （5）发酵液预处理，具体为：将步骤（4）中发酵结束后醪液转入回收罐，并向其中加入硅藻土和珍珠岩（硅藻土、珍珠岩的添加量分别为发酵液重量的1.5%和3.5%），搅拌均匀，经板框压滤机过滤，清液再经超滤机浓缩（所用超滤膜截留分子量为3000道尔顿），加入辅益粉为载体，在乳化罐内混合均匀，使固形物含量控制在38%。

[0036] （6）抗菌肽提取与精制，具体为：将步骤（5）加入载体的浓缩后滤液经泵输送到喷雾干燥塔进行喷雾干燥，喷雾干燥时，具体参数为：
进风温度 160℃，排风温度65℃，雾化盘转速为3500转/min，进料量为700kg/h；
干燥后，经旋风分离收集菌粉，即抗菌肽粉剂；
尾气经沉降除尘、生物介质吸附、微生物分解除臭后排放。

[0037] （7）粉碎、筛分及包装，对步骤（6）中所制备的抗菌肽进一步筛分、粉碎并包装后，以便进一步应用，具体为：将步骤（6）中所收集的菌粉，经提升机输送到筛分机（60目）进行筛分，其中细粉输送到混合机，而筛分所得粗料经粉碎机粉碎后送至混合机以与细粉混合，搅拌40min混合均匀后，经质检检测合格后即可进一步进行包装。

[0038] 实施例3本实施例所提供的抗菌肽的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）菌株复壮，具体为：
首先将冻干粉形式菌株接种在斜面培养基上，31℃条件下培养48h进行复壮生长；
所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：蛋白胨 0.8%，牛肉膏 0.3%，葡萄糖 3%，磷酸二氢钾0.5%，琼脂1.6%，pH=自然。

[0039] （2）制备种子液，具体为：将步骤（1）中复壮后菌株接种于灭菌后摇瓶培养基中，31℃、220 转/min摇瓶培养24h左右，至OD 600=5时，可认为菌种培养成熟，即已制备好种子液；
所述摇瓶培养基，以质量百分比计，配方为：
蛋白胨 0.8%，牛肉膏 0.3%，葡萄糖 3%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.3%，pH=自然。

[0040] （3）制备一级种子罐培养液，具体为：在2吨规格的种子罐中配制1m3一级种子罐培养基，灭菌后，接种步骤（2）中所制备的种子液（以体积比计，接种量1:300），33℃、210 转/min、通风量1:0.8条件下，培养10h；此时显微镜检测表明，菌丝稠密、菌体正常。

[0041] 所述一级种子罐培养基，以质量百分比计，配方为：玉米面3%，豆粕6%，磷酸二氢钾0.4%，葡萄糖4%，硫酸铵0.3%，硫酸镁0.1%，pH=自然。

[0042] 需要说明的是，为便于后续规模化扩大使用，在一级中国种子罐培养液基础上，进一步制备了二级种子罐培养液，具体过程为：在15吨规格的种子罐中配制7m3二级种子罐培养基，灭菌后，接种上述所制备的一级种子罐培养液（以体积比计，接种量1:8），35℃、180 转/min、通风量1:0.8条件下，培养10h；此时显微镜检测表明，菌丝稠密、菌体正常，此时可以移种用于发酵生产。

[0043] 所述二级种子罐培养基，既可以与一级种子罐培养基相同，也可按如下质量百分比配方制备：玉米面6%，豆粕8%，磷酸二氢钾0.5%，葡萄糖3%，硫酸铵0.6%，硫酸镁0.3%，pH=自然。

[0044] （4）菌株发酵，具体为：在60吨规格的发酵罐中配制发酵培养基，灭菌后（121℃~123℃实消40~45分钟左右），降温到36℃时，以3%体积比的接种量，接种步骤（3）中所制备的二级种子罐培养液，35℃、罐压0.08Mpa、通风量1:0.8条件下，发酵32h，至发酵效价不低于130000U/mL（测定表明，发酵效价达到了140000U/mL），且连续两小时效价不再增加时，即可认为发酵结束；
发酵过程中可每2小时取样检测发酵效价，在发酵至14h时，补加发酵培养基，补加量为初始发酵培养基体积的18%；
所述发酵培养基，配方同二级种子罐培养基，即，以质量百分比计，配方为：
玉米面6%，豆粕8%，磷酸二氢钾0.5%，葡萄糖3%，硫酸铵0.6%，硫酸镁0.3%，pH=自然。

[0045] （5）发酵液预处理，具体为：将步骤（4）中发酵结束后醪液转入回收罐，并向其中加入硅藻土和珍珠岩（硅藻土、珍珠岩的添加量分别为发酵液重量的2%和3.6%），搅拌均匀，经板框压滤机过滤，清液再经超滤机浓缩（所用超滤膜截留分子量为3000道尔顿），加入麦芽糊精为载体，在乳化罐内混合均匀，使固形物含量控制在30%。

[0046] （6）抗菌肽提取与精制，具体为：将步骤（5）加入载体的浓缩后滤液经泵输送到喷雾干燥塔进行喷雾干燥，喷雾干燥时，具体参数为：
进风温度 130℃，排风温度75℃，雾化盘转速为4500转/min，进料量为600kg/h；
干燥后，经旋风分离收集菌粉，即抗菌肽粉剂；
尾气经沉降除尘、生物介质吸附、微生物分解除臭后排放。

[0047] （7）粉碎、筛分及包装，对步骤（6）中所制备的抗菌肽进一步筛分、粉碎并包装后，以便进一步应用，具体为：将步骤（6）中所收集的菌粉，经提升机输送到筛分机（80目）进行筛分，其中细粉输送到混合机，而筛分所得粗料经粉碎机粉碎后送至混合机以与细粉混合，搅拌35min混合均匀后，经质检检测合格后即可进一步进行包装。