[0001] 本发明属于养殖微生物及其技术领域，涉及从一株枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖环境中的应用。

[0002] 规模化养猪已是我国养猪业发展的主要形式，养猪密度大，猪舍内部含有丰富的粪便、尿液、饲料残留、动物体表皮屑等有机物。这些有机物是微生物生长的良好“培养基”。大量的有害和有益微生物均可以在这些“培养基”中快速的生长。如果有害的细菌大量生长，则会对动物的健康带来严重的危害。目前在生产中控制猪舍内部有害细菌的生长的常见措施是定期消毒。但即使采取频繁的消毒措施也只是短暂的减少微生物的数量，消毒结束后微生物的数量很快又会回到消毒前的水平。在每次消毒结束后，环境中的微生物大部分被杀灭，猪舍内部处于一个短暂的微生物“真空期”，由于微生物的繁殖速度非常快，很多有害的细菌在20min内即可繁殖一代，造成一些在环境中能够增殖的微生物在很短时间内即可达到消毒前的数量，迅速抵消消毒的效果。

[0003] 枯草芽孢杆菌是农业部《饲料添加剂品种目录》所列的常见兽用微生物添加剂，对人和动物没有毒性，在生长过程中可以分泌具有广谱抗菌活性物质以及其它高活性的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶类，能够抑制有害细菌的生长。目前养殖中枯草芽孢杆菌多应用于动物胃肠道微生态调控方面，对于动物环境中有害微生物的抑制机制研究并不多见。发明专利201110267214.1的专利中，公开了一种畜舍及动物体表微生态环境改良的益生菌组合菌剂及应用方法，定期在畜舍内部喷洒益生菌菌剂，利用益生菌在畜舍内部快速的繁殖，快速的分解和利用粪污中的营养物质，分泌抗菌类物质，杀灭或抑制有害微生物的生长，从而减少了环境中有害微生物的数量。

[0004] 目前所使用的枯草芽孢杆菌均是采用实验室的富营养培养基分离而来。这些分离筛选出的枯草芽孢杆菌能够在良好的培养基、适宜的培养环境下快速高效的生长。但在具体应用到生产中，由于枯草芽孢杆菌喷撒到猪舍环境中后，所处的环境主要以猪粪便、尿液和残留饲料为主，发现枯草芽孢杆菌虽然能够在猪舍粪尿环境中繁殖生长，但是生长速度不快，难以发挥高效抑制有害微生物的效果。分析其主要原因是猪舍内部粪尿营养值较低，而目前大部分枯草芽孢杆菌均是在实验室富营养培养基中筛选分离而来，并不能很好的适应猪舍内部特定的粪尿环境。如何进一步提高枯草芽孢杆菌在粪尿培养基中生长繁殖是利用枯草芽孢杆菌来调控畜舍微生态平衡的关键点之一。

[0005] 为了解决现有技术中的问题，本发明在粪尿中分离了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，采用畜舍常见的动物粪便、尿液、饲料残留等作为培养基(粪便100g、尿液100ml、饲料5g，加水至1000ml，高压灭菌)来多代次筛选和驯化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SR001，保藏号为CGMCC No.11724，该菌株能够在畜舍环境中快速生长，用于改良猪舍微生态环境；尤其能显著抑制大肠杆菌生长。

[0006] 以此为基础还能够开发在畜舍快速生长，并具有广谱抗菌活性的益生菌制剂，通过定期的施用菌剂产品，来达到畜舍微生态改良的效果，降低畜舍内部有害细菌的数量，提高动物的健康水平，显著降低抗生素的使用量，推进养殖业向健康、环保、绿色的方向发展。

[0007] 本发明从健康母猪的新鲜粪便中分离出一株枯草芽孢杆菌，并采用粪尿培养基进行多代次传代培养和驯化，最终得到一株猪舍粪尿环境适应型枯草芽孢杆菌SR001。经实验证明，该株枯草芽孢杆菌能够很好的适用猪舍中特殊的环境，能够在粪尿培养基中快速生长繁殖，并形成良好的菌落。菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性。该株枯草芽孢杆菌在动物饲喂实验中，未见明显的毒副作用，适合在猪舍内部微生态环境改良中应用。

[0008] 一株猪舍粪尿环境适应型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SR001，于2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏号CGMCC No.11724,其16srDNA如SEQ.NO.1所示。
附图说明

[0009] 图1为SR001及对照组枯草芽孢杆菌粪尿培养基中生长曲线图。

[0010] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0011] 实施例1.SR001枯草芽孢杆菌的分离

[0012] 收集健康母猪新鲜猪粪，80℃的水浴处理30min，利用稀释涂布法在普通营养琼脂培养基上培养1-3天后观察。根据菌落形态和革兰氏染色进行初筛，再将初筛的枯草芽孢杆菌进行大肠杆菌共培养，筛选具有抑制作用的枯草芽孢杆菌进行16SrDNA测序进行最终确认。确定是枯草芽孢杆菌的菌株进行营养培养基培养备用。

[0013] (1)制备粪稀释液

[0014] 取健康母猪新鲜猪粪100g，装入无菌塑料袋中扎好。将粪样与100ml无菌生理水充分混合，振摇20min，80℃水浴1小时后取出。无菌吸取1ml粪样悬液加入盛有9ml无菌-1生理水的试管中，充分混匀，制成10 稀释度的猪粪溶液；以此类推，利用上述方法再分别-2 -3 -4 -5
制成10 、10 、10 、10 不同稀释度的猪粪溶液。

[0015] (2)涂布培养

[0016] 无菌吸取10-3、10-4、10-5不同稀释度的猪粪溶液各0.2ml滴在所述的普通营养琼脂培养基，用无菌涂布器涂布。将培养基平板倒置于30℃培养箱中培养1-3天。

[0017] (3)分离鉴定

[0018] 观察菌落形态，与标准菌株比对，去除非目的菌株；进行革兰氏染色，显微镜下观察；并挑选多株菌落进行16SrDNA序列测定，根据序列结果进行分析，选择一株枯草芽孢杆菌。

[0019] (4)传代驯化

[0020] 配制粪尿培养基：取新鲜猪粪(粪便100g、尿液100ml、饲料50g，加水至1000ml)，分装到锥形瓶，每瓶100ml，高压灭菌消毒备用。

[0021] 将分离鉴定的枯草芽孢杆菌1ml接种于锥形瓶的粪尿培养基中，37℃旋转培养24小时，80℃水浴1小时后取出，在无菌条件下取1ml接种于下一瓶中，如此反复进行传代100次。并对100代以上的枯草芽孢杆菌进行生长速度检测。

[0022] 对100代以上的枯草芽孢杆菌进行涂布筛选，旋转生长速度快，菌落大的菌落进行16SrDNA序列测定。将最终确定一株枯草芽孢杆菌。将其命名为SR001枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；于2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.11724。

[0023] 实施例2.SR001枯草芽孢杆菌的鉴定

[0024] 16S rDNA序列的PCR扩增引物设计

[0025] (3)PCR反 应 体 系 :10×PCR缓 冲 液( 含20mmol/L 的 Mg2+)5μL，20umol/L dNTP4μL，0.1OD/ml引物各1μL，5u/μLTaq酶1μL,ddH2O33μL,总DNA模板50μl。

[0026] 引物：7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；

[0027] 1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

[0028] 以提取的菌体基因组DNA为模板 进行16SrDNA的PCR扩增。PCR扩增反应体系25μL：DNA模板0.5uL、10×PCR buffer 2.5uL、dNTP(2.5mM)1uL、TaKaRa酶0.2uL、上下游引物(10Um)各0.5uL。

[0029] PCR反应条件：94℃变性4min、94℃变性45sec、55℃退火45sec、72℃延伸1min；30个循环；72℃延伸10min。反应结束后，取5uLPCR产物于1％琼脂凝胶中电泳，PCR产物经回收纯化后连入pGM2T载体，转化大肠杆菌DH5α细胞。选择转化的阳性克隆提取质粒，由上海生物工程公司完成测序，通过NCBI数据库搜索证明其与枯草芽孢杆菌同源性达到99.8％，结合其形态和生理生化特征指标，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为SR001枯草芽孢杆菌。

[0030] 实施例3 SR001枯草芽孢杆菌粪尿培养基中生长性能检测

[0031] 实验分为四组，分别选择未驯化枯草芽孢杆菌和SR001枯草芽孢杆菌进行粪尿培养基中的生长特性观察。粪尿培养基配制方法为：粪便100g、尿液100ml、饲料5g，加水至1000ml，分装到锥形瓶，每瓶100ml，高压灭菌消毒备用。二组枯草芽孢杆菌37℃摇菌培养
12小时，取1ml接种至粪尿培养基中37℃摇菌培养，每2小时取培养液1ml检测枯草芽孢杆菌密度。对照组枯草芽孢杆菌和SR001枯草芽孢杆菌在粪尿培养基中的生长曲线见图1，可见SR001枯草芽孢杆菌的生长速度显著快于未驯化枯草芽孢杆菌。

[0032] 实施例4.SR001枯草芽孢杆菌的应用

[0033] 1.急性毒性试验

[0034] 将SR001枯草芽孢杆菌接种培养培养基100mL中，37℃培养箱中培养12小时备用，每次每只小鼠最大给药量0.2mL/g，1d经口灌胃给药3次，经观察灌服SR001枯草芽孢杆菌发酵液的小鼠，24h后无死亡现象，也未出现任何明显的中毒现象。3d后处死小鼠，解剖观察其心、肝、脾、肺、肾，均无特殊改变。可见SR001枯草芽孢杆菌对小鼠并无明显的急性毒副作用。

[0035] 2.猪群喂养实验

[0036] 将SR001枯草芽孢杆菌接种培养培养基1000mL中，37℃培养箱中培养12小时备8
用，检测枯草芽孢杆菌的密度为2.1×10cfu/ml，按目前益生菌日常添加量剂量的100倍添加到饲料中，连续添加7天，从添加枯草芽孢杆菌开始的30天内密切观察猪只的生长情况。经观察灌服SR001枯草芽孢杆菌发酵液的猪只无死亡现象，也未出现任何明显的中毒现象。30天后屠宰猪只，解剖观察其心、肝、脾、肺、肾，均未发生明显改变。可见SR001枯草芽孢杆菌对猪只并无明显的急性毒副作用。

[0037] 3.猪舍环境抑制大肠杆菌实验

[0038] 实验设实验组和对照组，实验组在猪饲料中添加SR001枯草芽孢杆菌0.2亿/kg，连续饲喂15天；对照组不在饲料中添加枯草芽孢杆菌。15天后分别再猪栏内采集粪-1 -2 -3 -4 -5样100g，作10 、10 、10 、10 、10 不同稀释度的猪粪溶液，在麦康凯培养基中培养，计数
8
大肠杆菌数量。结果显示实验组粪尿中大肠杆菌密度为3.4×10/g，对照组大肠杆菌数量
8
为7.3×10/g。表明在饲料中添加枯草芽孢杆菌能够显著的降低猪舍环境中大肠杆菌的数量。