[0001] 本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体涉及一株可降解己烯雌酚的枯草芽孢杆菌。

[0002] 己烯雌酚（diethylstilbestrol, DES）是一种人工合成的非甾体雌激素类药物，曾被用作提高动物生产性能的药物。DES作为一种内分泌干扰物，能够引起肝脏损伤，发育早熟，基因突变以及激素失调，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。由于其对激素系统有影响，对机体具有慢性毒性，美国FDA和中华人民共和国农业部均规定禁止其使用于动物性食品生产。

[0003] 目前己烯雌酚的残留问题仍然很严重，加泰罗尼亚地区的污水处理厂排出的废水中DES的含量为34 ng/L，高舒榭等对南阳市市售鸡肉随机抽取检测的40份样品中均检出了DES，残留量最高的达10 mg/kg。动物养殖户违规使用，化学排放，污水处理厂和垃圾填埋场等都可能导致DES残留于动物性食品、水体和土壤环境中。近年来，降解或消除DES的方法已受到广泛关注。

[0004] 微生物降解法被认为是消除有害化合物污染的有效方法，筛选高效降解DES的功能微生物是实现减少或消除环境中DES的有效方法。

[0005] 本发明的目的是提供一株可有效降解己烯雌酚的菌株—枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JF。

[0006] 本发明所提供的降解菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JF，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 7950，保藏日期为2013年7月22日。

[0007] 所述枯草芽孢杆菌降解DES的步骤为：1）菌株JF活化：挑取枯草芽孢杆菌JF于LB培养基上划线，30 ℃培养24 h。

[0008] 2）菌株JF降解DES：用无菌生理盐水将LB培养基上的菌苔洗脱并混匀制备菌悬液。移取1 mL菌悬液接种于装有29 mL LB培养基（含0.2%吐温80）的250 mL三角瓶中，加入DES至一定浓度，以1 mL生理盐水代替菌悬液为空白对照。30 ℃、180 r/min振荡培养，定时取样，提取DES，采用HPLC测定DES降解率。

[0009] 所述微生物降解DES体系中DES的提取方法为：准确移取1 mL均匀培养液于10 mL刻度试管中，用甲醇定容至10 mL，于超声波清洗器（AS10200A）中超声提取20 min；混匀，取1.5 mL 样品12 000 r/min离心15 min，将上清液用0.45 μm 有机相滤膜过滤，弃去初滤液约0.5 mL，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，分析仪器为LC-10A2010C HT型高效液相色谱仪。

[0010] 所述微生物降解体系中DES检测方法为：LC-10A2010C HT型液相色谱系统，Sepax GP-C18柱（150 mm×4.60 mm，5.0 μm）为色谱柱，甲醇:水（7:3;v/v）为流动相，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，用紫外检测器在242 nm处检测。

[0011] 本发明所用培养基为LB培养基：酵母膏 5 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 10 g、水1000 mL，调节pH至7.0，121 ℃灭菌15 min。

[0012] 与现有技术相比，本发明的积极效果是：枯草芽孢杆菌属于“公认安全”的菌种，该枯草芽孢杆菌降解DES，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境中的DES残留提供了良好的菌源和思路。附图说明

[0013] 图1为降解菌株JF处理前后DES的HPLC谱图，图中0 h为含接种JF的25 mg/L DES的LB培养基中立刻取样处理得到的HPLC检测的色谱图，5 d为培养5 d后取样处理得到的HPLC检测的色谱图。

[0014] 图2为降解菌株JF作用于25 mg/L DES的降解曲线。

[0015] 图3为降解菌株JF对不同浓度DES的降解能力。

[0016] 实例1：不同培养时间对菌株JF降解DES的情况。

[0017] 种子液制备：挑取JF菌种于LB平板上划线，于30 ℃恒温培养箱中培养24 h后挑取单菌落在LB斜面培养基上划线，30 ℃恒温培养箱中培养24 h；用无菌生理盐水将斜8
面培养基上的JF菌苔洗脱并混匀制成种子液（菌浓度约为10 CFU/mL）。

[0018] 取1 mL种子液接种于250 mL三角瓶装有29 mL DES浓度为25 mg/L的含0.2%吐温80的LB培养基中，以1 mL生理盐水代替种子液为空白对照，30 ℃、180 r/min 振荡培养9 d，每24 h取样，用甲醇作提取溶剂，超声提取，HPLC检测DES浓度。降解菌株JF处理前后DES的HPLC谱图如图1所示；降解菌株JF作用于25 mg/L DES的降解曲线如图2所示。菌株JF对DES具有明显的降解作用，9 d内可完全降解25 mg/L DES。

[0019] 所述DES提取方法为：准确移取1 mL均匀培养液于10 mL刻度试管中，用甲醇定容至10 mL，于超声波清洗器（AS10200A）中超声提取20 min；混匀，取1.5 mL 样品12 000 r/min离心15 min，将上清液用0.45 μm 有机相滤膜过滤，弃去初滤液约0.5 mL，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，检测仪器为LC-10A2010C HT型高效液相色谱仪。

[0020] 所述HPLC检测方法为：LC-10A2010C HT型液相色谱系统，Sepax GP-C18柱（150 mm×4.60 mm，5.0 μm）为色谱柱，甲醇:水（7:3 v/v）为流动相，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，用紫外检测器在242 nm处检测。

[0021] DES降解率的计算公式为：式中：C0为空白对照中DES浓度（mg/L）；C为培养液中DES残留浓度（mg/L）。

[0022] 所述培养基为：LB培养基：酵母膏 5 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 10 g、水1000 mL，调节pH至7.0，121 ℃灭菌15 min。

[0023] 实例2：降解菌株JF对不同浓度DES的将降解情况。

[0024] 取1 mL种子液接种于250 mL三角瓶装有29 mL DES浓度为分别10、25、50、80 mg/L的含0.2%吐温80的LB培养基中，以1 mL 生理盐水代替种子液为空白对照，30 ℃、180 r/min 振荡培养5 d，分别于0 h和培养的第5 d取样，甲醇超声提取，HPLC检测DES浓度。所述的DES提取方法和HPLC检测方法同实施事例1。降解菌株JF对不同浓度DES的降解情况如图3所示，菌株JF对10-80 mg/L的DES均有一定程度的降解作用，10 mg/L的DES可在5 d内被菌株JF完全降解，随着DES浓度的增加，菌株JF对DES的降解速率降低。

[0025] 以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。