[0001] 本发明涉及微生物筛选技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用。

[0002] 随着植物种类的不断增多，植物栽培方式的不断多样化，植物病害日趋严重，而传统的化学防治方法存在着许多弊端，比如：化学农药的大量使用引起了严重的环境污染，农产品的农药残留也越来越严重，病菌抗药性产生速度也越来越快等一系列对人民生活有害的影响。在当今倡导低碳经济、环保节约型社会中，寻求能保护人类生活又可增产的新技术十分适应当今社会的发展。

[0003] 生物防治是利用一种生物或其产物对付另外一种生物的方法，分为以虫治虫、以菌治虫、以菌治菌三大类。它利用了生物物种间的相互关系，以一种或一类生物或其产物抑制另一种或另一类生物。生物防治的方法有很多，微生物防治就是其中一种。微生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物间的竞争作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及诱导抗性等，来抑制某些病原物的存活和活动，其优越性在于资源丰富、选择性强、无残留、无污染、成本低，兼防兼治、增产增收、保持生态平衡，起到长效的作用。

[0004] 用于生物防治的微生物主要包括真菌、细菌、放线菌和酵母菌等很多生物种群，其中真菌主要包括木霉、毛壳菌、青霉菌、菌根真菌等，细菌主要包括芽孢杆菌、假单胞菌、土壤放射杆菌等。其中，芽孢菌的抑菌范围很广，包括根部病害、枝干病害、叶华部病害和和收获后果品病害，如棉花枯萎病、黄萎病、立枯病等。由于其具有内生芽孢，抗逆性强，营养需求简单，繁殖速度快，并在植物根圈易于定殖，所以被广泛应用于植物病害的生物防治中。目前应用于生防的芽孢杆菌种类主要有枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。

[0005] 利用拮抗微生物防治植物病害是当今植物病理学界十分活跃的研究领域之一。实践证明，引进对病原菌有拮抗作用的细菌防治植物病害，是一种经济有效且无副作用的防治途径。在植物的生长环境中有丰富的微生物种类，开发有益芽孢杆菌潜力很大，但生防芽孢杆菌防病效果有时不稳定，不同区域筛选到的芽孢杆菌其防病效果差异很大，所以开发更多有益的芽孢杆菌是研制生防菌剂的重点之一。

[0006] 本发明为解决现有技术问题，提供了一种枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌是从蔬菜大棚的土壤中筛选分离到的，具有很强的抑菌效果，能有效防治植物病害。

[0007] 本发明一方面涉及一种枯草芽孢杆菌FX1(Bacillus subtilis FX1)，已于2014年11月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：
M2014563。

[0008] 本发明一方面涉及一种生防制剂，包含上述枯草芽孢杆菌FX1。

[0009] 本发明还涉及上述生防制剂在植物病害防治中的应用。

[0010] 所述植物病害为黄瓜白粉病、草莓白粉病、葡萄褐斑病、植物黄腐病和果腐病中的任意一种。

[0011] 所述生防制剂在植物病害防治中的应用，具体方法为将生防制剂稀释0-700倍，优选500-700倍。

[0012] 本发明从蔬菜大棚的土壤中筛选到了一株新型枯草芽孢杆菌FX1。所述菌株具有很强的抑菌效果，可广泛应用于植物病害的防治。所述菌株对黄瓜白粉病的防治效率高达95.5％，对草莓白粉病的防治效率高达94.8％，对葡萄褐斑病的防治效率高达83.2％。除了植物白粉病和褐斑病外，所述枯草芽孢杆菌FX1还对由镰刀菌和立枯丝核菌引起的植物黄腐病和果腐病均有明显的拮抗作用，防治效率能达到80％以上，前景广阔。

[0013] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

[0014] 实施例1 菌株筛选与分离

[0015] 1、土样稀释液的制备：

[0016] 从海阳北城阳村蔬菜大棚取回土壤，称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤
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溶液，以此方法类推，制备1：10-10 的土壤稀释溶液。

[0017] 2、菌株分离与纯化：

[0018] 取3-4个适宜浓度的稀释液0.1ml均匀涂布于营养琼脂培养基上；37℃培养2d后取出，挑取单个菌落继续分离纯化，直至每个平板上长出的菌落形态颜色一致，即为单一菌株。

[0019] 采用上述方法，申请人共筛选出12株菌，分别命名为FX1、FX2、FX3、……FX12。

[0020] 3、病原菌对峙实验：

[0021] 在PDA平板中心处接种直径约为5mm的单丝壳白粉菌(该菌为黄瓜白粉病的主要病原菌之一，是由发明人苑伟伟于2013年6月筛选自青岛市城阳区惜福镇黄瓜种植大棚中)菌饼；在PDA平板的四个角上分别接种等量的菌株FX1、FX2、FX3、……FX12，30℃培养3天后，观察对峙效果。根据抑制圈的大小进行筛选，申请人共得到四株对单丝壳白粉菌具有较强抑制作用的菌株，分别为FX1、FX4、FX6和FX10。

[0022] 实施例2 黄瓜白粉病防治效果验证实验

[0023] 1、菌液制备

[0024] 将筛选到的四株菌FX1、FX4、FX6、FX10分别接种于营养肉汤培养基，30℃培养2-38 9
天，得到活菌含量为10-10cfu/ml的菌液。

[0025] 2、实验过程

[0026] 1)实验组：分别使用相同用量的FX1、FX4、FX6、FX10四株菌喷洒黄瓜叶片；每株菌设三个处理组，每个处理组为随机选择的两垄黄瓜，共100棵，各处理组之间设置保护行。

[0027] 在黄瓜的生长中期，将上述菌液分别加水稀释500倍后，均匀喷洒在各处理组的黄瓜叶片上；每次喷洒间隔7天，连用三次；最后一次喷洒完菌液10天后，检查各处理组黄瓜白粉病的发病情况。

[0028] 2)对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基喷洒黄瓜叶片，其他操作与实验组均相同。

[0029] 3、结果分析

[0030] 病害分级标准：0级无病斑；1级：病斑面积占叶面积的1/4以下；2级：病斑面积占叶面积的1/4-2/4；3：病斑面积占叶面积的2/4-3/4；4级：病斑面积占叶面积的3/4以上。

[0031] 病情指数＝[∑(病级值×该级发病叶数)/(调查总叶数×最高病级值)]×100％

[0032] 防治效率的计算公式＝[1-(处理的病情指数/对照的病情指数)]×100％。

[0033] 以SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果如表1所示：

[0034] 表1 黄瓜白粉病防治试验

[0035]

[0036] 从表1的数据可以看出，本发明筛选到的FX1菌株对黄瓜白粉病的防治效率最高，为95.5％，可作为生防制剂广泛应用于黄瓜白粉病的防治。

[0037] 实施例3 FX1菌株的鉴定

[0038] 1)FX1菌株的生理和生化特性：

[0039] 菌落扁平，表面粗糙不透明，污白色，芽孢大小0.6-0.9×0.9-1.4μm，椭圆形或柱状，中生或近中生；革兰氏反应阳性，过氧化氢酶反应阳性，V.P反应阳性，淀粉水解阳性，明胶液化阳性，分解酪素阳性，生长温度范围25-40℃，pH范围5-8。

[0040] 2)FX1菌株的分子生物学鉴定：

[0041] 采用分子生物学的方法对上述筛选得到的FX1菌株进行鉴定，测得其16s rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行blast比对。结合FX1菌株的生物学特性和16srDNA比对结果，申请人确认FX1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌FX1(Bacillus subtilis FX1)。

[0042] 申请人已于2014年11月12日将上述枯草芽孢杆菌FX1(Bacillus subtilis FX1)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014563。

[0043] 实施例4 枯草芽孢杆菌FX1在防治草莓白粉病中的应用

[0044] 1、菌液制备

[0045] 将枯草芽孢杆菌FX1接种于营养肉汤培养基，30℃培养2天，得到活菌含量为8 9
10-10cfu/ml的菌液。

[0046] 2、使用方法

[0047] 1)实验组：三个处理组，每个处理组10垄草莓，共1200棵，每个处理组之间设立保护行；

[0048] 在草莓开花初期，将枯草芽孢杆菌FX1加水稀释300、500、700倍后，分别均匀喷洒在草莓叶片反正面及瓜茎上；每次喷洒间隔7天，连用三次；最后一次喷洒完菌液10天后，检查草莓白粉病的发病情况。

[0049] 2)对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基，其他操作与实验组均相同。

[0050] 采用与实施例2相同的方法对实验数据进行分析，结果如表2所示：

[0051] 表2 枯草芽孢杆菌FX1对草莓白粉病的防治效果

[0052]

[0053] 从表2的数据可以看出，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌FX1也能有效防治草莓白粉病，当菌液稀释至700倍时，该菌株对草莓白粉病的防治效率仍能高于92％，效果非常显著。

[0054] 实施例5 枯草芽孢杆菌FX1在防治葡萄褐斑病中的应用

[0055] 1、菌液制备

[0056] 将枯草芽孢杆菌FX1接种于营养肉汤培养基，30℃培养2天，得到活菌含量为8 9
10-10cfu/ml的菌液。

[0057] 2、使用方法

[0058] 1)实验组：三个处理组，每个处理组2垄葡萄，共100棵，每个处理组之间设立保护行；

[0059] 选取生长三年的葡萄苗，在开花初期，将枯草芽孢杆菌FX1加水稀释300、500、700倍后，分别均匀喷洒在葡萄叶片反正面上；每次喷洒间隔7天，连用三次；最后一次喷洒完菌液10天后，检查葡萄褐斑病的发病情况。

[0060] 2)对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基，其他操作与实验组均相同。

[0061] 采用与实施例2相同的方法对实验数据进行分析，结果如表3所示：

[0062] 表3 枯草芽孢杆菌FX1对葡萄褐斑病的防治效果

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