박테리아 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이들의 용도

박테리아 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이들의 용도{BACTERIAL STRAINS, COMPOSITIONS INCLUDING SAME AND PROBIOTIC USE THEREOF}

발명의 분야 및 배경

본 발명은 신규한 박테리아 균주, 이를 포함하는 조성물 및 설사와 같은 위장장애의 프로바이오틱 치료에 이러한 균주를 사용하는 방법에 관한 것이다.

프로바이오틱은 숙주 위장(gastro-intestinal, GI)계에 양성 효과를 발휘하는 살아있는 유기체로서 정의된다. 가장 통상적으로 사용되는 프로바이오틱(probiotic)은 젖산균(lactic acid bacteria, LAB)의 균주이며, 특히 이들은 락토바실러스( Lactobacillus ), 락토코쿠스( Lactococcus ) 및 엔테로코쿠스( Enterococcus ) 속으로 분류된다.

저항력이 낮은 기간(예: 스트레스 또는 질환시, 출생시 또는 항생체 처리 후)동안에는 바람직하지 못한 미생물이 위장관에서 증식할 수 있다는 것이 잘 공지되어 있다. 따라서, 스트레스를 받은 기간동안 위장(GI)관내에 정상의 건강한 미생물 무리를 유지하는 것이 중요하다.

프로바이오틱 요법의 목적은 정상의 GI 균무리가 다시 확립될 수 있을 때까지 건강-촉진 미생물의 수 및 활성을 증진시키는 것이다.

프로바이오틱의 보호 작용을 담당하는 수개의 메커니즘이 제안되었다. 이는 (i) 세포 생육성을 저하시키고 박테리아의 대사에 영향을 주고 독소 생산을 감소시킬 수 있는 저해성 물질(예: 항생제, 유기산, 과산화수소 및 박테리오신)의 생산; (ii) 장의 상피 표면상의 박테리아 부착 부위의 경쟁적 저해에 의한 부착 부위의 차단[Conaway (1987) J. Dairy Sci. 70: 1-12; Goldin (1992) Dig. Dis. Sci. 37: 121-128; Kleeman and Klaenhammer (1982) J. Dairy Sci. 1982; 65: 2063-2069]; (iii) 영양소에 대한 경쟁; (iv) 장관 점막상의 독소 수용체의 분해를 통해 S. 보울라르디( S. boulardii )가 동물을 C. 디피실( C. Difficile )에 대하여 보호한다고 가정된 메커니즘인 독소 수용체의 분해[Castagliuolo (1996) Infect. Immun. 64: 5225-5232; Castagliuolo Infect. Immun. (1999) 67: 302-307 Pothoulakis (1993) Gastroenterology 104: 1108-1115]; 및 (v) 비특이성 면역 자극[Fukushima Int. J. Food Microbiol. (1998) 42: 39-44; Link-Amster FEMS Immunol. Med. Microbiol. (1994) 10: 55-63; Malin Ann. Nutr. Metab. (1996) 40: 137-145]을 포함한다.

추가로 하기에 설명하는 바, 다수의 연구를 통해 다양한 장질환 및 장외질환의 치료 및 예방에서 프로바이오틱의 가능한 사용에 대하여 조사되어 왔다.

급성 설사 - 장 감염의 주요 증상은 설사이다. 여러 사례에서 재수화 작용 요법이 효능이 있었지만, 대변 횟수를 감소시키지도 못하고 설사 기간을 단축시키지 못하기 때문에 그의 허용도는 낮다. 추가로, 소아에게 실시하기는 어렵다.

설사에 대하여 프로바이오틱 치료법이 시도되어 왔고, 이는 제한적으로 성공을 가져왔다. 이중맹 플라세보 조절 연구에서 소아 환자에게 S. 보울라르디( S. boulardii )를 투여하였을 때 대변 횟수를 현저하게 감소시켰다[Cetina Sauri (1994) Extrait Ann Pediatrie 41: 6]. 반면, 비브리오 콜레라( Vibrio cholera ) 및 장독성 E. c oli 에 의해 유발된 급성 물설사에서 스트렙토코쿠스 파에시움( Streptococcus faecium )의 치료학적 효능은 관찰되지 않았다[Mitra (1990) 99: 1149-52].

여행자 설사 - 여행자 설사는 개발 도상국뿐만 아니라 서구 세계에서도 건강한 여행자에게 영향을 주는 보편적인 증후군이다. 여행자 설사의 빈도율는 여행자의 출발지 및 목적지뿐만 아니라 여행 모드에 따라 20 내지 50% 범위이다. 설사는 자기-한정적이지만, 가벼운 발병도 휴가를 방해할 수 있고, 이로써 불편하고 불쾌할 수 있다. 다양한 감염원이 여행자 설사의 원인으로서 기술되었다. 독소-생산성 대장균( Escherichia coli )은 가장 보편화된 분리된 유기체이다.

살아있는 산성 박테리아가 위험 기간동안 투여되는 경우, 프로바이오틱이 여러 형태의 여행자 설사를 예방함에 유리한 효능을 갖는 것으로 나타났다[Du Pont (1993) New Eng. J. Med. 328: 1821-7; Vander Waij (1982) J. Antimicrob. Ther. 10: 263-70; Oksanen (1990) Ann. Med. 22: 53-6; Salminen (1992) 10: 227-38; Black (1989) Travel Med. 8: 333-5; Katelaris (1995) 41: 40-7; Kollaritsch (1990) 74-82].

항생제 관련 설사 - 경미하거나 중증의 설사 에피소드가 항생제 요법의 가장 보편화된 부작용이다. 미생물 요법시 정상의 미생물 무리는 억제될 수 있고 결과적으로 미생물 결핍은 기회감염 또는 병원성 균주로 대체될 수 있다는 것이 잘 확 립되었다[Gismondo (1995) Chemotherapy 41:281-8]. 미생물 무리의 변화는 또한 내성 균주의 출현을 조장할 수 있고, 항생제 관련 설사중 적어도 1/3은 클로스트리디움 디피실( Clostridium difficile )에 기인한다.

정상의 장 균무리를 수복시키고 대체하기 위하여 프로바이오틱을 사용할 수 있다는 것이 제안되었다. 특히, 프로바이오틱은 노인, 입원 환자 또는 면역약화된 환자와 같은 위험성이 높은 환자에서 사용될 수 있다. 수개의 임상 시험을 통해 항생제 관련 설사에서 S. 보울라르디( S. boulardii ), 락토바실러스 spp.( Lactobacillus spp. ) 및 비피도박테리움 spp.( Bifidobacterium spp. )를 사용하여 왔다. 따라서, 예로서 S. 보울라르디( S. boulardii )를 입원 환자에 투여한 경우 항생제 관련 설사의 발생율은 50%까지 감소되었다[Surawicz (1989) Gastroenterology 96: 981-8; McFarland (1995) Am. J. Gastroenterol 90: 439-48]. 다르게는, C. 디피실( C. Difficile ) 결장염을 앓는 환자에 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )를 투여한 경우 재발되지 않고 설사를 정지시켰다[Gorbach (1987) Lancet 2: 1519-22].

HIV-관련 설사 - 설사는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 매우 심각한 결과이다. 상기 설사의 병인은 잘 알려져 있지 않고 유효한 치료 요법도 존재하지 않는다. 그러나, 최근 만성 설사를 앓는 33명의 HIV 환자를 치료하기 위하여 S. 보울라르디( S. boulardii )가 사용되었다(Born et al. Dtsch. Med. Wochenschr. (1993); 118: 765, Saint-Marc et al. (1991) Ann. Med. Intern. 142: 64-65). 이 이중맹 연구에서, S. 보울라르디( S. boulardii )를 투여받은 56% 환자는 플라세보를 투여받은 단지 9% 환자와 비교하여 설사를 해소시켰다.

수크라아제-이소말타아제 결핍증 - 수크라아제-이소말타아제 결핍증은 인간에게 있어 가장 빈번한 원발성 디사카리다아제 결핍증이다. 수크로오스의 흡수장애를 일으키는 유전적 이상이다. 생성된 박테리아의 수크로오스 발효는 결장내 수소를 축적시키고, 설사, 복통 및 고창증을 일으킨다. 수크로오스가 없는 식이 요법은 증상을 나타내지 않는다. 그러나, 모든 환자들이 상기와 같은 식이 요법을 따르지는 않을 것이다. Harms 등[(1987) N. Engl. J. Med. 316: 1306-1309]은 수크라아제-이소말타아제 결핍증을 앓는 8명의 어린이를 치료하기 위하여 사카로마이세스 세레비시아에( Saccharomyces cerevisiae )를 사용하였다. 수크로오스에 이어서 S. 세레비시아에( S. cerevisiae )를 제공받은 어린이에게서 S. 세레비시아에( S. cerevisiae ) 효소에 의한 효소적 보완에 의해 유발될 수 있는 수소 호기 검사 및 위장 증상이 호전되었다고 입증되었다.

로타바이러스 설사 - 로타바이러스는 특히 개발 도상국에서 유아의 발병 및 사망의 중요한 원인이 된다[Majamaa et al. (1995) J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr 20: 333-338, Middleton et al. (1977) Am. J. Dis. Child. 131: 733-737]. 최근 로타바이러스 감염의 건강에 대한 영향력을 현저하게 감소시켜야 하는 효능있는 백신을 이용할 수 있지만, 치료의 주요 수단은 경구적 재수화 작용이다.

락토바실러스( Lactobacillus )는 로타바이러스 감염에 대한 치료제로서의 몇몇 가능성을 입증하였다[Isolauri et al. (1994) Dig. Dis. Sci. 39: 2595-2600, Kaila et al. (1992) Pediatr. Res. 32: 141-144, Majamaa et al. (1995) Supra). Isolauri 등(1991)은 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG ) 또는 플라세보를 사용하여 설사를 앓는 74명의 어린이(연령 4-45 개월)를 치료하였다. 설사를 앓는 어린이중 대략 80%가 로타바이러스에 대하여 양성이었다. 연구원들은 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )를 투여받은 환자에서 설사 기간이 현저히 단축(2.4일로부터 1.4일)되었음을 입증하였다. 로타바이러스-양성 환자만을 분석하였을 때 상기 효능은 더욱더 현저하게 나타났다.

염증성 장질환 - 크론병 및 병인이 알려져 있지 않은 궤양결장염을 포함하는 2개의 염증성 장질환은 장내 미생물 무리의 장애와 관련된다[Fabia et al. (1993) Digestion 54: 248-255]. 말단 회장이 크론병의 가장 일반적인 부위이지만, 크론병은 입부터 항문까지 발생하는 특발성 염증성 장질환이다. 궤양결장염의 가장 일반적인 증상은 결장의 염증이다. 이들 질환에 대하여 이용가능한 구체적인 치료법은 없다. 궤양결장염의 재발을 예방하는 그의 능력에 대하여 비병원성 대장균(E. c oli) 의 Nissle 균주(혈청형 06:K5:H1)를 연구하였다[Kruis (1997) Aliment. Pharmacol. Ther. 11: 853-858]. 예비 결과는 가능성이 있어 보였고, 이는 궤양결장염의 유지요법에 대한 또다른 옵션일 수 있음을 제안하였다.

변비 - 변비는 고령에서 증가적으로 빈번하게 발생하는 보편적인 이상이다. 예를 들면, 영국에서는 매년 300만건의 GI 상담은 변비와 관련된다고 추산된다 [Robinson, Conspitation: causes and cures, Nurs Times. 2003 Jun 24-30; 99 (25): 26-7].

변비 문제는 자주 위장 미생물 무리의 변화와 관련된다[Colum Dunne Infkammatory Bowel Diseases (2001) 7: 136-145]. 프로바이오틱 치료법은 장운동성을 개선시키고, 대변 효소 활성을 저하시키며, 변비를 경감시키는데 효과적이라고 제안되었다[Ouwehand et al Annals of Nutrition and Metabolism (2002) 46: 159-162).

주머니염(pouchitis) - 주머니염은 만성 궤양결장염에 대하여 외과치료를 받는 환자중 10-20%에서 발생하는 회장 저장소 수술의 합병증이다. 박테리아는 주머니에서 증식하여 상피 세포를 오버레이하는 점액을 분해시킨다. 이는 출혈성 설사, 하복부통 및 열을 포함하는 증상 및 염증을 일으킨다. 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )는 점액-분해 성질을 입증하지 못했기 때문에 주머니염에 대한 유효한 치료제로서 제안되지 못했다[Ruseler-Van Embden et al. (1995) Microecol. Ther. 23: 81-88].

발암 - 발암 물질을 활성화시키는 효소를 생산하여 정상의 장 균무리가 발암에 영향을 줄 수 있다는 증거가 모아지고 있다. 이들 효소로서 글리코시다아제, β-글루쿠로니다아제, 아조리덕타아제 및 니트로리덕타아제를 포함한다. 분명하게는 선별된 미생물은 이 발암 활성으로부터 숙주를 보호할 수 있다[Orrhage et al. (1994) Mutat. Res. 311: 239-248; Rowland and Grasso (1975) Appl. Microbiol. 29: 7-12]. L. 아시도필루스( L. acidophilus ) 또는 L. 카세이( L. casei )를 투여받은 인간 대상자는 그들의 대변 검사물에서 발암 물질 전구체를 발암 물질로 전환시키는 효소 수준을 저하시켰다[Hayatsu and Hayatsu (1993) Appl. Microbiol. 29: 7-12; Lee and Salminen (1995) Trends Food Sci. Technol. 6: 241-245; Lidbeck et al. (1992) Eur. J. Cancer Prev. (1992) 1: 341-353].

경장 영양(Enteral feeding) 관련 설사 - 비강영양관 영양을 받는 환자는 빈번하게 설사를 일으킨다. 설사 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 경장 영양은 정상의 균무리에 변화를 가져옴으로써 탄수화물 대사를 바꾸고, 이후 설사를 일으킨다고 예측된다. 플라세보-조절 및 이중맹인 별개의 2개의 연구를 통해 S. 보울라르디( S. boulardii )가 투여되었을 때 환자에서 설사는 현저히 감소되었음이 입증되었다[Bleichner et al. (1997) Intensive Care Med. 23: 517-523, Tempe et al. (1983) Sem. Hop. 59: 1409-1412].

비뇨생식관 질환 - 자궁 감염 및 자궁목, 질 및 음문의 감염은 특히 출생 후 인간 및 가축에서 일반적으로 발생한다. 자궁내막(즉, 자궁 점막) 및 하부 생식관의 인접한 점막 표면의 전형적인 감염성 유기체로서 예를 들면, β-용혈성 스트렙토코코시, 칸디다 알비칸스( Candida albicans ), 클레브시엘라 뉴모니아에( Klebsiella pneumoniae ), 에스케리키아 콜리( Escherichia coli ), 코리네박테리움 피오게네스( Corynebacterium pyogenes ) 및 C. 바지날( C. vaginale )을 포함하는 대장균, 다양한 캄필로박터( Campylobacter ) 또는 트리코모나스( Trichomonas ) 종 등을 포함한다(미국특허 제 5,667,817 호 참조).

다른 비뇨생식 병원체로서 제한하는 것은 아니지만, 클라미디아 트라코마티스( Chlamydia trachomatis ), 네이쎄리아 고노르호에아에( Neisseria gonorrhoeae ), 단순헤르페스 바이러스, HIV, 유두종바이러스 및 트레포네마 팔리둠( Treponema pallidum )을 포함한다.

세균성 질염(BV)은 막의 조기 파열, 조산, 또는 태아 또는 신생아의 사망을 유발하면서 임신 기간중에 합병증을 일으킬 수 있다. 막의 조기 파열은 또한 BV, 요로 감염, B 그룹 연쇄구균감염 및 비뇨생식관내 우레아플라스마 및 미코플라스마와 같은 유기체의 존재와 관련될 수 있다.

연구를 통해 난해한 근본 원인을 배제하면 유일한 치료적 옵션은 항균제이다. 다수의 경우, 감염 치료에 효과가 있다. 그러나, 재발, 부작용, 및 2차 감염이 빈번하다. 질내에서는 정상의 공생 미생물 무리의 파괴, 주로 락토바실리의 손실이 감염과 동시에 발생한다. Reid FEMS [Immunol Med Microbiol. (2001) Feb; 30(1): 49-52]에 기술된 바와 같이 비뇨생식과 질환 치료에 프로바이오틱을 사용하는 것이 유리하다고 나타났다.

호흡기 질환 - 상기도는 스타필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에( Streptococcus pneumoniae ), 베타-용혈성 스트렙토코코시 및 해모필러스 인플루엔자( Haemophilus influenza )를 포함하는 내재한 병원성 박테리아를 수반할 수 있다. 다수의 보도를 통해 프로바이오틱의 규칙적인 섭취가 상기도내 내재한 병원성 박테리아를 감소시킬 수 있다고 제안되었다[Roos and Kolm (2002) Curr. Infect. Dis. Rep. 4: 211-216]. Guarino 및 동료들은 낭성섬유증을 앓고 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )로 치료받는 어린이를 플라세보 그룹과 비교하였을 때 폐렴 경중도는 현저시 감소하였다고 기술하였다[Gastroenterol Int1998; 11 (suppl):91]. Ribeiro 및 Vanderhoof는 탁아소에서 간호받는 어린이에게 프로바이오틱을 도입한 경우 호흡기 질환의 발생율은 감소하 였다고 나타내었다[J Pediatr Gastroenterol Nutr 1998; 26: 561]. 다수의 메커니즘은 호흡기 질환에 대한 프로바이오틱의 효능을 설명할 수 있다. Mack 등은 L. 플란타룸( L. plantarum )에 의한 세포 배양 시스템에서 뮤신 유전자 상향 조절을 나타내었다[Am J Physiol 1999; 276: G941-50]. 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )는 락토바실러스중 대부분의 다른 종과는 공유하지 않는 특성으로서, 로타바이러스 및 로타바이러스 백신에 항체 반응을 선택적으로 자극하는 것으로 나타났다. 마지막으로 Jung 및 동료[FASEB J 1999; 13: A872]들은 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )는 플라세보 그룹[Jung et al. FASEB J 1999; 13: A872]에서 보다 락토바실러스 GG( Lactobacillus GG )로 치료받는 성인에서 장티프스 백신에 대하여 더욱 우수한 항체 반응을 일으킨다고 나타내었다.

류마티스 관절염 - 류마티스 관절염과 관련된 염증은 프로바이오틱을 소비함으로써 조절될 수 있다고 이해된다[Malin (1996) Br JRheumatol; 35: 689-94]. 염증을 일으킨 투과성 위장관을 통해 흡수된 항원의 정상 처리과정은 장의 염증 질환 및 장외 염증 장애의 연결 고리로서 작용할 수 있다. 프로바이오틱 소비의 결과로서 면역계의 조절 또는 장 투과성의 변화가 궁극적으로는 이들 장애의 일부에서 중요한 주요 또는 보조 요법일 될 수 있다.

알레르기 - 알레르기성 질환은 아마도 서구의 생활 양식(즉, 위생상의 개선 및 소가족화)과 관련하여 미생물 자극이 감소하였기 때문에 지난 20 또는 30년에 걸쳐 증가하였다. 이러한 생활 양식의 변화는 미생물 무리의 조성에 있어 변화를 유도하였고, 이로써 면역계의 자극을 감소시켰다. 사이토카인 Th2의 디폴트 반응 성을 사이토카인 Th1의 것으로 변화시킴으로써 알레르기의 발생율을 저하시키기 위해서는 신생아 단계에서 장 감염은 중요하다고 가정된다.

아토피 질환의 유병율이 더욱더 높은 개체에 의해 수반되는 미생물 무리의 주요 특징은 클로스트리디움 spp( Clostridium ssp )의 다량의 계수와 함께 락토바실러스( Lactobacillus ) 및 유박테리움( Eubacterium )의 감소이다[Biorksten et al. Clin. Exp. Allergy (1999) 29: 342-346]. 따라서, 프로바이오틱을 도입하여 미생물 무리의 불균형을 보정하여 아토피 질환을 치료하는 것이 시도되었다.

최근 아토피 부종을 예방하기 위한 특정 프로바이오틱의 긍정적인 활성이 보고되었다[Isolauri (2001) Am J Clin Nutr 73:1142S-1146S]. 아토피 부종의 관리에서 두개의 상이한 박테리아, 비피포박테리움 락티스( Bififobacterium lactis ) 및 락토바실러스 람노수스 GG( Lactobacillus rhamnosus GG)는 대조군 연구에서 효능이 있다고 입증되었다[Kalliomaki (2001) Lancet 357: 1076-1079].

프로바이오틱 요법의 효능이 다수의 연구를 통해 입증되었고 이로써, 현재는 다수 장애에 대한 적절한 요법으로 허용되었지만, 프로바이오틱 치료법은 전신 감염, 유해한 대사 활성, 민감한 개체내에서의 과도한 면역 자극 및 유전자 전이를 포함하는 다수의 부작용을 일으킬 수 있다[Marteau (2001) Safety aspects of Probiotics products. Scand. J. Nutr., 45,1, 22-24]. 예를 들면, L. 람노수스( L. rhamnosus )의 2개의 병상은 가능한 프로바이오틱 소비로 규명되었다[Rautio (1999) Clin. Infect. Dis. 28: 1159-60; Mackay (1999) Clin. Microbiol. Infect. 5: 290-292]. 사카로마이세스 푼게미아( Saccharomyces fungemia )의 13개 의 병상은 내재된 질환을 갖는 모든 환자에서 프로바이오틱 소비와 관련된 바실러스( Bacillus ) 감염[Spinosa (2000) Microb. Ecol. Health Dis. 12: 99-101; Oggioni (1998) J. Clin. Microbiol. 36: 325-326] 및 혈관카테터 오염[Hennequin (2000) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19:16-20]에 의해 유발되었다. 다르게는, 엔테로코쿠스( Enterococcus )가 병원내 감염의 중요 원인으로 판명되었고 분리주는 더욱더 반코마이신 내성을 띠게 된다.

따라서, 상기와 같은 한계를 갖지 않는 프로바이오틱 박테리아 균주에 대한 필요성이 널리 인지되고 있고 상기는 고도로 이로울 것이다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 일면에 따라, 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ) 균주(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는, 생물학적으로 순수한 박테리아 균주 배양물을 제공한다.

본 발명의 또다른 일면에 따라, 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) 균주(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는, 생물학적으로 순수한 박테리아 균주 배양물을 제공한다.

본 발명의 또다른 일면에 따라, 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주를 포함하는 박테리아 공-배양물을 제공한다.

본 발명의 또다른 일면에 따라, 바실러스 리케니포르미스( Bacillus licheniformis ) 균주 및 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ) 균주를 포함하는 적어도 2개의 박테리아 균주를 포함하되, 바이오스포린 배양물보다 더 높은 항-병원성 활성을 나타내는 박테리아 공-배양물을 제공한다.

하기 기술하는 본 발명의 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 바실러스 리케니포르미스( Bacillus licheniformis ) 균주는 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)이고, 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ) 균주는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)이다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 치료학적 유효량의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 조성물은 1g당 적어도 10 ³ 개의 생육성 박테리아 세포를 포함한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 조성물은 1g당 적어도 10 ⁶ 개의 생육성 박테리아 세포를 포함한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 조성물은 1g당 적어도 10 ¹⁰ 개의 생육성 박테리아 세포를 포함한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 조성물은 추가로 효모 세포, 곰팡이 및 박테리아 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 프로바이오틱 미생물을 포함한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 조성물은 추가로 항생제를 포함한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 조성물은 추가로 항진균제를 포함한다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 유효량의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주, 및 인간이 소비하기에 적절한 담체를 포함하는 식품 첨가제 또는 보충제를 제공한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 담체는 콜로니형성 담체이다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 콜로니형성 담체는 사카라이드, 변형된 사카라이드 및 그의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 유효량의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주, 및 동물이 소비하기에 적절한 담체를 포함하는 사료 첨가제 또는 보충제를 제공한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 담체는 석회암, 사카라이드 및 위트 미드(wheat midds)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 유효량의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주를 포함하는 식료품을 제공한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 식료품은 발효 유제품이다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 치료학적 유효량의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 위장장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 포장재 및 위장장애 치료 또는 예방에 대해 확인된, 포장재내 포함된 조성물을 포함하되, 조성물은 활성 성분으로서 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주를 포함하는, 물품을 제공한다.

본 발명의 추가의 일면에 따라, 치료학적 유효량의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )(ATCC 기탁번호:PTA-5311)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 1 박테리아 균주 및/또는 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(ATCC 기탁번호:PTA-5310)의 확인된 모든 특징을 갖는 제 2 박테리아 균주를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 프로바이오틱에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 제 1 또는 제 2 박테리아 균주는 포자형성된 형태(sporolated form)로 제공된다.

기술된 바람직한 일례에서 추가의 특성에 따라, 제 1 또는 제 2 박테리아 균주는 동결건조된 형태로 제공된다.

기술된 바람직한 일례에서 또다른 추가의 특성에 따라, 제 1 박테리아 균주 및/또는 제 2 박테리아 균주의 농도는 1회 투여량을 10 ⁸ 내지 10 ¹⁰ 개의 생육성 세포로 하여 투여한다.

기술된 바람직한 일례에서 또다른 추가의 특성에 따라, 장애는 충수염, 자가면역 질환, 다발경화증, 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 소아지방변증(coeliac disease), 당뇨병, 장기이식, 치주병, 비뇨생식계 질환, 성매개질환, HIV 감염, HIV 복제, 수술 관련 외상(surgical associated trauma), 수술-유도 전이성 질환(surgical-induced metastatic disease), 패혈증, 체중 감소, 식욕부진, 열 억제(fever control), 악액질, 상처치유, 궤양, 장 장벽 기능(gut barrier function), 알레르기, 천식, 호흡기 장애, 리노바이러스-관련 질환, 순환기 장애, 관상동맥심질환, 빈혈, 혈액응고계 장애, 신질환, 중추신경계 장애, 간질환, 변비, 허혈, 영양장애, 골다공증, 내분비샘 장애, 표피 장애, 건선, 탄저병 및 여드름으로 구성된 그룹중에서 선택된다.

본 발명은 신규한 박테리아 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이들의 프로바이오틱 용도를 제공함으로써 현재 공지된 형태의 단점을 성공적으로 해소한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 있는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 아래 기술된다. 불일치한 경우에, 정의를 비롯한 특허 명세서는 콘트롤할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명을 위한 것일 뿐, 제한하고자 의도된 것이 아니다.

본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 단지 일례로서 여기에 기술된다. 도면과 관련하여 상세하게는 도시한 도면은 일례로서, 단지 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 원리 및 개념적 양상을 가장 유용하 고 쉽게 이해할 수 있게 설명하도록 하기 위해 나타낸다. 이 점에서, 본 발명을 근본적으로 이해하는데 필요한 설명 보다 더 상세하게 본 발명을 구조적으로 설명하고자 하는 시도는 이루어지지 않았지만, 도면에 의한 설명은 본 발명의 일부 형태가 실제로 어떻게 구체화될 수 있는지를 당업자들에게 명백하게 한다.

도면에서:

도 1a-b는, 37℃ 영양 한천상에서 배양하고 18 시간후의 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) (도 1a) 및 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )(도 1b)의 형태를 나타내는 현미경사진이다. 1000배 확대도가 도시되어 있다.

바람직한 일례의 설명

본 발명은 설사와 같은 위장장애의 프로바이오틱 치료에 사용될 수 있는 박테리아 균주 및 이를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 원리 및 조작은 도면 및 첨부되는 발명의 상세한 설명에 의해 더욱 이해될 수 있다.

본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 이후의 발명의 설명에 나타내었거나 실시예로서 예시된 항목으로 그의 적용이 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명은 그 외에도 구체화할 수 있거나 다양한 방법으로 실행 또는 수행될 수 있다. 또한, 여기에 사용하는 표현 및 용어는 설명을 위한 것이지 제한하는 것으로서 간주되어서는 안되는 것으로 이해하여야 한다.

위장내 미생물 무리(microflora)은 인간 및 동물의 위장관 기능 및 전반적인 생리적 건강을 유지하는데 중요하다. 그러나, 저항력이 낮은 기간 동안, 바람직하지 못한 미생물(즉, 병원체)이 위장관내에서 증식할 수 있고, 이로써 정상의 보호적인 장내 균무리를 대체시켜 중증의 위장관 증후군을 발생시키게 된다.

상재 박테리아의 구조 및 대사활성을 변형시키고자 한 시도는, 주로 숙주 위장(GI) 계에 양성효과를 발휘하는 살아있는 미생물인 프로바이오틱에 의해 수행되고 있다. 지금까지, 가장 알려진 프로바이오틱은 요구르트 및 다른 발효 유제품에 널리 이용되고 있는 젖산-생성 박테리아(즉, 락토바실러스( Lactobacillus ) 및 비피도박테리아( Bifidobacteria ))이다. 이들 프로바이오틱 유기체는 비병원성 및 비독성이고, 저장하는 동안 생존력을 유지하며, 위 및 소장을 살아서 통과한다.

프로바이오틱 바이오스포린(Biosporin)은 바실러스 서브틸리스 3( Bacillus subtilis 3 ) 및 바실러스 리케니포르미스 31( Bacillus licheniformis 31 )을 포함하는 바실러스( Bacillus ) 속의 호기성 포자형성(aerobic sporulating) 박테리아의 배양물(culture)이다. 바이오스포린은 항생제 내성 미생물을 포함하는 광범위한 병원성 및 조건적 병원성 미생물[예, 살모넬라( Salmonella ) 종, 쉬겔라( Shigella ) 종, 병원성 대장균( E. coli ), 프로테우스( Proteus ) 종, 클레브시엘라( Klebsiella ) 종, 스타필로쿠스 아우레우스( S. aureus ), 캄필로박터( Campylobacter ) 종, 헬리코박터( Helicobacter ) 종, 예르시니아( Yersinia ) 종, 칸디다( Candida ) 종]에 대한 길항작용을 특징으로 한다. 중요하게도, 바이오스포린은 락토바실리( lactobacilli )와 같은 다른 프로바이오틱 제제에 비해 훨씬 높은 치료 효능을 발휘하며, 고 투여량 을 투여했을 때 단지 최소한의 세포독성은 숙주에 대한 부작용, 예컨대 전신 감염 및 유해한 대사 활성을 일으키지 않는다[Sorokulova (1997) Mikrobiol Z. 59 (6): 43-9; Smirnov et al. (1994) Likarska sprava, 5-6, 133-138; Gracheva et al. 1996) Zh. Microbiol. (Moscow) 1, 75-77; Osipova et al. (1998) Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol., 6, 68-70]. 또한, 바이오스포린은 지금까지 알려진 유일한 프로바이오틱 배양물로서, 캄필로박터( Campylobacter ) 병원체에 효과가 있다[Sorokulova et al. (1997) J. Travel. Med. 4: 167-170].

본 발명을 실시하고 개선된 프로바이오틱 활성을 가진 박테리아 균주를 조사하는 동안, 본 발명자들은 바이오스포린 배양물에 비해 우수한 프로바이오틱 기능을 나타내는 신규한 박테리아 균주를 밝혀내었다.

다음의 실시부에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 박테리아 균주는 카제인 분해 및 리소자임 생성 작용을 개선시키기 위한 바이오스포린 배양물의 선택을 통해 밝혀졌다.

본 발명의 박테리아 균주는 내생포자를 형성하고 카탈라아제를 생성할 수 있는 막대형(rod-shaped) 그람 양성 박테리아(도 1a-b)이다. 추가적인 생화학적 특징은 이하의 표 1에 요약되어 있다.

다음의 실시부 실시예 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 박테리아 균주는, 내부 장기의 육안 검사 및 지라 중량 지수 평가를 이용하여 결정되기 때문에, 생물학적 연구에 대해 안전하다(즉, 전신 감염, 유해한 대사 활성, 과잉 면역자극 또는 유전자 도입을 유발시키지 않는다)

중요하게도, 본 발명에 따른 박테리아 균주의 공-배양물(co-culture)은 광범위한 항균 활성을 나타내며, 모(parental) 바이오스포린 배양물의 항균 활성보다 더 높다(다음의 실시부 실시예 5-8 참조).

이들 발견은 본 발명의 박테리아 균주가 인간 및 동물의 위장장애를 치료 및 예방하는데 사용될 수 있는 효능있는 프로바이오틱임을 제시한다.

본 발명의 일면에 따라, 바이오스포린 배양물보다 더 높은 길항작용을 나타내는 박테리아 균주의 생물학적으로 순수한 배양물이 제공된다(다음의 실시부 실시예 5-8 참조).

본 발명의 하나의 바람직한 일례에 따라, 박테리아 균주는 부다페스트 조약하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC))에 2003년 7월 8일 기탁된 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ) 균주, 즉 균주 PTA-5310의 모든 확인된 특징을 갖는다.

본 발명의 또다른 바람직한 일례에 따라, 박테리아 균주는 부다페스트 조약하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC))에 2003년 7월 8일 기탁된 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) 균주, 즉 균주 PTA-5311의 모든 확인된 특징을 갖는다.

본 명세서에 사용된 어구 "생물학적으로 순수한 배양물"은 박테리아의 적어도 20%가 하나의 박테리아 균주로 이루어진 박테리아 배양물을 말한다. 본 발명의 이러한 일면의 바람직한 일례에 따라, 배양물은 적어도 30% 순수하고, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 순수하며, 더욱더 바람직하게는 적어도 50% 순수하고, 가장 바 람직하게는 적어도 90% 순수하다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 박테리아 균주의 박테리아 공-배양물(즉, 균주 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) 및 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )는 바이오스포린 배양물에 비해 우수한 항박테리아 활성을 나타내며, 따라서 위장장애의 프로바이오틱 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 또다른 일면에 따라, 박테리아 균주 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) 및 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )를 포함하는 박테리아 공-배양물이 제공된다.

본 명세서에 사용된 "박테리아 공-배양물"은 상술된 적어도 2개의 본 발명의 박테리아 균주를 포함하는 박테리아 세포 배양물을 말한다.

본 발명의 박테리아 공-배양물로는 프로바이오틱 박테리아, 효모(예, 사카로마이세스( Saccharomyces ) 속의 효모, 미국특허 제 6,524,575 호) 및/또는 곰팡이(예, 아스페르길루스( Aspergillus ) 속의 곰팡이, 미국특허 제 6,368,591 호)의 다른 균주를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 프로바이오틱 박테리아 균주의 예로는, 락토바실러스 아시도필루스( Lactobacillus acidophilus ), 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ), 락토바실러스 살리바리우스( Lactobacillus salivarius ), 락토바실러스 델브루킬( Lactobacillus delbrukil ), 락토바실러스 람노수스( Lactobacillus rhamnosus ), 락토바실러스 불가리쿠스( Lactobacillus bulgaricus ), 락토바실러스 가세르리( Lactobacillus gaserli ), 락토바실러스 젠세 니 ( Lactobacillus jensenii ) 및 락토바실러스 스포로게네스( Lactobacillus sporogenes )를 포함하나 이들에 한정되지 않는 락토바실러스( Lactobacillus ) 속; 엔테로코쿠스 파에시움( Enterococcus faecium ) 및 엔테로코쿠스( Enterococcus thermophilus )를 포함하는 엔테로코쿠스( Enterococcus ) 속; 비피도박테리움 롱굼( Bifidobacterium longum ), 비피도박테리움 인판티스( Bifidobacterium infantis ) 및 비피도박테리움 비피둠( Bifidobacterium bifidum )을 포함하는 비피도박테리움( Bifidiobacterium ) 속; 바실러스 코아굴란스( Bacillus coagulans ), 바실러스 테르모필루스( Bacillus thermophilus ), 바실러스 라테로스포루스( Bacillus laterosporus ), 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ), 바실러스 메가테리움( Bacillus megaterium ), 바실러스 리케니포르미스( Bacillus licheniformis ), 바실러스 마이코이데스( Bacillus mycoides ), 바실러스 푸밀루스( Bacillus pumilus ), 바실러스 렌투스( Bacillus lentus ), 바실러스 세레우스( Bacillus cereus ) 및 바실러스 시르쿠란스( Bacillus circulans )를 포함하는 바실러스( Bacillus ) 속; 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida ), 슈도모나스 세파시아( Pseudomonas cepacia ), 슈도모나스 플루오레센스( Pseudomonas fluorescens ) 및 슈도모나스 679-2( Pseudomonas 679-2 )를 포함하는 슈도모나스( Pseudomonas ) 속; 스포로락토바실러스( Sporolactobacillus ) 속; 미크로모노스포라( Micromonospora ) 속; 미크로코쿠스( Micrococcus ) 속; 로도코쿠스( Rhodococcus ) 속 및 대장균( E. coli )이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 박테리아 균주(즉, 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) 및 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ))의 분리, 확인 및 배양은 표준 미생물학적 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 기술의 예는 문헌[Gerhardt, P. (ed.) Methods for General and Molecular Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, DC (1994) and Lennette, EH (ed.) Manual of Clinical Microbiology, Third Edition. American Society for Microbiology, Washington, DC (1980)]에서 찾아볼 수 있다.

즉, 본 발명의 박테리아 균주는 실시부의 실시예 1에 기술된 바실러스 서브틸리스 3( B. subtilis 3 ) 및 바실러스 리케니포르미스 31( B. licheniformis 31 )로부터 유도될 수 있다.

분리는 바람직하게는 고체 배지(예, 영양 한천 플레이트)상에서 표본을 스트리킹(streaking)하여 상술된 표현형 특성(phenotypic trait)(예, 호기적으로 내생포자를 형성할 수 있는 그람 양성)을 특징으로 하는 단일 콜로니를 수득하고, 오염되게 되고/되거나 변이주를 축적하게 되는 배양물과의 작용 가능성을 감소시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 박테리아 균주는 호기조건하에서 액체 배지중에서 증식될 수 있다.

본 발명의 박테리아 균주를 성장시키기 위한 배지로는 탄소원, 질소원 및 무기염, 및 특히 필요 물질, 예컨대 비타민, 아미노산, 핵산 등이 포함된다.

본 발명의 박테리아 균주를 성장시키는데 사용될 수 있는 적합한 탄소원의 예로는, 전분, 펩톤, 효모 추출물, 아미노산, 당, 예컨대 글루코오스, 아라비노스, 만노스, 글루코사민, 말토오스 등; 유기산, 예컨대 아세트산, 푸마르산, 아디핀산, 프로피온산, 시트르산, 글루콘산, 말산, 피루브산, 말론산 등의 염; 알콜, 예컨대 에탄올 및 글리세롤 등; 오일 또는 지방, 예컨대 대두유, 쌀겨유(rice bran oil), 올리브유, 옥수수유, 참깨유가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 첨가되는 탄소원의 양은 탄소원의 종류에 따라 달라지며, 전형적으로 배지 1 리터당 1 내지 100 그램이다. 바람직하게도, 글루코오스, 전분 및/또는 펩톤은 주된 탄소원으로서 배지에 0.1-5%(W/V)의 농도로 함유된다.

본 발명의 박테리아 균주를 성장시키는데 사용될 수 있는 적합한 질소원의 예로는 아미노산, 효모 추출물, 트립톤, 육즙(beef extract), 펩톤, 포타슘 니트레이트, 암모늄 니트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모니아 또는 이들의 배합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 질소원의 양은 질소원에 따라 달라지며, 전형적으로 배지 1 리터당 0.1 내지 30 그램이다.

무기염으로서, 포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디포타슘 하이드로겐 포스페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 클로라이드, 페릭 설페이트, 페로스 설페이트, 페릭 클로라이드, 페로스 클로라이드, 망가노스 설페이트, 망가노스 클로라이드, 아연 설페이트, 아연 클로라이드, 쿠프릭 설페이트, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트가 단독 또는 배합물로 사용될 수 있다. 무기산의 양은 무기염의 종류에 따라 달라지며, 전형적으로는 배지 1 리터당 0.001 내지 10 그램이다.

특히 필요한 물질의 예로는 비타민, 핵산, 효모 추출물, 펩톤, 미트(meat) 추출물, 맥아 추출물, 건조 효모 및 이들의 배합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

배양은 본 발명의 프로바이오틱 박테리아 균주를 성장시키는 온도, 주로 28℃ 내지 46℃에서 수행된다. 바람직한 온도 범위는 30-37℃이다.

최적의 성장을 위해, 배지의 pH는 바람직하게는 7.0-7.4로 조정된다.

상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 디프코(Difco, 마이애미주 디트로이트 소재)로부터 입수가능한 Nutrient Broth 또는 Nutrient Agar가 또한 본 발명의 박테리아 균주를 배양하는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.

배양 온도는 사용되는 배양 배지의 타입 및 주된 카본원으로서 당의 농도에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 전형적으로, 배양은 배양물의 포자형성이 80%에 도달하도록 24-96 시간 지속된다.

이로써 수득된 박테리아 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분리된다. 예로는 막여과 및 원심분리가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

pH는 소듐 하이드록사이드 등을 사용하여 조정할 수 있고, 배양물은 수함량이 4% 이하가 될 때까지 동결건조기를 사용하여 건조시킬 수 있다.

상술한 프로바이오틱 공-배양물은 상술한 바와 같이 각각의 균주를 증식시킴으로써 수득 될 수 있다. 적합한 배양 조건이 사용될 수 있을 때, 박테리아 균주들이 함께 배양될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본 발명의 박테리아 균주는 표준화의 용이를 위해 별도의 배양 배지에서 수득 될 수 있다.

각각의 박테리아 균주의 최종 농도는 바람직하게는 배합전 약 10 ⁹ 내지 10 ¹⁰ 유기체/㎖이다. 항균활성을 향상시키기 위해서는, 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ) 대 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )의 비가 부피:부피 기준으로 1:3이어야 한다. 그러나, 당업자라면 이러한 비가 사용되는 배양 배지, 배양물의 상대 연령(relative ages of the cutures) 및 그의 생육성에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다.

다량의 본 발명의 박테리아 균주가 생성되면, 품질을 검정하는 것이 바람직하다. 이러한 검정(qualification)은 생체내에서 위의 생존과 상관관계가 있는 위산에 대한 내성, 담즙산에 대한 내성, 점액 및/또는 인간 상피 세포 및 세포주에 대한 부착성(adherence), 잠재적인 병원성 박테리아에 대한 항균활성, 표면에 대한 병원체 접착력의 감소능 및 담즙염 하이드롤라아제 활성의 시험을 포함할 수 있다[Conway (1987) J. Dairy Sci. 70: 1-12].

본 발명에 따른 박테리아 균주의 광범위하고 높은 항박테리아 활성(실시부의 실시예 5-8 참조)은 다양한 위장장애의 치료 또는 예방에서의 그의 용도를 제시한다.

즉, 본 발명의 또다른 일면에 따라, 대상에서 위장장애를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

이 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 프로바이오틱 박테리아 균주를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 수행된다. 생육성 세포 이외에, 본 발명의 프 로바이오틱 박테리아에 의해 발현된 유리한 인자(beneficial factor)를 가진 사멸된(killed) 배양물 또는 조성물과 같은 생육불능(non-viable) 세포가 또한 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 이는 열로 사멸시킨 세포 또는 변경된 pH에의 노출 또는 가압에 의해 사멸된 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 생육불능 박테리아 산물을 포함하는 조성물의 생성 및 저장이 더욱 용이하다는 것이 이해될 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료"는 위장장애와 관련된 증상을 완화(alleviating) 또는 경감(diminishing)시키는 것을 말한다. 바람직하게도, 치료는 위장장애와 관련된 증상을 고친다(예, 실질적으로 제거한다).

본 발명의 박테리아 배양물로 치료될 수 있는 대상으로는 프로바이오틱 치료로 이로울 수 있는 인간 및 동물이 포함된다. 예로는 포유류, 파충류, 조류, 어류 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 프로바이오틱 균주를 사용하여 치료될 수 있는 위장장애의 예로는 급성 설사, 여행자 설사, 락토오스 불내증, HIV-관련 설사, 수크로오스 이소말타아제 결핍증, 염증성 장 질환, 주머니염(pouchitis), 발암, 경장영양(enteral feeding) 관련 설사, 항생제 관련 설사, 소장 박테리아 과도발육, 과민성 대장 증후군, 및 장병원성균(enteropathogenic), 이를테면 헬리코박터 파일로리( Helicobacter pylori ), 캄필로박터 제주니( Campylobacter jejuni ), 캄필로박터 콜리( Campylobacter coli ), 스타필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 스타필로코쿠스 에피데르미디스( Staphylococcus epidermidis ), 스트렙토코쿠스 파이오게네스( Streptococcus pyogenes ), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에( Streptococcus pneumoniae ), 엔테로코쿠스 파에칼리스( Enterococcus faecalis ), 해모필루스 인플루엔자에( Haemophilus inf luenzae ), 에스케리키아 콜리( Escherichia coli ), 클레브시엘라 뉴모니아에( Klebsiella pneumoniae ), 엔테로박터 클로아카에( Enterobacter cloacae ), 시트로박터 프로인디( Citrobacter freundii ), 세라티아 마르세센스( Serratia marcescens ), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ) 및 슈도모나스 말토필리아( Pseudomonas maltophilia ), 살모넬라( Salmonella ) 종 바이러스, 이를테면 로타바이러스, 및 진균, 이를테면 칸디다 알비칸스( Candida albicans ) 및 아스페르길루스 후미가투스( Aspergillus fumigatus ) 및 이들 종의 배합물과 관련된 장애가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

"Merck's Veterinary Manual"에는 본 발명의 이러한 일면에 따라 치료될 수 있는 동물의 위장장애의 상세한 설명이 제공되어 있다. 예로는 가스테로필루스( Gasterophilus ) 종, 이를테면 지아디아 인테스티날리스( G. intestinalis ), 지아디아 해모리오달리스( G. haemorrhiodalis ), 및 지아디아 나살리스( G. nasalis )에 의해 야기되는 호스 보트(horse bots), 립 보트(lip bots) 또는 트로트 보트(throat bots)를 포함하는 말의 병원체; 하브로네마( Habronema ) 종, 이를테면 하브로네마 무스카에( H. muscae ) 또는 하브로네마 미크로스토마 물루스( H. microstoma mulus )에 의해 야기되거나, 크라시아( Crascia ) 종, 이를테면 크라시아 메파스토마( C. mepastoma )에 의해 야기되거나, 트리코스트롱블루스( Trichostrongvlus ) 종, 이를테면 트리코스트롱블루스 악세이( T. axei )에 의해 야기되는 모양선충(stomach worms); 파라스카리스( Parascaris ) 종, 이를테면 파라스카리스 에시우오룸( P. eciuorum )에 의해 야기되는 아스카리드( ascarids )(화이트 웜(white worm)); 스트론크르블루스( Stroncrvlus ) 종, 이를테면 스트론크르블루스 불크라리스( S. vulcraris ), 스트론크르블루스 에푸이누스( S. epuinus ) 또는 스트론크르블루스 에덴타투스( S. edentatus )에 의해 야기되는 블러드 웜( blood worms )(팔리사드 웜(palisade worms), 레드 웜(red worms) 또는 스클레로스톰(sclerostomes)); 트리오돈토포루스( Triodontophorus ) 종, 이를테면 트리오돈토포루스 테누이콜리스( T. tenuicollis )에 의해 야기되는 맹장 및 결장의 소 스트론질(small strongyles); 옥스부리스( Oxvuris ) 종, 이를테면 옥스부리스 에아우이( O. eaui )에 의해 야기되는 요충(pinworms); 스트론시블로이데스 웨스테리( Stroncivloides westeri )에 의해 야기되는 장의 분선충 감염; 아논로세팔라( Anonlocephala ) 종, 이를테면 아논로세팔라 마크마( A. macma ) 및 아논로세팔라 페르폴리아타( A. perfoliata )에 의해 및 파라논로세팔라 마밀라나( Paranonlocephala mamillana )에 의해 야기되는 촌충(tapeworms)과 관련된 질병이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

해몬쿠스( Haemonchus ) 종에 의해 야기되는 와이어 웜(wire worm)(또는 바버 폴 웜(barber's pole worm) 또는 큰 모양선충)을 포함하는 다양한 다른 병원체는 반추동물, 전형적으로 소의 질병을 야기한다. 비-반추동물, 전형적으로 돼지에서 야기되는 병원체로는 보스트론크물루스( Hvostroncmulus ) 종에 의해 야기된 모양선충이 포함된다.

추가의 병원체가 다양한 동물 숙주를 감염시키는 것으로 알려져 있고, 따라서, 이들 병원체는 본 발명의 방법에 의한 치료의 표적이다. 예를 들어, 위장 병 원체는 다양한 동물을 감염시키며, 이들 병원체는 개과 동물(canine)에서 식도기생충(esophageal worms)을 유발하는 스피도세르카 루피( S. lupi )와 같은 스피로세르카( Spirocerca ) 종을 포함할 수 있다.

본 발명의 박테리아 균주는 프로바이오틱에 의해 치료될 수 있는 다른 질환 또는 장애(즉, 장관외)를 치료하는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.

다른 장기에서 박테리아, 진균 또는 바이러스 감염을 치료하는 본 발명에 따른 박테리아 균주의 능력은, 잠재적인 병원체의 이전을 저해함으로써 혈류 및 다른 조직 또는 장기의 감염을 방지할 수 있는 비면역원성 장 방어 장벽의 조장(promotion)을 비롯한 다중 방어 기전(multiple defense mechanisms)의 자극 결과이다[reviewed by Isolauri (2001) Am. J. Clin. Nut. 73: 444S-450S]. 또다른 방어 기전은 특히 장의 면역글루불린 A 반응을 통한 장의 면역학적 장벽의 개선 및 장 안정화 효과를 생성하는 장 염증반응의 완화, 및 또한 특히 염증전 및 항-염증성 사이토카인의 밸런스 조절을 통한 면역조절이다.

본 발명의 프로바이오틱 배양물로 치료될 수 있는 장관외 질환의 예로는 충수염, 자가면역 질환, 다발경화증, 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 소아지방변증, 당뇨병, 장기이식, 치주병, 비뇨생식계 질환(질, 요도 및 회음), 성매개질환, HIV 감염, HIV 복제, 수술 관련 외상, 수술-유도 전이성 질환, 패혈증, 체중 감소, 식욕부진, 열 억제, 악액질, 상처치유, 궤양, 장 장벽 기능, 알레르기, 천식, 호흡기 장애, 리노바이러스-관련 질환(예, 중이염, 부비동염, 천식 및 폐 질환), 순환기 장애, 관상동맥심질환, 빈혈, 혈액응고계 장애, 신질환, 중추신경계 장애, 간질환( 예, 간성 뇌병증), 변비, 허혈, 영양장애, 골다공증, 내분비샘 장애, 표피 장애, 건선, 탄저병 및/또는 여드름이 포함되나 이들에 한정되지 않는다[실시예 5-8, 미국 특허출원 제20030113306호, Rolfe (2000) Jo urnal of Nutrition 130: 396S-402S 및, 배경기술부 참조].

본 발명의 이러한 일면에 따라 투여되는 프로바이오틱 미생물의 전형적인 농도 범위는 10 ³ -10 ¹³ 세포/일이다. 바람직하게도, 적어도 약 10 ⁶ 세포/일, 적어도 약 10 ⁷ 세포/일, 적어도 약 10 ⁸ 세포/일이 프로바이오틱 투여에 사용된다(미국특허 제 6,221,350 호 및 제 6,410,305호 참조). 그러나, 투여될 박테리아의 양은 대상의 크기, 장애의 형태 및 증상의 중증도를 비롯한 다수의 파라미터에 따라 달라질 것임이 이해될 것이다.

본 발명의 박테리아 배양물은 영양 조성물(예, 식료품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제)로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 박테리아 균주는 미국특허 제 6,156,320 호에 기술된 바와 같이 발효 유제품(즉, 영양보조식품)에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리아 균주는 의도하는 용도에 따라 선택되는, 투여경로의 임의의 형태에 대한 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 약학조성물로 제형화될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "활성성분"은 생물학적 효과가 있는 박테리아 제제를 말한다.

본 명세서에 사용된 "약학조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 본 명세서에 기술된 하나 이상의 활성성분의 제제를 말한다. 약학조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물 투여를 촉진하는 것이다.

이후에서, 서로 혼용가능하게 사용될 수 있는 어구 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 유기체에 유의적인 자극을 일으키지 않으며 생물학적 활성 및 투여되는 화합물의 특성을 파괴하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 보조제가 이들 어구에 포함된다. 약제학적으로 허용가능한 담체에 포함되는 성분의 하나는 예를 들어 유기 및 수성 매질 둘다에서 광범위한 용해도를 가진 생체적합성 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 비한정적인 예로는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당, 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 야채유 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

약물의 제형화 및 투여에 대한 기술은 본 명세서에 참고로서 포함되는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에서 찾아볼 수 있다.

담체 이외에, 본 발명의 약학조성물 또는 영양 조성물은 또한 콜로니형성(colonization) 담체, 영양소, 항균제, 항진균제, 항산화제, 식물 추출물, 완충제, 착색제, 향미제, 비타민 및 미네랄을 포함할 수 있으며, 이들은 의도하는 용도 및 사용되는 투여 경로에 따라 선택된다.

콜로니형성 담체 - 본 발명의 조성물은 대장 또는 위장관의 다른 영역으로 프로바이오틱 미생물을 운반하는 콜로니형성 담체를 포함할 수 있다. 전형적으로, 담체는 사카라이드, 이를테면 아밀로오스, 인슐린, 펙틴, 구아검, 키토산, 덱스트란, 사이클로덱스트린 및 콘드로이틴 설페이트이다[Chourasia and Jain (2003) J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 6: 33-66].

바람직하게도, 변형 및/또는 비변형 내성 전분이 콜로니형성 담체로서 사용된다(미국특허 제 6,221,350 호 참조).

어구 "내성 전분"은 문헌[Brown, McNaught and Moloney (1995) Food Australia 47: 272-275]에 정의된 바와 같이 RS1, RS2, RS3 및 RS4로서 정의된 전분 형태를 말한다. 전형적으로, 내성 전분은 본래 대장에 도달될 때까지 분해되지 않기 때문에 프로바이오틱 조성물에 사용될 수 있다. 따라서, 일단 대장에 도달하면 프로바이오틱 미생물에 의한 발효에 쉽게 이용가능한 물질을 제공한다. 바람직하게도, 내성 전분은 50% w/w 이상, 특히 80% w/w 이상의 아밀로오스 함량을 가진 옥수수 전분, 27% w/w 이상의 아밀로오스 함량을 가진 쌀 및 밀 전분; 및 50% 이상의 아밀로오스 함량을 가진 특정의 과립상 크기 범위의 전분 및 강화된 내성 전분(여기서, 이들 전분은 옥수수, 보리, 밀 및 콩을 포함함)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 고 아밀로오스 전분이다. 바나나 또는 다른 과일류, 감자와 같은 덩이줄기, 및 이들의 혼합물 또는 배합물과 같은 소스(source)로부터 유도된 다른 형태의 내성 전분이 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

예를 들어 과립 및/또는 과립 표면의 전하, 밀도 또는 소수성을 변화시켜 미 생물과 내성 전분 사이의 결합 적합성(attachment compatibility)을 향상시키는 것에 의해 전분을 화학적으로 변형시키는 것이 유리할 수 있음이 이해될 것이다. 에테르화, 에스테르화, 산성화 등과 같은 화학적 변형법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 전분을 변형시키는데 사용될 수 있다. 또한, 변형법은 미국특허 제 6,221,350 호에 기술된 바와 같이 물리적 또는 효소적으로 유도될 수 있다.

콜로니형성 담체는 또한 올리고사카라이드일 수 있다. 올리고사카라이드는 위장관내에서 프로바이오틱 미생물의 수를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 콜로니형성 담체로서 사용될 수 있는 상업적으로 입수가능한 올리고사카라이드의 예로는 프룩토-, 갈락토-, 말토-, 이소말토-, 젠티오-, 크실로-, 팔라티노스-, 소이빈-(라피노스 및 스타킬오스 포함), 키토-, 아가로-, 네오아가로-, α-글루코-, β-글루코-, 사이클로-이눌로-, 글리코실수크로오스, 락토오스, 락토수크로오스 및 크실로오스가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

올리고사카라이드는 약 0.01 내지 10 %(w/w)의 농도로 조성물에 사용될 수 있다. 바람직하게도, 올리고사카라이드의 농도는 약 0.05 내지 5 %이다.

바람직하게도, 전분과 올리고사카라이드의 배합물은 본 발명의 이러한 일면의 콜로니 형성제로서 사용될 수 있다.

항생제 - 본 발명의 조성물은 치료학적 유효량의 바람직하게는 광역 항생제를 포함할 수 있다. 본 발명의 박테리아 균주에 영향을 미치지 않는 항생제 또는 그의 농도를 포함하도록 취한다(아래 표 4 참조). 예를 들어, 본 발명의 박테리아 균주는 세팔로스포린 항생제 군의 세푸록심(Cefuroxime)과 같은 항생제의 치료선량 (therapeutic dose)과 배합될 수 있다. 그러나, 다른 항생제가 또한 본 발명의 이러한 일면에 따라 사용될 수 있다[Fursikova TM, Sorokulova IB, Sergiychuk MG, Sichkar SV, Smirnov VV (2000) The effect of antibiotics and their combination with probiotics on mice intestine microflora, Microbiologichny Zhurnal, 62, N3, 26-35].

본 발명의 치료학적 조성물은 단위 조성물 당 대략 1-250 mg의 선택된 항생제를 함유할 수 있다.

항진균제 - 본 발명의 조성물은 치료학적 유효량의 항진균제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 전형적인 항진균제로는 클로트리마졸(Clotrimazole), 플루코나졸(Fluconazole), 이트라코나졸(Itraconazole), 케토코나졸(Ketoconazole), 미코나졸(Miconazole), 나이스타틴(Nystatin), 테르비나핀(Terbinafine), 테르코나졸(Terconazole), 티오코나졸(Tioconazole) 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

항산화제, 완충제, 식물 추출물, 착색제, 향미제, 비타민 및 미네랄 - 본 발명의 조성물은 항산화제, 완충제, 식물 추출물, 및 다른 제제, 이를 테면 착색제, 향미제, 비타민 및 미네랄을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 다음의 미네랄을 하나 이상 함유할 수 있다: 칼슘 시트레이트(15-350 mg); 포타슘 글루코네이트(5-150 mg); 마그네슘 시트레이트(5-15 mg); 및 크롬 피콜리네이트(5-200 ㎍). 또한, 칼슘 시트레이트, 포타슘 글루코네이트, 마그네슘 시트레이트 및 크롬 피콜리네이트를 비롯한 각종 염이 사용될 수 있다. 화학물질은 스펙트럼 퀄러티 프로덕츠 인코포레이션(Spectrum Quality Products, Inc, 캘리포니아주 가디 나 소재), 시그마 케미칼스(Sigma Chemicals, 미주리주 세인트 루이스 소재), 셀트저 케미칼스 인코포레이션(Seltzer Chemicals, Inc., 캘리포니아주 칼스버드 소재) 및 자르켐 인더스트리즈 인코포레이션(Jarchem Industries, Inc., 뉴저지주 뉴워크 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 식물 추출물의 예로는 캐모마일, 가시금잔화(bur-marigold), 세인트 존스 워트(St. John's wort), 진저(ginger) 및 FDA 승인된 그 외의 승인된 식물 추출물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다[검토예, O'Hara M, Kiefer D, Farrell K, Kemper K. Arch Fam Med. (1998) Nov-Dec; 7 (6): 523-36.; Modesto A, Lima KC, de Uzeda M. ASDC J Dent Child. (2000) Sep-Oct; 67 (5): 338-44, 302; Lee KG, Shibamoto T. J Agric Food Chem. (2002) Aug 14; 50 (17): 4947-52].

증점제 - 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 또는 카복시메틸셀룰로오스와 같은 증점제가 조성물에 첨가될 수 있다.

담체 - 본 발명에 따른 조성물의 활성성분(예, 박테리아 세포)은 투여되는 종의 조직과 생리학적으로 적합한(즉, 인간 소비(consumption) 또는 동물 소비에 적합한) 담체와 배합된다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 담체는 정제, 캡슐 또는 분말 형태로의 제형화를 위한 고체-기제의 건조 물질일 수 있다. 또한, 담체는 액체 또는 겔 형태로의 제형화를 위한 액체 또는 겔-기제 물질일 수 있다. 담체의 특정 형태 및 최종 제형은 일부 선택되는 투여경로에 따라 달라진다.

건조 제형에 전형적인 담체로는 트레할로스, 말토-덱스트린, 쌀가루, 미결정성 셀룰로오스(MCC), 마그네슘 스테아레이트, 이노시톨, 플룩토-올리고사카라이드 (FOS), 글루코--올리고사카라이드(GOS), 덱스트로오스, 수크로오스 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 조성물이 건성이고 조성물을 케이크화(cake)(즉, 구성성분 포자, 염, 분말 및 오일의 부착)시킬 수 있는 증발유를 포함하는 경우, 구성성분을 분포시키고 케이크화를 방지하는 건조 충진제(dry filler)를 포함하는 것이 바람직하다. 예시적인 안티케이크화제(anti-caking agent)로는 MCC, 탈크, 규조토, 비정질 실리카, 젤라틴, 사카로오스, 탈지분유 분말, 전분 등이 포함되며, 이들은 전형적으로 대략 1 내지 95 중량%의 양으로 첨가된다. 이후 재수화되거나(예, 액제) 건조 상태로 제시되는(예, 츄어블 웨이퍼(chewable wafer), 펠렛 또는 정제) 건조 제형이 최초 수화된 제형보다 바람직하다는 것이 이해될 것이다. 건조 제형(예, 분말)은 상업적으로 입수가능한 식품(예, 액제, 정제 식품 또는 음료수)을 보충하는데 사용될 수 있다.

적합한 액체 또는 겔-기제 담체로는 물 및 생리식염수; 우레아; 알콜 및 유도체(예, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올); 글리콜(예, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게도, 수-기제 담체는 중성의 pH 값(즉, pH 7.0)을 갖는다.

메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜 및 에틸렌디아민 테트라아세테이트 염을 비롯한 방부제가 또한 담체내에 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜(MW=800 내지 20,000의 바람직한 분자량을 가짐)과 같은 가소제를 포함할 수 있다. 담체의 조성은 활성성분의 약리활성 또는 본 발명에 따른 박테리아 균주의 생육성을 유의적으로 방해하지 않는한 변화될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 따라 사용될 수 있는 담체의 다른 형태가 이후에 기술된다.

포자 발아 저해제 - 포자를 함유하는 액체-기제 조성물이 제공되는 경우, 장기 저장을 조장하도록 포자 발아 저해제를 포함하는 것이 바람직하다. 임의의 포자 발아 저해제가 사용될 수 있다. 바람직한 저해제로는 고염성 담체, 메틸파라벤, 구아 검, 폴리솔베이트 방부제 등이 포함된다.

영양 보충제 - 본 발명의 조성물의 영양 보충제 성분은 비타민, 미네랄, 필수 또는 비필수 아미노산, 카보하이드레이트, 지질, 식료품, 건강보조식품 등을 포함하는 당업계에 널리 알려진 각종 영양제중 어느 것을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 섬유질, 효소 및 다른 영양소를 포함할 수 있다. 바람직한 섬유질로는 차전초, 쌀 겨, 귀리 겨, 옥수수 겨, 밀 겨, 과일 섬유질 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 락타아제, 아밀라아제, 글루카나아제, 카탈라아제 등과 같은 건강보조 또는 보충 효소가 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 비타민으로는 비타민 B, C, D, E, 엽산, K, 니아신 등이 포함된다. 일일 소비하도록 권장된 일일권장량(RDA)의 것들이 전형적인 비타민이다.

본 발명의 약학조성물은 의도한 용도에 따라 제형화된다. 통상적인 제형화 기술의 재고는 문헌["The Theory and Practice of Industrial Pharmacy" (Ed. Lachman L. et al, 1986) or Laulund (1994)]에서 찾아볼 수 있다.

임의의 경우에, 적합한 투여 경로로는 예를 들어 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사 뿐만 아니라 근육내, 피하 및 골수 주사를 포 함하여 국소, 질내, 경요도, 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장관내 또는 비경구 전달이 포함될 수 있다.

주사용의 경우, 본 발명의 활성 성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 이를테면 핸크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염 완충액으로 제형화될 수 있다.

경점막 투여의 경우, 장벽을 침투하기에 적합한 침투제가 제형화에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 화합물은 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체와 배합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로서 제형화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고형 부형제를 사용하고 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충진제(filler), 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트리가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 폴리머이다. 필요에 따라, 붕괴제, 이를테면 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염이 첨가될 수 있다.

적합한 코팅에 의해 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량이 상이한 배합물임을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약학조성물로는 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 제조된 연성 밀봉 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐제(push-fit capsule)가 포함된다. 압입형 캡슐제는 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 활성성분을 포함할 수 있다. 연성 캡슐제의 경우, 활성성분은 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.

본 발명의 조성물이 경장적으로-코팅된(enterically-coated) 서방성 캡슐 또는 정제로 캡슐화될 수 있음이 이해될 것이다. 경장적 코팅은, 위장관을 통과하기 때문에 소장에 도달할 때까지 캡슐/정제가 완전하게(즉, 용해되지 않게) 유지되게 한다.

구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.

비강내 흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성성분은 적합한 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용함으로써 가압팩 또는 분무기로부터 통상 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다. 가압형 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다(미국특허 제 6,448,224호 참조). 디스펜서로 사용하기 위해 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제와 화합물의 분말 혼합물을 함유하는 예를 들어 젤라틴의 캡슐제 및 카트리지로 제형화될 수 있다.

본원에 기술된 제제는 비경구 투여를 위해 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 제형화될 수 있다.

살아있는 박테리아 세포의 비경구 투여에 대한 다수의 예가 당업계에 공지되어 있다[참조예, Tjuvajev (2001) J. Control Release 74 (1-3): 313-5. Rosenberg (2002) J. Immunother. 25: 218-25; Sheil (2004) Gut 53 (5): 694-700; 및 Matsuzaki (2000) Immunol. Cell Biol. 78(1): 67-73]. 본 발명의 박테리아 세포가 또한 면역반응을 조절하도록 약독화된 형태(attenuated form)로 투여될 수 있음이 이해될 것이다[Matsuzaki (2000) Immunol. Cell Biol. 78 (1): 67-73].

주사용 제형은 임의로 첨가되는 방부제와 함께 단위 투여형, 예를 들어 앰풀(ampoule) 또는 다중투여(multidose) 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁제, 용액제 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제(formulatory agent)를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약학조성물은 활성제제의 수용액을 수-가용성 형태로 포함한 다. 또한, 활성성분의 현탁제는 적합한 유성 또는 수성 기제 오일 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 적합한 안정화제 또는 활성성분의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액제를 제조가능케 하는 제제를 함유할 수 있다.

또한, 활성성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수 기제 용액과 함께 구성하기 위해 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 제제는 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기제를 사용하여 좌제 또는 정체관장제와 같은 직장형 조성물로 제형화될 수 있다.

생식기 적용에 적합한 제형으로는 크림, 연고, 로션, 젤리, 용액제, 유제, 스프레이 또는 포말 제형이 포함된다.

본 발명의 약학조성물은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정화, 분말화, 유화, 캡슐화, 인트래핑(entrapping) 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다.

질 투여에 적합한 제형은 질좌제, 탐폰(tampon), 크림, 겔, 페이스트, 젤리, 포말 또는 스프레이 또는 수성 또는 유성 현탁제, 용액제 또는 유제(즉, 액제), 또는 당업계에 적합한 것으로 알려진 담체를 함유하는 필름일 수 있다(미국특허 제 5,756,681호에 상세 기재됨).

질에 적용하기에 적합한 조성물은 미국특허 제 2,149,240, 2,330,846, 2,436,184, 2,467,884, 2,541,103, 2,623,839, 2,623,841, 3,062,715, 3,067,743, 3,108,043, 3,174,900, 3,244,589, 4,093,730, 4,187,286, 4,283,325, 4,321,277, 4,368,186, 4,371,518, 4,389,330, 4,415,585, 4,551,148, 4,999,342, 5,013,544, 5,227,160, 5,229,423, 5,314,917, 5,380,523 및 5,387,611 호에 개시되어 있다.

경요도 투여의 경우, 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 유도체와 함께 하나 이상의 선택된 담체 부형제, 이를테면 물, 실리콘, 왁스, 바셀린, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 프로필렌 글리콜(PG), 리포솜, 당, 예컨대 만니톨 및 락토오스, 및/또는 다양한 다른 물질을 함유한다. 약학조성물이 하나 이상의 경요도 침투 증강제, 즉 선택된 약물이 요도막을 침투하는 속도를 증가시키도록 작용하는 화합물을 함유하는 것이 바람직하다. 적합한 침투 증강제의 예로는 디메틸설폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), N,N-디메틸아세트아미드(DMA), 데실메틸설폭시드, 폴리에틸렌글리콜 모노라우레이트(PEGML), 글리세롤 모노라우레이트, 레시틴, 1-치환된 아자사이클로헵탄-2-온, 특히 1-n-도데실사이클라자-사이클로헵탄-2-온(캘리포니아 이르빈 소재 넬슨 리서치 앤드 디벨롭먼트 코포레이션(Nelson Research & Development Co.)으로부터 상표명 Azone ^RTM 하에 입수가능), SEPA ^RTM (매사추세츠 렉싱톤 소재 마크로켐 코포레이션(Macrochem Co.)으로부터 입수가능), 알콜(예, 에탄올), 예를 들어 Tergitol ^RTM , Nonoxynol-9 ^RTM 및 TWEEN-80 ^RTM 을 비롯한 계면활성제, 및 에탄올과 같은 저급알콜이 포함된다. W091/16021에 기술된 바와 같이, 제제의 경요도 투여는 다수의 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제제는 가요성 튜브, 압착 용기(squeeze bottle), 펌프 또는 에어로졸 스프레이로부터 요도내로 도입될 수 있다. 제제는 또한 요도내에서 흡수, 용융 또는 생체내분해되는(bioeroded) 코팅, 펠렛 또는 좌제내에 함유될 수 있다. 특정의 일례로, 제제는 페니스 삽입물(penile insert) 외면상의 코팅에 포함된다.

본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 약학조성물은 의도하는 목적을 달성하는데 유효한 양으로 활성성분이 함유된 조성물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 치료학적 유효량은 치료할 대상의 생명을 연장하거나 질환의 증상을 예방, 완화 또는 경감시키는데 효과적인 활성성분의 양을 의미한다.

치료학적 유효량은 당업자들에 의해 결정될 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 박테리아 종(즉, 활성성분)은 최종 조성물의 1-90 중량%, 더욱 바람직하게는 5-90 중량%, 더욱더 바람직하게는 10-90 중량%를 구성할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 15-88 중량%를 투여에 적합한 제형내에 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 조성물의 1회 투여량 당 적어도 10 ⁶ 개, 더욱 바람직하게는 적어도 10 ⁸ 개, 더욱더 바람직하게는 적어도 10 ¹⁰ 개의 생(viable) 박테리아를 함유할 수 있다.

본원에 기술된 활성성분의 치료 효능 및 독성은 시험관내, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 방법에 의해 결정될 수 있다(다음의 실시부 실시예 1-4 참조). 이들 시험관내, 세포 배양물 에세이 및 동물 연구에 의해 수득된 데이터는 인간에게 사용하기 위한 용량 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 경로 및 사용하는 투여형태에 따라 변할 수 있다. 적합한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태를 고려하여 의사 개인에 의해 선택될 수 있다. (참조예. Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 pl).

치료할 상태의 중증도 및 반응도에 따라, 수일 내지 수주 내내 또는 병을 고치거나 증상이 감퇴될 때까지 치료하는 과정으로서 단일 또는 복수 투여될 수 있다.

투여되는 조성물의 양은 물론 치료할 대상, 고통의 정도, 투여 방식, 처방하는 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.

적합한 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조하여 적절한 용기에 넣고 처방된 상태를 써넣은 라벨을 붙일 수 있다.

본 발명의 조성물은 필요에 따라 활성성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 담을 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치, 이를테면 FDA에 의해 승인된 키트(kit)로 제시될 수 있다. 발포(blister) 팩과 같은 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 포일(foil)을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투약 설명서가 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 또한 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 행정기관에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태 또는 인간 또는 가축 투여에 대한 기관의 승인을 반영 한다. 이러한 통지서는 예를 들어 처방약에 대한 미국 식품의약청의 승인 라벨이거나 승인된 제품 전단일 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 박테리아 균주는 본 발명의 조성물에 포자형성된 형태로 포함될 수 있다. 포자를 생성하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 또한, 박테리아 균주는 동결건조된(건조된) 세포 덩어리(cell mass)의 형태로 조성물에 포함될 수 있다.

포자는 고온에 대해 내성을 가지기 때문에(예, 90℃에서 10분간), 포자는 예를 들어 뜨거운 물로 용해시키거나 혼합시킨 건조 또는 동결건조 생성물내로 혼입될 수 있다. 박테리아 포자는 제조하는 동안 소비자에 의하거나 제조자에 의해 건조 또는 동결건조 제품내로 혼입될 수 있다. 이들 건조 또는 동결건조 제품으로는 티백(tea bag), 커피(예, "동결-건조" 또는 분쇄), 감미료(예, 합성(NukaSweet ^RTM ) 및 천연); 핫 시리얼(예, 오트밀, Wheat ^RTM 의 크림 등), 뜨거운 음료 조미료(condiment)/향미제 및 크리머 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

또한, 포자는 건조 또는 동결건조 제품으로서 사용될 수 있거나, 충치 형성, 치은염, 및 효모에 의해 야기되는 구강 감염 또는 치주병의 다른 형태, 단순헤르페스 I, 및 구강 병원체에 의해 야기되는 각종 다른 감염을 저해하도록, 츄어블 정제, 치약, 양치용 물약, 경구 적제(oral drop) 등에 혼입될 수 있다.

결장에 프로바이오틱 박테리아를 직접 투여하기 위해(관장제 등을 통해), 박테리아 세포 또는 포자가 수용액(예, 생리식염수)내에 혼입될 수 있음이 이해될 것 이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 동물에 제공될 수 있다.

전형적으로, 프로바이오틱 조성물은 사료에 첨가되는 사료 첨가제를 통해 동물의 위장관에 도입된다. 대안적인 투여의 방법은 액체 섭취, 페이스트 또는 겔의 섭취, 볼(boles), 동물의 표면에 살포되는 분말 등이다.

프로바이오틱 박테리아 세포 이외에, 사료 첨가제는 예를 들어 석회암 및 위트 미드(midds)와 같은 담체 물질을 포함할 수 있다(미국특허 제 6,410,305 호 참조). 사료 첨가제는 동물 사료 1톤당 0.01 내지 10, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5 파운드의 사료를 첨가하는 비율로 동물의 일상적 음식에 첨가될 수 있다.

사료 첨가제는 약 0.3 내지 약 20 중량%의 프로바이오틱 박테리아 세포를 함유할 수 있다. 바람직하게도, 사료 첨가제는 7 내지 15 중량%의 프로바이오틱 프리믹스(premix), 가장 바람직하게는 약 10 내지 13 중량%의 프로바이오틱 프리믹스를 함유한다.

본 발명의 프로바이오틱 미생물이 장 상피에 부착하지 않음이 또한 이해될 것이다. 즉, 반복 투여하지 않아도, 박테리아는 최대 대략 3-5일 동알 위장관에 머무르며, 일과성 균무리인 것으로 판단된다. 비교적 빠른 위장-청소시간(clearance time) 및 위장 상피에의 바실러스 코아굴란스( Bacillus coagulans )의 부착불능성은 예를 들어 면역약화 개체에서 균혈증의 후기 발생(later development)을 방지하는 이점을 가진다.

본 발명의 박테리아 균주 및/또는 조성물은 상술한 바와 같은 특정 장애를 치료하기 위해 확인된 제품에 포함될 수 있다. 전형적으로, 제품은 박테리아 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 함유하는 패키지(package)의 형태로 또는 포장재와 결합된 형태이다. 포장재는 박테리아의 생육성을 유지하도록 선택되며, 예를 들어 패키지 성분의 용도에 대한 라벨 또는 설명서를 포함한다. 설명서는 본 발명의 방법 또는 조성물에 대해 본 명세서에 설명된 바와 같은 패키지 성분의 용도, 내용물(예, 속, 종, 균주명), 보존기간 말기에 생육가능한 박테리아의 최소 수, 적합한 저장 조건 및 소비자 정보를 위한 상세한 회사 연락처를 표시한다. 라벨은 또한 제품의 신선도와 관련된 정보를 제공할 수 있다. 이 정보는 제조일, "판매 유효 기한(sell by date)" 또는 "품질 유지 기한(best before date)"을 포함할 수 있다. 제품이 상인 또는 소비자에 의해 처리되어야 할 때 "품질 유지" 기한이 명시된다. 대안적으로 또는 추가적으로 "액티브 라벨링(active labeling)"이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제 4,292,916, 5,053,339, 5,446,705 및 5,633,835 호에는 부패하기 쉬운 제품의 보존기간을 모니터링하기 위한 변색 디바이스(color changing device)가 설명되어 있다. 이들 디바이스는 반응이 시작되도록 반응층과 물리적으로 접촉시킴으로써 개시되며, 이 행위는 통상적으로 포장시에만 수행될 수 있다. 이 접근법은 모든 유통망 도처에서 신선도를 떨어뜨리는 식료품의 부패를 모니터링하는데 적합하다. 미국특허 제 5,555,223호에는 타이머 시계를 정확한 생산시간으로 설정하는 단계를 포함하여 포장에 타이밍 표시기(timing indicator)를 부착하는 방법이 개시되어 있다.

의도하는 용도에 따라, 제품은 임의로 하나 이상의 다음의 성분을 결합하여 또는 분리된 패키지로 함유할 수 있다: 콜로니형성 담체, 향미제, 담체 등의 성분. 예를 들어, 제품은 프로바이오틱을 치료법으로 사용하기 위한 식과 결합하기 위한 설명서와 함께 통상의 액체 제품과 결합하여 사용하기 위한 포자를 포함할 수 있다.

본 발명의 박테리아 균주는 또한 의약 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 이러한 전달 시스템이 본질적으로 유아, 노령자 및 면역기능이 손상된 인간을 비롯한 인간에게서 약독화 병원체를 사용하는 것보다 더 안전하다는 것이 이해될 것이다[Grangette (2001) Infect. Immun. 69: 1547-1553].

본 발명의 박테리아 균주는 또한 당업계에 널리 알려진 발현 시스템을 사용하여 이종발현(heterologous expression) 제품을 표시하도록 변형될 수 있다. 이러한 접근법은 IL-10-분비 L. 락티스(L. lactis) 균주로 위내 투여된 마우스의 대장염을 감퇴시키는데 사용되었다.

본 발명의 추가의 목적, 장점 및 신규한 특징은 비한정적인 하기 실시예의 실험을 통해 당업자들에게 자명할 것이다. 또한 상기 설명되고 이하 청구 범위에서 청구하는 본 발명의 다양한 일례 및 일면은 하기 실시예를 통해 실험적으로 입증될 것이다.

실시예

상기한 설명과 함께 하기 실시예를 참고하여 본 발명을 비한정적으로 설명한 다.

일반적으로, 본 명세서에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 실험 과정은 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다[참조예, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, RM, ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al., (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국특허 제 4,666, 828호; 제 4,683,202호; 제 4,801,531호; 제 5,192,659호 및 제 5,272,057호에 설명된 방법; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, JE, ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan JE, ed. (1994); Stites et al., (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", WH Freeman and Co., New York (1980)]; 이용가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 널리 기술되어 있다[참조예, 미국특허 제 3,791,932호; 제 3,839,153호; 제 3,850,752호; 제 3,850, 578호; 제 3,853,987호; 제 3,867,517호; 제 3,879,262호; 제 3,901,654호; 제 3,935,074호; 제 3,984,533호; 제 3,996,345호; 제 4,034,074호; 제 4,098,876호; 제 4,879,219호; 제 5,011,771호 및 제 5,281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, MJ, ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, BD, and Higgins SJ, eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, BD, and Higgins SJ, Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, RI, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)](본원에 충분히 설명된 바와 같이 언급된 모든 참고문헌은 참고로서 본원에 포함된다). 이 문서 전체를 통해 다른 일반 문헌이 제공된다. 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고 독자의 용이를 위해 제공된다. 이에 포함된 모든 정보는 본 명세서에서 참고적으로 인용된다.

실시예 1

프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실 러스 리케니포르미스 PA(Bacillus lichenirormis PA)의 분리

프로바이오틱 유기체 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ) 및 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )를 우유 한천으로의 순차적 이전 및 리소자임 생성에 대한 선별에 의해 B. 서브틸리스 3(B. S ubtilis 3 ) 및 B. 리케니포르미스 31( B. licheniformis 31 )(즉, 바이오스포린)으로부터 분리하였다.

실험 방법

카제인 분해 활성에서의 클론 선별 - 50㎖의 증류수중 5g의 탈지분유 분말(Medallion Milk Co Ltd, 10-59 Scurfield Blvd, Winnipeg, Manitoba, Canada; The Carbery Group, Ballineen Co. Cork, Ireland)을 포함하는 우유액; 및 50㎖의 증류수중 1g의 한천(Oxoid, Laboratory Preparations)을 포함하는 한천 용액을 제조하여 우유 한천을 제조하였다. 각 용액을 20분동안 121℃에서 오토클래이브하고 방치시켜 45℃로 냉각시켰다. 오토클래이브시킨 용액을 함께 혼합하고 페트리 디쉬(Falcon)에 부었다. 분리된 콜로니로서 우유 한천에서 박테리아를 배양하였다. 고도의 카제인 분해 활성을 갖는 콜로니를 우유 한천상의 또다른 이전을 위해 선별하였다. 상기 공정을 5회 반복한 후, 선별된 클론을 리소자임 생성을 위해 선별하였다.

리소자임을 생성하는 클론의 선별 - 각 박테리아 배양물을 영양 한천[Difco, Detroit, MI]를 포함하는 페트리 디쉬상에 플레이팅시키고 24시간동안 37℃에서 배양하여 분리된 콜로니를 수득하였다. 각 콜로니를 또다른 플레이트로 이동시키고 플레이트를 종 모양의 유리 그릇(bell jar)에 놓고 그를 20분동안 포화된 클로로포름 증기 대기에 노출시켜 모(parental) 플레이트상의 박테리아를 사멸시켰다[Harasawa et al. (1980) Antimicrob. Agents Chemother. 18: 58-62]. 이어서, 미크로코쿠스 루테우스( Micrococcus luteus ) CCM 1423 (10 ⁶ CFU/㎖)을 포함하는 박층 의 0.8% 영양 한천으로 생육성 박테리아를 포함하는 플레이트를 덮고 37℃에서 24-48시간동안 인큐베이션시켰다. 미크로코쿠스 루테우스( Micrococcus luteus ) 성장 저해 구역이 관찰되었고 고도한 리소자임 생성을 나타내는 클론을 다음 회차의 선별을 위해 선별하였다. 모두 7회에 걸쳐 선별하였다.

실시예 2

프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 특징화

재료 및 실험 방법

내생포자 형성 - 37℃에서 24-72시간동안 망간을 포함하는 영양 한천(육즙, 3g; 펩톤, 5g; 가수(hydrous) 망간 설페이트, 5 mg; 한천, 15g; 증류수, 1000㎖; pH 6.8)상에서 박테리아 균주를 배양하였다. 염수중 혼탁한 박테리아 현탁액을 슬라이드상에 놓고 유리로 덮었다. 위상차 현미경을 사용하여 포자를 관찰하였다.

카탈라아제 활성 - 경사진 영양 한천상에서 1 또는 2일동안 성장시킨 박테리아 배양물을 0.5㎖의 10% 과산화수소에 잠기게 하고 앞서 기술된 바와 같이 기체 생성을 측정하였다[Sneath, PHA (1986) Endospore-forming gram-positive rods and cocci. In: Sneath, PHA, Mair, NS, Sharpe, ME, and Holt, JG(ed.), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, pp.1104-1207].

난황 브로쓰(broth) 제조 및 레시티나아제 생산 - 트립톤, 10g; 디소듐 하이 드로겐 포스페이트, 5g; 포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 1g; 소듐 클로라이드, 2g; 마그네슘 설페이트 7H ₂ O, 0.1g; 글루코오스, 2g; 증류수, 1000㎖를 포함하는 기초배지(pH 7.6)를 제조하고, 121℃에서 오토클래이브시키고 20분동안 냉각시켰다. 무균 흡입된 1.5㎖의 난황(또는 제조사의 지시에 따라 사용되는 시판용의 멸균 시료)을 100㎖의 기초배지에 가하였다. 배지를 4℃에서 밤새도록 방치시켰다. 상등액을 2.5-㎖ 분취량으로 멸균 튜브에 분배하였다. 난황을 첨가하지 않는 기초 배지를 유사하게 분배하였다. 박테리아를 대조군 브로쓰 및 난황 브로쓰 튜브에 접종하였다. 37℃에서 1, 3, 5 및 7일동안 인큐베이션시킨 후, 난황을 포함하는 배지중 또는 그의 표면상에서 다량의 백색 침전물이 출현한 것이 관찰되었다.

호기성 성장 - 배양 튜브의 바닥을 뭉뚝하게 하여(stubbing) 형성된 작은(외경 1.5mm) 루프 영양 브로쓰 배양물과 함께 깊이가 75-mm인 호기성 한천(트립티카아제, 20g; 글루코오스, 10g; 소듐 클로라이드, 5g; 한천, 15g; 소듐 티오글리콜레이트, 2g; 소듐 포름알데히드 설폭실레이트, 1g; 증류수, 1 리터, pH 7.2.)을 포함하는 튜브에 박테리아 배양물을 접종하였다. 박테리아를 37℃에서 인큐베이션시키고 3 및 7일째 성장을 기록하였다.

질소 생산 - 박테리아 배양물을 펩톤, 5g; 육즙, 3g; 포타슘 니트레이트, 1g; 증류수, 1000㎖을 포함하는 질산염 브로쓰(pH 7.0)에서 배양하였다. 배지를 도립 Durham 튜브를 포함하는 테스트 튜브에 붓고 20분동안 121℃에서 오토클래이브시켜 멸균화시켰다. 37℃에서 인큐베이션시키는 7일중 3일후 질소가 축적된 것 이 관찰되었다.

프로피오네이트 이용 - 박테리아 배양물을 경사진 프로피오네이트 이용 배지(소듐 프로피오네이트, 2g; 마그네슘 설페이트 7H ₂ 0, 1.2g; 디암모늄 하이드로겐 포스페이트, 0.5g; 포타슘 클로라이드, 1g; 미량원소 용액(하기 참조), 40㎖; 한천, 15g; 증류수, 920㎖; 0.04%(w/v)의 페놀 레드 용액, 20㎖, pH 6.8)상에 접종하고 37℃에서 14일동안 인큐베이션시켰다. 적색의 발색은 프로피오네이트 이용에 대한 표시였다.

용혈소의 생산 - 박테리아 배양물을 양의 혈액 한천(하기 참조)상에 접종하고 24-72시간동안 37℃에서 배양하였다. 용혈능에 기인한, 박테리아 콜로니를 둘러싸는 생육저지환(clear Zone)에 의해 용혈소 생산을 검출하였다. 용혈능이 없을 때 생육저지환도 존재하지 않음을 주시한다.

제조사의 지시에 따라 제조된 혈액 한천 베이스(Blood Agar Base(Difco))에 양의 혈액 한천-5% 멸균 탈섬유화된 양의 혈액을 무균적으로 가하고 45-50℃로 냉각시켰다. 용액을 잘 혼합하고 멸균 페트리 디쉬내로 분배하였다.

아르기닌 디하이드롤라아제 생성 - Sherris 배지를 포함하는 튜브 및 대조군 튜브(즉, 아르기닌을 포함하지 않음)를 밤새도록 멸균 바솔린 오일이 첨가된 박테리아 배양물에 접종하였다. 튜브를 37℃에서 5일동안 인큐베이션시켰다. 아르기닌 디하이드롤라아제 생성은 아르기닌을 포함하는 배지내 보라색의 출현에 의해 검출하였다.

Sherris 배지 - 펩톤, 1g; 육즙, 5g; 피리독신, 0.005g; 글루코오스, 0.5g; L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 10g; 브롬크레솔 퍼퍼, 0.01g; 크레솔 로트, 0.005g; 증류수, 1000㎖.

폴리-β-하이드록시부틸레이트 합성 - 박테리아 배양물을 1% 글루코오스로 보충된 영양 한천상에 접종하였다. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시킨 후, 배양물을 포함하는 슬라이드를 준비하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 현미경 조사를 실시하였다. 구형의 폴리-β-하이드록시부틸레이트는 염색되지 않은 입자로서 관찰됨에 주의하라.

결과

박테리아 분류를 통해 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ) 및 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )는 막대형 그람-양성 박테리아(도면 1a-b)로서, 내생포자를 형성할 수 있고 카탈라아제를 생산할 수 있는 것을 확인하였다. 균주는 폴리-β-하이드록시부틸레이트를 형성하지도 못하고 난황 레시티나아제도 용혈소도 생산하지 못했다.

균주는 상이한 생화학적 특징을 나타내었다. 하기 표 1에 요약한 바와 같이, 균주 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )에 대립하는 것으로서 균주 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )는 혐기성 조건하에서 성장할 수 있고 아르기닌 디하이드롤라아제를 생산할 수 있고 질산염으로부터 가스를 형성할 수 있고 프로피오네이트를 이용할 수 있다.

함께, 이들 특징을 통해 균주 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE )는 B. 서브틸리스( B. S ubtilis )이고 균주 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )는 B. 리케니포르미스( B. licheniformis )임을 확인하였다. 균주 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ) 및 균주 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )의 16S rDNAs를 각각 서열번호: 1 및 2로 기술한다.

표 1

실시예 3

프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 급성 및 만성 독성 효과

실험 방법

급성 독성 - 마우스를 7일동안 실험 조건에 적응시킨 후, 마우스를 각각 10마리씩 21개의 상이한 그룹으로 무작위적으로 지정하였다. 박테리아 배양물을 5x10 ⁷ , 5x10 ⁸ , 5x10 ⁹ CFU/마우스의 상이한 수준으로 정맥 및 복강내 투여하고 5x10 ⁷ , 5x10 ⁸ , 2x10 ¹¹ CFU/마우스로 경구 투여하였다. 대조군 그룹의 마우스에는 멸균 염수를 투여하였다. 7일동안 동물을 관찰하였다. 이 기간동안, 각 마우스의 활동, 행동 및 털의 광택을 날마다 기록하였다. 1 내지 7일 후, 과량의 에테르로 각 그룹으로부터 5마리의 동물을 안락사시키고 내부 장기를 육안으로 관찰하였다. 조직학적 분석을 위해 간, 신장, 폐, 지라, 장, 장간막림프절, 뇌, 가슴샘 및 인후 주위의 조직(경구 처리된 그룹의 경우)을 포함하는 상이한 장기 및 조직 샘플을 채취하였다:

만성 독성 연구 - 마우스 및 래빗을 사용하여 만성 독성 연구를 수행하였다. 각 종(각 박테리아 균주에 대한)의 10마리의 동물에 마우스, 1x10 ⁶ CFU/일; 래빗 1x10 ⁹ CFU/일의 용량으로 박테리아 배양물을 경구적으로 접종하였다. 대조군의 각 종의 10마리의 동물에 멸균 염수를 투여하였다. 10일동안 처리를 지속하고, 그 기간동안 각 동물의 활동 및 행동을 관찰하였다. 11일째, 모든 동물을 인도적으로 안락사키고 내부 장기를 육안으로 관찰하였다. 조직학적 분석을 위해 간, 신장, 폐, 지라, 장, 장간막림프절, 뇌, 가슴샘 및 인후 주위의 조직을 포함하는 상이한 장기 및 조직 샘플을 채취하였다.

추가 실험에서, 20마리의 래빗(각 박테리아 균주당 10마리씩)에 30일동안 1x10 ⁹ CFU/일의 용량으로 박테리아 배양물을 경구적으로 접종하였다. 대조군 래빗 10마리에 멸균 염수를 투여하였다. 31일째 모든 동물을 인도적으로 안락사키고 혈액 및 상이한 장기 및 조직 샘플을 채취하였다.

결과

전체 실험 기간동안, 어떤 동물에서도 활동 및 행동에 있어 뚜렷한 변화는 없었다. 모든 동물은 임상적으로 건강하였고, 즉, 설사나 치료와 관련된 다른 병 또는 사망도 기록되지 않았다.

육안 관찰에 따르면 실험 및 대조군 동물 사이의 내장 장기의 외형상의 차이도 없었다. 추가로, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 대조군 및 경구 접종된 마우스의 지라 중량 지수(SWI)에서의 현저한 차이도 없었다.

표 2

SWI = 지라 중량(mg)/마우스의 체중(g)

마우스에서의 급성 독성, 및 마우스 및 래빗에서의 만성 독성, 상기 둘 모두에 대하여 연구하는 동안 현미경 관찰을 통해 모든 분석된 장기 및 조직에서는 병리학적 징후는 발견되지 않았다.

각각 급성 및 만성 독성 연구하는 동안 마우스, 및 마우스와 래빗의 장기 및 조직 어디에서도 병상을 관찰되지 않았다.

또한, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 30일동안 본 발명의 박테리아 균주를 경구 투여받은 처리된 래빗 및 대조군의 혈액에서 측정된 혈액학적 지수에서 차이가 없었다.

표 3

실시예 4

프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 항생제 내성

National Committee for Clinical Laboratory Standards (1997)의 권고에 따른 디스크 디퓨전(disc diffusion) 방법에 의해 균주에 대한 안티바이오그램(Antibiogram)을 얻었다. LB(박토트립토, 10g; 박토 효모 추출물, 5g; 소듐 클로라이드, 5g; 물, 1000㎖ 포함; pH 7.0±0.2; Difco Laboratories, Detroit, MI)중 37℃에서 배양한 후 밤새도록 시험 균주의 브로쓰 배양물을 면봉으로 Mueller-Hinton 플레이트에 시딩하였다(seeded). 항생제-주입된 디스크(지름 6mm, BBL Sensi-Disc Susceptibility Test Discs; BD BBL Sensi-Disc Antimicrobial Discs)를 시딩된 플레이트상에 놓고 37℃에서 18시간동안 인큐베이션시킨 후 성장 저해 구역을 측정하였다.

하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 시험된 균주는 티카실린, 카베니실린, 이미페넴, 아미노그라이코사이드 등과 같이 현재 이용되고 있는 대부분의 항생제에 대하여 민감한 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 바이오스포린-유도 균주(즉, 바실러스 서브틸리스 HE( Bacillus subtilis HE ) 및 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA ))는 다수의 항생제에 대하여 상이한 민감성을 나타내었다. 따라서, 예를 들면, 바실러스 리케니포르미스 PA( Bacillus licheniformis PA )는 메티실린 및 옥사실린에 대하여 내성을 갖는 반면, B. 서브틸리스 HE( B. Subtilis HE )는 이들 항생제에 대하여 민감하였다. 앰피실린, 벤질페니실린, 세프트아지딤, 클린다마이신, 및 폴리믹신 E에 대해서 동일한 차이가 명확히 나타났다. 양 균주는 아즈트레오남 및 세푸록심에 대하여 내성을 나타내었다.

표 4

실시예 5

프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 길항 작용

재료 및 실험 방법

박테리아 시료 - Lot I - 프로바이오틱 균주 B. 서브틸리스 HE( B. Subtilis HE ) 및 B. 리케니포르미스 PA( B. licheniformis PA )를 37℃에서 24-48시간동안 영양 한천에서 따로따로 배양하였다. 염수에서 모든 배양물을 수거하고 10 ⁹ CFU/㎖의 밀도로 희석시켰다. B. 서브틸리스 HE( B. Subtilis HE ) 및 B. 리케니포르미스 PA( B. licheniformis PA )를 각각 3:1의 비로 혼하였다. 1% 젤라틴 및 4% 사카로오스를 포함하는 안정화제를 가하고 혼합물을 앰플에 붓고 동결건조시켰다.

Lot Ⅱ - 프로바이오틱 균주 B. 서브틸리스 HE( B. Subtilis HE ) 및 B. 리케니포르미스 PA( B. licheniformis PA )를 상기 기술된 바와 같이 배양하고 수거하되, 10 ¹⁰ CFU/㎖의 밀도로 희석시켰다.

Lot Ⅲ - 프로바이오틱 균주 B. 서브틸리스 HE( B. Subtilis HE) 및 B. 리케니포르미스 PA( B. licheniformis PA )를 상기 기술된 바와 같이 배양하고 수거하되, 10 ¹¹ CFU/㎖의 밀도로 희석시켰다.

항균 작용 분석 - 본 발명의 박테리아 균주의 항균 작용을 Sorokulova 등에 의해 [(1997) J. Travel Med.4, 167-170 and Pinchuk (2001) Antimicrob Agents Chemother; 45 (11): 3156-61]에 기술된 바와 같이 분석하였다. 간략하게, 각 프로바이오틱 균주를 Mueller Hinton 한천 플레이트(Difco Laboratories, Detroit, MI) 표면상에 스폿(대략 5-10mm)으로 접종하였다. 30℃에서 72시간후, 상기 기술된 바와 같이 클로로포름 증기에 노출시켜 박테리아를 사멸시켰다. 대략 10 ⁷ CFU/ ㎖를 포함하도록 시험-배양물의 접종물을 제조하였다. 바실러스( Bacillus ) 스폿 경계부터 플레이트의 가장자리까지 이들 현탁액을 줄무니로 플레이팅시켰다. 플레이트를 37℃에서 24시간동안 호기 조건하에 인큐베이션시켰다. 프로바이오틱의 길항 작용은 시험-배양물의 저해 구역의 존재로서 나타내었다.

결과

하기 표 5에 바이오스포린과 비교하여 본 발명의 프로바이오틱 균주의 항병원성 작용을 열거하였다. 명백하게, 본 발명의 프로바이오틱 균주는 바이오스포린(10 ⁹ CFU/㎖)과 비교하여 병적 및 잠재성의 병적 미생물에 대하여 더욱 고도한 길항 작용을 매개하였다.

표 5

실시예 6

장병원성 E. coli 0157: H7에 대한 프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 길항 작용

재료 및 실험 방법

상기 실시예 5에 기술된 바와 같다.

결과

하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 바이오스포린과 비교하여 본 발명의 프로바이오틱 균주가 장병원성 E. coli 0157: H7에 대하여 더욱 고도한 항병원성 작용을 나타내는 것으로 검출되었다. 바이오스포린과 비교한 바, 균주 10 ^* 의 E. coli 0157: H7에 대하여 본 발명의 박테리아 균주의 활성은 1.6배 높게 나타났음에 주목한다.

표 6

실시예 7

장병원성 E. coli 0157: H7에 대한 프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 생체내 길항 작용

재료 및 실험 방법

lot I-Ⅲ의 길항 작용은 실험상 E. coli 0157 : H7 감염을 앓는 마우스에서 연구하였다. E. coli 0157 : H7(균주 212)-1x10 ⁹ CFU/마리를 사용하여 마우스를 복강내로 처리하였다. E. coli O157 : H7 주입 후 1일째, 4일동안(1일 1회) 프로바이오틱으로 마우스를 경구적으로 처리하였다. 대조군 마우스에는 염수를 투여하였다.

결과

표 7

실시예 8

바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 백신 균주에 대한 프로바이오틱 균주 바실러스 서브틸리스 HE(Bacillus subtilis HE) 및 바실러스 리케니포르미스 PA(Bacillus licheniformis PA)의 길항 작용

배경 및 결과

탄저병은 박테리움 바실러스 안트라시스( Bacillus anthracis )를 섭취하는 동물사이에서 자연발생적으로 출현되는 질환이다. 이 질환은 동물에서 출현하는 농촌에 매우 보편적이다. 남미 및 중미, 남부 및 동부 유럽, 아시아, 아프리카, 및 캐리비안, 및 중동을 포함한다. 탄저병이 인간에게 영향을 줄 때는 보통 감염된 동물 또는 그의 산물에 직업상 노출되지 때문이다. 탄저병이 보다 보편화된 다른 나라로부터의 동물의 산물 및 죽은 동물에 노출된 노동자는 B. 안트라시스(B. anthracis )에 감염될 수 있다(직업 탄저병). 야생 가축에서의 탄저병은 미국에서 발생한다.

탄저병 감염은 3가지 형태로 발생할 수 있다: 피부(cutaneous)(피부(skin)), 흡입, 장. B. 안트라시스(B. anthracis ) 포자는 수년동안 토양에서 살 수 있고, 인간은 감염된 동물로부터의 산물을 취급하거나 오염된 동물 산물로부터의 탄저병 포자를 흡입함으로써 감염될 수 있다. 탄저병은 또한 감염됨 동물로부터의 설익은 고기를 섭취함으로써 퍼져 나갈 수 있다. 미국에서 감염된 동물을 발견하는 일은 드물다.

질환의 증상은 질환에 어떻게 걸리게 되었는지에 따라 달라지지만, 증상은 통상 7일내 출현된다.

피부(Cutaneous) - 대부분(약 95%)의 탄저병 감염은 박테리아가 피부상의 벤 상처 또는 찰과상으로 들어갈 때, 예로서, 오염된 털, 가죽, 감염된 동물의 가죽 또는 모제품(특히 염소 털)을 취급할 때 발생한다. 피부 감염은 벌레 물림과 유사한 도드라진 가려운 돌기로서 시작되지만, 1-2일내 수포로 발전한 후 무통 궤양으로 발전하고, 통상 1-3cm의 지름을 갖고 중심에 특징적인 흑색의 괴사성(사멸성) 영역을 갖는다. 인접 영역내 임파선이 부을 수 있다. 치료받지 않은 피부 탄저병 병상중 약 20%는 사망할 것이다. 적절한 미생물 요법을 받는 경우에는 거의 사망하지 않을 것이다.

흡입 - 초기 증상은 일반 감기와 유사할 수 있다. 몇일 후, 증상은 심각한 호흡 곤란 및 쇼크로 발전할 수 있다. 흡입 탄저병은 일반적으로 치명적이다.

장 - 장질환 형태의 탄저병은 오염된 고기를 소비한 후 발생할 수 있고, 위장관의 급성 염증을 특징으로 한다. 구역, 식욕 감퇴, 구토, 열과 같은 초기 징후는 복통, 혈액구토, 및 중증 설사로 이어진다. 장 탄저병에서는 20% 내지 60%의 병상이 사망에 이르게 된다.

탄저병 백신을 둘러싼 논쟁은 매우 광대하다. 그의 위험성이 상기 잇점을 능가할 뿐만 아니라, FDA는 중요한 제조상의 위반에 기인하여 이를 고안한 BioPort(Lansing, Michigan)에게 정지시켰다. 미국은 최근 접종과 관련된 병 및 사망에 기인하여 그들의 백신화에 대한 노력을 중단하였다. 따라서, 백신은 언제라도 곧 일반 대중에게 실용적인 옵션은 아니다.

바실러스 안트라시스( Bacillus anthracis ) 백신 균주에 대한 본 발명의 프로바이오틱 배양물의 길항 작용은 실시예 4에 기술한 바와 같이 실험하였다.

결과를 하기 표 8에 요약한다.

표 8

이 결과는 프로바이오틱이 탄저병을 치료하기 위하여 사용될 수 있고, 그 자체로서 현재 이용가능한 백신의 가치있는 대체물이 될 수 있다는 것을 최초로 나타내는 것이다.

명확하게 하기 위해 별도의 구체예의 문맥에 기술된 본 발명의 특성은 또한 하나의 구체예에 함께 제공될 수 있음이 인지될 것이다. 반대로, 요약하여 하나의 구체예의 문맥에 기술된 본 발명의 다양한 특성은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 서브컴비네이션에 제공될 수 있다.

본 발명은 그의 특정 구체예와 함께 기술되었지만 다양한 대안, 수정 및 변형도 본 분야의 기술자에게 자명할 것이라는 것은 명백하다. 따라서, 첨부되는 청구범위의 정신 및 광범위한 범위내에 포함되는 모든 대안, 수정 및 변형도 포함시키고자 한다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 이들 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용되는 것까지도 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 포함된다. 추가로, 본 명세서에서 참고 문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 허가하는 것으로 이해되어서는 안된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Bio Balance Corporation <120> BACTERIAL STRAINS, COMPOSITIONS INCLUDING SAME AND PROBIOTIC USE THEREOF <130> <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 390 <212> DNA <213> Bacillus subtilis (strain HE) <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (366)..(366) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa cataaaaggt ggtttcngct accacttaca 60 gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg 120 tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 180 ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg 240 agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga 300 atagggcggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 360 cgcggnaata cgtaggtggc aagcgttgtc 390 <210> 2 <211> 450 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis (strain PA) <220> <221> misc_feature <222> (369)..(369) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 caccgcggca tgctgatc cg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag 60 actgcgatcc gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt agcctcgcgg cttcgctgcc 120 ctttgttctg cccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga 180 cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat 240 gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca 300 cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggaa gccctatctc 360 tagggttgnc agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc 420 acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 450