在韩国专利第1998-0012807号、第2001-0063465号及第2003-0079546 号申请案中已揭露利用枯草芽孢杆菌来防治植物病害的方法。针对线虫 (Nematoda)具有杀虫(insecticidal)功效的菌株也已经在韩国专利第 2002-004324号及第2002-004325号申请案中有所揭露。而针对昆虫具有 杀虫功效的菌株也已在韩国专利第2002-0017167号及第2004-7007871号 申请案中有所揭露。并且，在韩国专利第2003-0005335号申请案中，揭露 了一种包含缓慢病杆菌的微生物农药及该微生物的突变株。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639、 KCCM-10640以防治植物病害。
本发明的另一目的是提供一种新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639、 KCCM-10640以有效地防治草坪病害。
本发明再一目的是提供一种微生物制剂以防治植物病害，其包含有一 种新菌株枯草芽孢杆菌KCCM 10639及/或KCCM 10640的纯培养物(pure culture)，以作为一种活性成分，以及利用该微生物制剂来防治植物病害的 方法。
本发明提供新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及KCCM-10640以 促进植物的生长。
同时，本发明提供一种微生物制剂以防治植物病害，其包含有一种新 菌株枯草芽孢杆菌KCCM 10639及/或KCCM 10640的纯培养物(pure culture)，以作为一种活性成分。
有利的功效：
根据本发明新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及KCCM-10640，其 具有抑制植物病害发生的杰出功效。特别是，本发明的微生物形成了抵抗 孢子(resistant spores)，因此，一种微生物制剂可从该微生物中轻易地制备 出来并具有生物稳定性。同时，新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及 KCCM-10640对于目前经常使用的农药显现出抗药性(resistance)，因此， 其可用来与农药交替使用或同时使用。此外，本发明的菌株在各种病害产 生条件下具有杰出的生长能力，并显现出杰出的定殖土壤(colonize soil)的 能力。因此，根据本发明的微生物制剂，其是具有防治植物病害的杰出能 力，特别是针对草坪病害。
附图说明
图1是显示一种用3,500x电子显微镜下的枯草芽孢杆菌KCCM 10639 (图A)的图片，以及用400x光学显微镜下的枯草芽孢杆菌KCCM 10639(图 B)的图片，而抵抗孢子(resistant spore)部分是以圆圈标示；
图2是显示一种电子显微镜下的枯草芽孢杆菌KCCM 10640的图片， 其中图A为5,000x；及图B为10,000x；
图3是显示枯草芽孢杆菌KCCM 10639相对于立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的对抗功效，此图3是在培养皿中央接种后的KCCM 10639呈一线 形所拍的图片，放置在该琼脂培养皿两端有立枯丝核菌在其中生长，并在 该培养皿培养了两天；
图4是显示枯草芽孢杆菌KCCM 10639相对于腐霉真菌(Pythium sp.) 的对抗功效，其中左图显示一对照组(control group)，而右图显示该腐霉真 菌的生长是被抑制的，当KCCM 10639被培养在该培养皿中央呈一线形；
图5是显示枯草芽孢杆菌KCCM 10640相对于立枯丝核菌的抗菌活 性，其中图A是与枯草芽孢杆菌KCCM 10640一起培养；图B则是一对 照组(control group)；
图6是显示枯草芽孢杆菌KCCM 10640相对于腐霉真菌的抗菌活性， 其中图A是与枯草芽孢杆菌KCCM 10640一起培养；图B则是一对照组 (control group)；
图7是显示相对于小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的拮抗功效，其 中图A是用枯草芽孢杆菌KCCM 10639；图B则是用枯草芽孢杆菌 KCCM-10640；
图8是显示一种不具有植物致病性的微生物制剂；
图9是显示该微生物制剂在抑制草坪病害的功效；
图10是显示该微生物制剂具有抑制病害发展的功效，当被用来治疗 (treat)受病原菌污染之土壤时。

本发明是提供一种新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及 KCCM-10640。
同时，本发明是提供一种微生物制剂，用以防治植物病害，其包含有 一种新菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及/或KCCM-10640的纯培养物 (pure culture)，以作为一种活性成分。
根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株是可用来作为一微生物制剂，利用其 自身的菌株、或一培养物、粹取物、或其孢子，与一媒介物(carrier)加以混 合，以制剂成粉状剂、药丸、细粒或溶剂，用以防治植物病害。于此，该 媒介物(carrier)可选自组群包含水、白炭黑(white carbon)、高岭土(kaolin)、 沸石(zeolite)、及其类似物。
此微生物制剂可用来治疗(treat)不论是具有植物生长的土壤，或是生 长植物的表面，因而防止藉由植物病害所引起的植物生长抑制，及导致植 物细胞自毁(plant apoptosis)的后果。
本发明提供一种利用该微生物制剂来防治植物病害的方法。
以下，本发明会藉由参考范例加以详细描述如下，因此可更加了解， 然而这些范例仅作为说明之用，并非用以推断本发明所限制的范围。
【发明模式】
实施例一：菌株的分离、鉴定及特征
新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639或KCCM-10640是选自目前韩 国全国高尔夫球场绿地及球道的表土层(大约10cm)。针对本发明目的， 选择了形成抵抗孢子(resistant spores)并显示出杰出抗菌活性的菌株。同时， 选取对现有农药显现出杰出的抗药性菌株。
在所选取的菌株当中，具有杰出功效的微生物被离析及鉴定出来，结 果鉴定出两种枯草芽孢杆菌菌株，这两种枯草芽孢杆菌菌株已在2004年 12月28日寄存在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，其微生物保藏号码分别为KCCM-10639及 KCCM-10640。
新的菌株KCCM-10639及KCCM-10640的共同特征
(1)这些菌株是与生俱来的菌株，生长在高尔夫球场植物的根际 (rhizosphere)及叶际(phyllosphere)。
(2)他们是抵抗孢子形成的菌株，因此微生物制剂可以从该菌株轻易 地制备出来，并且为生物学安定的。
(3)他们不会被现有的农药所杀死，因此可用来与农药替换使用。
(4)他们具有杰出的生物学的抗菌活性以防治植物病害。
(5)他们具有杰出的活性可在各种病害产生的环境下生长。
(6)他们具有杰出的生存及生长能力，只要利用切下的草坪作为食物 即可。
(7)他们具有杰出的土壤定殖能力。
1.新的菌株KCCM-10639及KCCM-10640培养的特征
这些菌株是培养在一PDA(含有300g的马铃薯汁、20g的葡萄糖、15 g的琼脂、及1L的蒸馏水)中，且适合生长的pH值为pH5-9，而对于生 长为最佳的pH值大约为pH7。同时，适合生长的温度为15-30℃，而对 于生长最佳的温度则大约为25℃。他们在高好氧的条件下生长，并在48 小时的培养过程中诱导生产出抵抗孢子。
2.形态特征
他们具有杆状的形态，能产生抵抗孢子，且其具有水解淀粉的能力， 并且为活动的。图1是显示新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639在电子显 微镜下的图片(A)，以及光学显微镜下的图片(B)。在图1中，相对应于抵 抗孢子部分是以圆圈标示。图2是显示新的菌株枯草芽孢杆菌 KCCM-10640在电子显微镜下的图片(其中图A为5,000x；及图B为 10,000x)。
3.分类
该菌株是在以16s rDNA为基础序列分析下执行，结果，这些菌株是 显示出与枯草芽孢杆菌在NCBI之rDNA序列为99.9％的同源性，因此是 被鉴定为枯草芽孢杆菌。
实施例二：检测防治植物病害的功效
针对抑制立枯丝菌核病(Rhizoctonia diseases)(巨斑病、褐斑病及春季 死班病)及腐霉枯萎病(Pythium disease)的功效，本发明菌株进行了检测， 这些病害是在高尔夫球场的绿地及球道上所产生的草坪病害。
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是用来检测防治立枯丝菌核病 (Rhizoctonia diseases)的功效，而腐霉真菌(Pythium sp.)则是用来检测防治 腐霉枯萎病(Pythium disease)的功效。将一种火焰灭菌圈环(flame-sterilized loop)轻轻地沾染该培养的拮抗细菌(antagonistic bacteria)，再轻轻地将琼脂 营养汤培养基(nutrient broth agar)涂抹该沾染的圈环2-3次。作为目标的细 菌病原体(pathogenic bacteria)丝核菌(Rhizoctonia spp.)及腐霉真菌 (Pythium sp.)被分离在直径为8mm的不同培养皿上，并置于NB培养基的 两侧。当细菌在25℃下培养2-3天后，可观察到本发明菌株针对于每一种 目标菌株病原体(pathogenic strains)的拮抗功效(antagonistic effect)。
图3是显示枯草芽孢杆菌KCCM-10639相对于立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的对抗功效。图3是在接种后KCCM-10639放在培养皿中央呈一 线形所拍的图片，放置在该琼脂培养皿两端有立枯丝核菌在其中生长，并 培养该细菌两天。
图4是显示显示枯草芽孢杆菌KCCM-10639相对于腐霉真菌(Pythium sp.)的拮抗功效(antagonistic effects)。在图4中，左图是呈现一对照组 (control group)，而右图则呈现当KCCM-10639被培养在该培养皿中央呈 一线形时，该腐霉真菌的生长是被抑制的。
图5是显示枯草芽孢杆菌KCCM-10640相对于立枯丝核菌的抗菌活 性。其中图5A是显示与枯草芽孢杆菌KCCM-10640一起培养时；图5B 则是一对照组(control group)。
图6是显示枯草芽孢杆菌KCCM-10640相对于腐霉真菌的抗菌活性， 其中图6A是显示与枯草芽孢杆菌KCCM-10640一起培养时；图6B则是 一对照组(control group)。
图7是显示相对于小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的拮抗功效 (antagonistic effects)，在图7A是用枯草芽孢杆菌KCCM-10639；在图7B 则是用枯草芽孢杆菌KCCM-10640；
实施例三：检测对于习知杀菌剂(农药)的抗药性
(1)以实验方式进行
(i)进行实验之前，先制备琼脂营养汤培养基(nutrient broth agar) 培养基培养2-3天。
(ii)制备无菌水(蒸馏水)，然后将所推荐的份量的农药溶解于无菌 水(蒸馏水)之中。
(iii)将步骤(ii)100之溶液以滤纸吸收后，接着弄干。然后，将 滤纸置于100的smear培养基之中，接着，将该培养基密封并在25℃的 温度下培养2天。至于对照组(control group)则利用蒸馏水。
(iv)观察检验结果。
(v)视滤纸周围是否产生一清晰区(clear zone)(抑制生长区 growth-inhibitory zone)来测定为该细菌是否生长的根据。
(vi)当没有清晰区产生时，可测定该拮抗菌株对于农药是具有抗药 性；然而当产生清晰区时，则可测定该拮抗菌株是被农药所影响。在这种 情况下，将该清晰区的直径测量出来并记录下来。
(2)结果
该新的枯草芽孢杆菌KCCM-10639及KCCM-10640是显示出对于习 知杀真菌剂是具有抗药性的，该习知的杀真菌剂以及该新菌株对于该杀真 菌剂的抗药性是分别说明于下列表一中。
【表一】
                                                            使用浓度 
活性成分       产物            商标              抗药性
                                                            (/100ml)
               多抗霉素D，     
抗生素                         Youngil-bio       强          0.2g
               可湿性粉剂
               氯苯嘧啶醇，
嘧啶                           Fenarimol         强          33.5
               可乳化浓缩
               戊唑醇，
三唑                           Silbaco           强          0.05g
               可湿性粉剂
               戊唑醇，
三唑                           Horicoor          中-强       50 
               可乳化浓缩
               硫菌灵，
氨基甲酸酯                     Topsinmzopnate-M  强          0.065g
               可湿性粉剂
               Azzigaren，
异恶唑                              Aoneipcodan         强         2
               可湿性粉剂
               Tros，
有机磷                              Rizolex             强         0.2g
               可湿性粉剂
               乙磷铝，
有机磷                              Aliette             强         0.2g
               可湿性粉剂
               甲基代森锌，
有机硫                              Anthracol           中-强      0.2g
               可湿性粉剂
               黄樟素
有机氯                              -                   中-强      100
               可乳化浓缩
               戊菌隆，
尿液                                Moongobaksa         强         0.1g
               可湿性粉剂
               甲霜灵，
酰基丙氨酸                          Lidomil             中-强      0.005g
               可湿性粉剂
               Protonyl，
酰苯胺                              Moncut              强         100
               可乳化浓缩
               嘧菌酯，
嗜球果伞素                          Heritage            强         0.1g
               可湿性粉剂
               异菌脲，
二羧酰亚胺                          Robral              强         0.1g
               可湿性粉剂
氨基甲酸酯+    
               福美双，             
二硫代氨基                          Homai，Kumnarac     弱         0.1g
                可湿性粉剂
甲酸酯
酰基丙氨酸+    恶霜灵，      
                                    Sandophan-A         中-强      0.2g
有机硫         可湿性粉剂
酰基丙氨酸+
               甲霜灵，             
二硫代氨基                          Lidomil-MG          弱         0.165g
               可湿性粉剂
甲酸酯
实施例三：对于植物致病性的证明
根据本发明的细菌病原体(Pathogenic bacteria)及微生物是同时接种在 草坪中，并测定本发明微生物在草坪上是否导致病害。此检测结果是显示 在图8中，结果，观察出本发明微生物是可抑制细菌病原体的生长，但并 不会感染草坪，也就是说，本发明的微生物对于草坪是非病原体 (non-pathogenic)，并具有杰出的抗菌活性。
实施例四：微生物制剂(microbial formulation)的制备
(1)制备培养液
(i)将8g的营养汤(nutrient broth)粉末均匀混合在含有0.5-1.0ml硅油 (silicone oil)的1L水中。
(ii)将该混合物在121℃的温度下加压15分钟，然后接种0.1-2ml的 拮抗细菌于其中。
(iii)将接种的溶液在25℃的温度下培养4天，然后收集该培养液。
(2)制备细粒
(i)将上述所收集1L的培养液均匀地混合在5kg的沸石(zeolite)之 中。
(ii)将该混合液在一造粒机(granulating machine)之中以40℃的温度风 干一天，然后收集风干后的细粒。
实施例五：检测本发明微生物制剂在抑制草坪病害上功效
针对在范例四中所制备的微生物制剂，检测其对于防治植物病害的功 效，在一人造的植物生长腔室自动控制系统中，其中环境因素(例如：光线、 温度、湿度等)被控制在如实际田地的相同标准。当腐霉真菌(Pythium sp.) 及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)接种在草坪后，并以在范例四中所制备的 微生物制剂来治疗，在草坪上所产生的病害可被抑制达87-95％(请参阅图 9)。同时，当土壤受腐霉真菌(Pythium sp.)污染后，使用在范例四中所制备 的微生物制剂时，病害的产生可被抑制高达100％(请参阅图10)。
【工业应用】
如上面所述，根据本发明新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及 KCCM-10640是具有抑制植物病害发生的杰出功效，特别是，本发明微生 物可形成抵抗孢子，因此，从该微生物可轻易地制备出一种微生物制剂， 并且是生物学稳定的。同时，此新的菌株枯草芽孢杆菌KCCM-10639及 KCCM-10640对于目前最常用农药是显现出抗药性，因此，可与农药替换 使用或同时使用。此外，本发明菌株具有可在各种病害产生的环境下生长 的杰出能力，并可显现出杰出的土壤定殖能力。因此，本发明所述的微生 物制剂是具有可防治植物病害杰出的能力，特别是草坪病害(turfgrass diseases)。