바실러스 리케니포미스 Ｂ1 균주, 호알칼리성 효소액 및 이것의 제조방법

바실러스 리케니포미스 Ｂ1 균주, 호알칼리성 효소액 및 이것의 제조방법{Bacillus licheniformis B1, Alkalophilic Enzyme Solution and Method of Producing The same}

본 발명은 바실러스 리케니포미스 B1( Bacillus licheniformis B1) 균주에 대한 것으로, 특히 바실러스 리케니포미스 B1 균주를 이용하여 pH 10~13에서 최적의 활성을 나타내는 셀룰라아제(cellulase)를 생산하는 것에 대한 것이며, 이를 통하여 알칼리 환경에서 우수한 활성을 가지는 다양한 용도로 사용하기 위한 것이다.

종래부터 한국에서는 전통 발효식품인 청국장이 정장, 혈액순환 개선 등의 기능성 식품으로서 부각되고 있다. 청국장은 나라에 따라 템페, 두시, 키네마, 낫도로 불리기도 한다. 청국장은 대두 발효식품으로, 발효가 되면서, 대두에 없었던 미생물, 효소, 다양한 생리활성물질이 새롭게 만들어진다(이재중 등, 1999, Bacillus licheniformis B1에 의한 청국장 및 간장 발효, 미생물학회지 35, 296-301). 청국장 발효는 바실러스 속에 의해 이루어지는데, 청국장 속의 한 효소인 바 실러스 단백질분해효소는 일본에서는 낫도키나제라고 불리며, 인체에서 혈전용해 효과가 있다고 알려져 있다(Sumi, H., H. Hamada, K. Nakanishi, and H. Hiratani. 1990. Enhancement of the fibrinolytic-activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol . 84, 139-143).

그러나, 상기와 같이 대두가 발효된 청국장에는 점질성의 폴리글루타믹산이나 프로테아제가 존재한다는 사실이 널리 알려져 있지만, 청국장에서 탄수화물을 분해하는 셀룰라아제(cellulase)에 대한 연구는 많지 않다. 고분자 탄수화물이 분해된 oligosaccharide는 다양한 생리활성을 지니고 있기 때문에, 유용한 특성을 가지는 셀룰라아제를 생산하는 새로운 방법과 균주에 대한 연구는 항시 필요한 실정이다.

본 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-0368183호(발명의 명칭: 바실러스 리케니포미스 비1 균주 및 이의 이용)를 통하여, 다량의 프로테아제와 아밀라아제를 분비하고 생장함에 따라 폴리글루탐산(Poly Glutamate)으로 알려진 바이오폴리머를 대량으로 생산하는 바실러스 리케니포미스 B1(Bacillus licheniformis B1) 균주 (KCTC 0755BP)와 상기 균주를 이용한 청구장 및 간장의 제조방법을 제공한 바가 있다.

본 발명자들은 수년간의 연구와 노력 끝에, 상기와 같은 청국장 발효균주 바실러스 리케니포미스 B1(Bacillus licheniformis B1)으로부터 탄수화물을 분해하는 셀룰라아제(cellulase)가 생성됨을 확인하였고, 이러한 셀룰라아제가 알칼리성 환경(pH 10~13)에서 최적의 활성을 나타내는 β-1,4-glucanase임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 알칼리성 pH 범위에서 활성이 높은 셀룰라아제를 생산하는 새로운 바실러스 리케니포미스 B1 균주를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 바실러스 리케니포미스 B1 균주로부터 유도된 셀룰라아제(cellulase)를 포함하여, 알칼리성 pH 범위에서 최적의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 호알칼리성 효소액을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 목 적은 상기한 균주를 배양하고 원심분리하여 알칼리성 pH 범위에서 최적의 활성을 나타내는 셀룰라아제가 포함된 호알칼리성 효소액을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 이를 통하여, 본 발명은 바실러스 리케니포미스 B1 균주로부터 생산되는 효소의 알칼리 환경에서 우수한 활성을 가지는 용도를 제공함에 있다.

이를 위한 본 발명의 첫 번째 실시형태는, pH 10~13에서 최적의 활성을 나타내는 셀룰라아제(cellulase)를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 리케니포미스 B1( Bacillus licheniformis B1) 균주 KCTC 0755BP이다.

본 발명의 두 번째 실시형태는, 바실러스 리케니포미스 B1( Bacillus licheniformis B1)으로부터 유도된 셀룰라아제(cellulase)를 포함하여, pH 10~13에서 최적의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 호알칼리성 효소액이다.

여기서, 상기 바실러스 리케니포미스 B1는 신균주 KCTC 0755BP 인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 pH 10~13에서 최적의 활성을 나타내는 것은, pH 3~7보다 pH 10~13에서 더 높은 효소 활성 수치를 가지는 것을 의미할 수 있고, 또는 pH 13에서 80%이상의 효소 활성 수치를 가지는 것을 의미하는 것도 가능하다.

또한, 상기 셀룰라아제는 10~460번째 아미노산 영역 중 10~38번째에 신호서 열(siganl sequence)이 위치하고, 상기 신호서열의 아미노 말단에 Lys-Arg과 같은 염기성 아미노산의 반복 영역 및 소수성 영역(hydrophobic region)이 위치하는 아미노산 배열을 가지는 β-1,4-glucanase 인 것이 바람직하다.

본 발명의 세번째 실시형태는, 바실러스 리케니포미스 B1( Bacillus licheniformis B1) 균주 KCTC 0755BP를 셀룰로오스(cellulose)를 기질로 하여 배양한 후 원심분리하여 상등액을 얻는 단계; 상기 얻은 상등액을 다시 원심분리하여 3,000 Da 이상의 물질을 분리하는 단계;를 통하여, pH 10~13에서 최적의 활성을 나타내는 셀룰라아제(cellulase)가 포함된 것을 특징으로 하는 호알칼리성 효소액의 제조방법이다.

기타 실시예는 후술하는 발명의 상세한 설명 및 도면에 기재되어 있다.

상기와 같은 본 발명은 알칼리성 pH 범위에서 활성이 높은 셀룰라아제를 생산하는 바실러스 리케니포미스 B1 균주를 제공할 수 있다. 또한, 바실러스 리케니포미스 B1 균주로부터 유도된 셀룰라아제(cellulase)를 포함하여, 알칼리성 pH 범위에서 최적의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 호알칼리성 효소액을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 균주를 배양하고 원심분리하여 알칼리성 pH와 염기성 범위에서 최적의 활성을 나타내는 셀룰라아제가 포함된 호알칼리성 효소액을 제조하는 방법을 제공하는 것도 가능하다.

이하, 첨부된 도면을 참조로 하여, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 종래에 단백질분해효소를 생산하는 것으로 널리 알려진 청국장 발효균주 바실러스 리케니포미스 B1(Bacillus licheniformis B1)으로부터 탄수화물을 분해하는 셀룰라아제(cellulase)가 생성됨을 확인하였고, 이러한 셀룰라아제가 알칼리성 환경(pH 10~13)에서 최적의 활성을 나타내는 β-1,4-glucanase임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 따라, 본 발명은 알칼리성 pH와 염기성 범위에서 활성이 높은 셀룰라아제를 생산하는 바실러스 리케니포미스 B1 균주에 대한 것이고, 이러한 본 발명에 따라 생산된 효소 및 이를 포함하는 효소액은 알칼리 환경에서 우수한 활성을 가짐으로써, 세제(detergent) 또는 바이오연료와 같은 다양한 용도에 활용될 수 있는 것이다.

후술하는 본 발명의 실시예 및 실험예에서 종균으로 사용한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) B1은 본 발명자가 출원번호 제2000-18724호로 특허출원하여 등록 제0368183호로 특허받은 KCTC 0755BP 균주이다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예 및 실험예를 들어 보다 상세하게 설명하나, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 본 발명의 호알칼리성 효소액의 제조]

기질로써 1% Cellulose가 첨가된 LB 액체배지에서, B. licheniformis B1을 16시간 동안 배양한 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액을 3,000 Da의 membrane filter에 넣고 원심분리하여 3,000 Da 이상의 단백질을 얻었다. 즉, Filter에 붙어 있는 3,000 Da 이상의 단백질을 pH 7.0의 PBS(Phosphate Buffered Saline )에 녹여 본 발명에 따른 호알칼리성 효소액을 제조하였다.

[실시예 2: 본 발명의 호알칼리성 효소액의 셀룰라아제 생성 확인]

실험예 1 : Congo red 테스트

0.3% (w/v) Carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma, USA)를 넣은 LB 한천배지에 B. licheniformis B1을 도말하여 37℃에서 14시간 동안 배양하였다. 배양된 평판배지에 0.1% (w/v) Congo red 용액을 처리한 후 30분간 방치하였다. 1 M NaCl 용액으로 Congo red 용액을 세척한 뒤 활성을 측정하였다.

그 결과, CMC가 포함되어 있는 배지에 B. licheniformis B1을 접종했을 때 CMC가 분해되면서 Congo red로 염색되었다. 이로써, 상기 B. licheniformis B1 균주는 cellulase를 분비하는 것으로 사료되었다.

실험예 2 : 활성염색 테스트

기질과 반응시키기 위해 SDS-denaturing polyacrylamide gel에 들어가는 증류수 대신 1% (w/v) CMC 수용액을 사용하였다. 실시예 1에서 준비한 효소액을 전기영동한 후 0.1 M phosphate buffer (pH 7)로 세척한 후 2.5% (v/v) Triton X-100에 30분간 실온에 두었다. 동일 완충용액에서 40℃에서 4시간 동안 효소-기질 반응을 진행시켰다. 이어서 0.1% Congo red 용액으로 15분간 염색하고 1 M NaCl로 충분히 세척한 후 활성대를 관찰하였다.

그 결과, gel상에서 효소활성을 알아보기 위해 활성염색을 사용했을 때도, 하나의 활성밴드가 확인되었다(자료 미제시). 이로써 상기 B. licheniformis B1 균주는 cellulase를 분비하는 것으로 사료되었다.

실험예 3 : TLC 분석

실시예 1에서 준비한 효소액 0.5 ml와 1% CMC를 녹인 기질 0.5 ml를 혼합하여 40℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 Silica gel 60 TLC plate (Merck, Germany)에 spot하였다. 이때, isoamylalcohol: ethanlol: ammonia: water를 50: 60: 1: 30으로 혼합하여 전개용매로 사용하였다. 전개한 후 공기 중에서 건조시키고, 4-methoxybenzaldehyde: H ₂ SO ₄ : glacial acetate: ethanol을 5: 5: 1: 90으로 혼합된 용액을 분사한 후 120℃에서 10분간 발색시켰다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소액에 의해 분해된 CMC(Carboxymethyl cellulose)의 TLC(Thin layer chromatography) 분석 사진이다(여기서, 라인 1은 본 발명에 따른 효소액이 처리되지 않은 것이고, 라인 2, 3은 본 발명에 따른 효소액이 0.1% CMC 용액에 포함된 것임). 여기에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 효소액에 의한 CMC의 가수분해 산물이 glucose 아래에 보이는 것으로 보아 가수분해물은 2탄당 이상의 oligosaccharide로 사료된다(도 1). 또한, CMC를 분해하는 것으로 보아 본 발명에 따른 효소액은 cellulase를 함유할 것으로 사료된다.

[실시예 3: 본 발명의 호알칼리성 효소액의 최적 pH 및 온도 결정]

실험예 1 : 최적 pH 결정

0.1 M Tris-Cl의 pH를 HCl이나 NaOH로 조절하여 다양한 범위의 pH buffer를 제조하였다. 실시예 1에서 준비한 효소액 0.5 ml와 1% CMC를 녹인 기질 0.5 ml를 혼합하여 40℃, 각 pH에서 1시간 반응시킨 후, DNS법을 이용하여 흡광도를 측정하 였다(가수분해로 생성된 환원당은 3,5-dinitrosalicylic acd (DNS)에 의한 방법에 따라 550 nm에서 흡광도를 측정하였다).

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, pH 7 이하에서는 효소의 활성이 약하고, pH 10에서 최고의 활성을 나타내었으며, 그 이상의 pH 범위에서도 상당한 활성을 유지하였다. 몇몇 호알칼리성 Bacillus β-1,4-glucanase가 보고되어 있지만, 본 발명에 따른 효소는, pH 10의 강한 알칼리에서 최적의 활성을 보이고, 특히 pH 13의 가장 강한 알칼리에서도 우수한 활성을 보이는 것이 특징이다. 즉, pH 10~13의 강한 알칼리에서 80~100% 범위 내, 바람직하게는 85~95% 범위 내의 효소 활성 수치를 보이고, 특히 pH 13에서도 80%이상, 바람직하게는 80~85% 범위 내의 효소 활성 수치를 보이고 있다.

이 때문에, 본 발명에 따른 효소는 세제로서 개발될 수도 있다. 지금까지 대부분의 세제는 곰팡이에서 추출되었으나, Bacillus 균주의 배양 이점 등을 고려한다면, 곰팡이에서 세제를 추출하는 것보다 현저히 우수한 효과가 있다. 이외에, 바이오 연료의 생산에서와 같이 강한 알칼리 환경에서 높은 효소 활성이 필요한 다양한 용도에 제한 없이 사용될 수도 있다.

실험예 2 : 최적 온도 결정

pH 10의 0.1M Tris-Cl에 1% CMC를 녹인 기질 0.5 ml와 실시예 1에서 준비한 효소액 0.5 ml을 혼합하여 각 온도에서 1시간 반응시킨 후 DNS법을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 효소활성의 최적온도는 40℃이었으며, 20℃에서는 최대활성의 40%를, 50℃에서는 최대활성의 68%를 나타내어 어느 정도의 내열성을 보여 주었다. 온도가 60℃가 넘어가자 효소의 활성은 급격히 떨어졌다.

[실시예 4: 청국장 및 보리청국장으로부터 본 발명의 호알칼리성 효소 생성 확인]

Bacillus licheniformis B1을 LB 배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 액을 starter로 이용하였고, 정선된 백태를 18시간 동안 수지하였다. 120℃에서 30분간 멸균한 원료 대두 500 g 혹은 여기에 5 g의 분말 보리가 포함된 대두에(보리청국장), 상기 균주 배양액이 1%가 되도록 접종하였다. 접종 후 40℃ 배양기에서 발효시켰다.

이와 같이, 대두에 본 발명에 따른 Bacillus licheniformis B1 균주를 접종하여 청국장 발효를 시킨 후에 일정량을 물에 녹인 상등액을 얻었고, 그 상등액의 DNS 분해능을 측정하면, 도 4에 나타난 바와 같이, 배양 6시간부터 30시간 동안 활성이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있다. 도 4는 본 발명에 따라 청국장 및 보리함유 청국장 안에 포함된 셀룰라아제 효소의 배양 시간별 활동도를 예시적으로 나타내는 그래프이다(여기서, ■는 청국장에서의 효소 활성이고, □는 보리가 포함된 청국장에서의 효소 활성을 뜻함).

이는 균주의 분해효소가 배양 6시간부터 유도되는 것으로 사료된다. 효소가 유도되는 것으로 보아 대두 자체에도 효소의 기질이 다량 존재하는 것으로 추정된다. 또한, 대두에 보리를 추가로 포함시켜서 발효시키면, 대두 단독의 경우보다 효소의 활성이 더욱 증가하였다(도 4). 이는 보리에도 효소의 기질이 상당량 존재하는 것을 뜻한다. 이에 따라, 보리의 가수 분해물에 포함되어 있을 β-1,3결합은 면역증강 효과가 있을 것으로 추정된다.

보리 내배유의 β-glucan은 glucose를 기본단위로 구성되며 β-1,3-1,4 결합으로 이루어진 homopolymer이다. β-Glucanase에는 β-1,3, β-1,4, β-1,3-1,4-glucanase 등 3가지 종류가 있고, 이 중 β-1,3-1,4-glucanase는 보리나 lichenan의 β-1,3에 인접한 β-1,4 결합을 인식하여 절단한다. 본 연구에서 사용한 청국장 발효 균주에서도 이러한 효소들이 존재하는 여부를, 후술하는 해당 유전자의 클로닝과 효소 활성 등을 통해 확인한 결과, β-1,3-1,4-glucanase가 아닌 β-1,4-glucanase로 확인되었다(도 5 참조). 이에 따라, 청국장에도 β-1,3 결합을 지닌 보리를 첨가, 발효시킴으로써, 면역 효과를 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

[실시예 5: 본 발명의 호알칼리성 효소의 유전자 분석]

먼저, β-1,4-Glucanase 유전자를 클로닝(cloning)하기 위하여, 본 발명에 따라 Bacillus licheniformis B1로부터 생산된 β-1,4-glucanase의 chromosomal DNA를 분리·정제하였다. PCR을 위한 primer로 forward primer는 5'-ATGAAACGGTCAATCTCTAT-3', reverse primer로는 5'-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3'를 사용하였다. PCR은 1 cycle당 95℃에서 1 분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 30 cycle을 수행하였다. 이 PCR 산물을 pGEM-T-EASY vector(Promega, USA)에 연결하여 플라스미드를 준비하였다.

그리고, 본 발명에 따른 Bacillus licheniformis B1 균주로부터 생산된 β-1,4-glucanase의 아미노산 배열을 Bacillus licheniformis strain K11 (cellulase) (GenBank EF070195), Bacillus amyloliquefaciens strain UMAS 1002 endoglucanase A(engA) (GenBank AF363635), Bacillus subtilis DLG endo-β-1,4-glucanase (GenBank M16185)와 비교하였다(http//:bioinfo. genopole-toulouse.prd.fr/multalin/의 multiple sequence alignment with hierarchical clustering을 이용하여 분석하였다.).

이와 같이 클로닝된 본 발명에 따른 cellulase 유전자를 NCBI의 BLAST를 이용하여 검색한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 상동성이 매우 높은 다른 3개의 β-1,4- glucanase 유전자를 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 Bacillus licheniformis B1 glucanase(B1)의 단백질 서열을, B. licheniformis strain K11 cellulase(K11), B. amyloliquefaciens strain UMAS1002 endoglucanase A(UMAS), B. subtilis DLGendo-β-1,4-glucanase(DLG)와 비교하였다.

그 결과, 단백질을 코딩하는 영역 10~460번째 아미노산 영역 중, 4개의 glucanase는 32군데서 polymorphism을 보였다(도 5 참조). B. licheniformis B1과 B. subtilis DLG와 비교했을 때는 위의 영역 중, 16군데서 차이를 보였다(도 5 참조). 또한, B. licheniformis B1과 B. licheniformis K11과 비교했을 때는 같은 영역에서, 20군데서 polymorphism의 차이를 보였다(도 5 참조). Consensus sequence와 비교했을 때, B. licheniformis B1 glucanse는 12군데서 일치하지 않았으나 나머지 부분은 전부 일치하였다(도 5 참조). Bacillus sp. strain KSM-N252의 endo-β-1,4-glucanase (Eg1)와 아미노산에서 상동성을 비교한 결과, 본 발명에 따른 균주의 glucanase는 Eg1등과는 전혀 다른 종류로 판명 되었다(자료 미제시). 이미 알려진 DLG와 비교해서 유추해 본 결과, 본 endoglucanase의 signal sequence는 10~38이며 Ala ³⁶ -Ser-Ala ³⁸ 의 Ala ³⁸ 위 뒤에서 절단이 일어나고 mature 효소의 아미노말단은 Ala ³⁹ -Gly-Thr-Lys-Thr-Pro-Val-Ala-Lys ⁴⁷ 를 포함할 것으로 사료된다. 본 효소의 signal sequence는 아미노 말단에는 Lys-Arg과 같은 염기성 아미노산의 반복, 그 뒤로 hydrophobic region이 따라오는 등 전형적인 siganl sequence의 특징을 보여 주고 있다(도 5 참조). B. subtilis DLG의 효소활성에 대해서는 간략한 보고가 있으나, 나머지 glucanase의 생화적인 특성에 대한 보고는 전혀 없는 상태이다. 특히, 이들 3개 β-1,4-glucanase의 최적 pH가 염기성이란 보고는 아직까지 없었다. 일단 B. licheniformis β-1,4-glucanase 유전자가 클로닝되어 있기 때문에, 이를 바탕으로 본 효소 유전자 발현의 조절기작, 효소의 대량생산, 분리정제, 생화학적 특성 결정 등의 작업이 보다 용이할 것이다.

본 발명에 따라 바실러스 리케니포미스 B1 균주로분터 생산된 셀룰라아제 효소 및 이를 포함하는 효소액은 알칼리 환경에서 우수한 활성을 가짐으로써, 세제(detergent) 또는 바이오연료 제조공정과 같은 다양한 용도에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소액에 의해 분해된 CMC(Carboxymethyl cellulose)의 TLC(Thin layer chromatography) 분석 사진이고,

도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소의 pH 별 활동도를 나타내는 그래프이고,

도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 셀룰라아제 효소의 온도별 활동도를 나타내는 그래프이고,

도 4는 본 발명에 따라 청국장 및 보리함유 청국장 안에 포함된 셀룰라아제 효소의 배양 시간별 활동도를 예시적으로 나타내는 그래프이고,

도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 B. licheniformis B1 와 종래의 β-1,4-glucanase 유전자들의 아미노산 서열을 나타내는 모식도이다.