[0001] 本发明涉及一种聚γ-谷氨酸的生产方法以及其中所用的微生物。

[0002] 聚γ-谷氨酸(以下在本说明书中也称为“PGA”)是谷氨酸的γ位的羧基与α位的氨基通过肽键结合而成的高分子化合物。另外，PGA也有被称为γ-聚谷氨酸的情况。PGA作为纳豆菌(Bacillus subtilis var. natto)产生的粘性物质而为人所知，由于各种性质近年来作为新型高分子原材料而受到注目。

[0003] 作为产生PGA的微生物，可以列举包括纳豆菌的一部分的与芽孢杆菌(Bacillus)属细菌其近缘种，进一步可以列举嗜盐古细菌埃及纳白菌(Natrialba aegyptiaca)等(参照非专利文献1)。另外，这些PGA生产菌已知是对于PGA的生产性具有不同的谷氨酸依赖性的微生物(参照非专利文献2)。即，存在PGA生产中需要谷氨酸的微生物和不需要谷氨酸的微生物。

[0004] 根据现有的知识，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TAM-4株记载了分别以葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖、甘油作为唯一的碳源不依赖谷氨酸地生产PGA(参照非专利文献2)。然而，在所述碳源中使用甘油的条件中，枯草芽孢杆菌TAM-4株的PGA的生产能力为0.6g/L/4天。因此，可以认为从工业性的观点出发，枯草芽孢杆菌TAM-4株的PGA生产能力没有达到充分的生产量。

[0005] 另外，根据非专利文献3，不依赖谷氨酸地生产PGA的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A35株分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、木糖作为唯一的碳源生产PGA。然而，记载了在以甘油作为唯一的碳源的条件中，地衣芽孢杆菌A35株不生产PGA。

[0006] 另外，在非专利文献2中记载了地衣芽孢杆菌ATCC9945a株依赖谷氨酸地生产PGA。另一方面，在非专利文献4中记载了地衣芽孢杆 菌ATCC9945a株不依赖谷氨酸地生产PGA。
然而，在非专利文献4中没有确定地衣芽孢杆菌ATCC9945a株以甘油作为唯一的碳源来生产PGA。还进一步，在非专利文献5中记载了地衣芽孢杆菌ATCC9945a株以甘油作为唯一的碳源不产生PGA。

[0007] 另一方面，在非专利文献6中记载了作为地衣芽孢杆菌ATCC9945a株的突变株的地衣芽孢杆菌WBL-3株在以甘油作为唯一的碳源的条件下具有8.9g/L/4天的PGA生产能力。

[0008] 由此，根据现有知识，关于以甘油作为唯一的碳源不依赖谷氨酸且有效地生产PGA的微生物的信息不明确。进一步，几乎不知道以甘油作为唯一的碳源不依赖谷氨酸且有效地生产PGA的野生株。

[0009] 谷氨酸可以通过将生物质作为原料的发酵法进行生产，利用为食品原材料或饲料。从避免与粮食的竞争的观点、或者工业上看生产成本的观点出发，认为不将这样的谷氨酸用于原料而可以有效地生产作为有用的高分子原材料的PGA的微生物也有益。

[0010] 还进一步，近年来，甘油作为生物燃料等制造时产生的副产物，希望有效利用甘油。因此，如果发现将这些甘油作为唯一的碳源不依赖谷氨酸地有效地生产PGA的微生物，则可以认为工业上看其利用价值高。

[0011] 现有技术文献

[0012] 非专利文献

[0013] 非专利文献1：Ashiuchi M.,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2002,vol.59,p.9-14

[0014] 非专利文献2：Ito Y.,et al.,Biosci.Biotec.Biochem.,1996,vol.60,p.1239-1242

[0015] 非专利文献3：Cheng C.,et al.,Agric.Biol.Chem.,1989,vol.53,p.2369-2375[0016] 非专利文献4：Birrer G.A.,et al.,Int.J.Biol.Macromol.,1994,vol.16,p.265-275

[0017] 非专利文献5：Birrer G.A.,et al.,Polym.Mater.Sci.Eng.,1992,vol.67,p.134-136

[0018] 非专利文献6：Guocheng Du,et al.,Process Biochemistry,2005,vol.40,p.2143-2147

[0019] 本发明涉及一种以保藏号NITE BP-01552、NITE BP-01551、NITE BP-01553、NITE BP-01554或NITE BP-01555特定的微生物。

[0020] 另外，本发明涉及一种培养所述微生物来生产PGA的PGA的生产方法。

[0021] 本发明以提供一种PGA生产能力优异的野生型的微生物为课题。

[0022] 另外，本发明以提供即使在不存在谷氨酸下也能够以甘油作为唯一的碳源大量生产PGA的野生型的微生物为课题。

[0023] 另外，本发明以提供一种能够大量生产PGA的PGA的生产方法为课题。

[0024] 本发明者们鉴于上述课题进行专门研究，结果发现了即使在谷氨酸不存在下也能够以甘油作为唯一的碳源大量生产PGA的野生型的微生物。

[0025] 本发明是基于该见解而完成的。

[0026] 本发明的微生物与具有PGA生产能力的现有的野生型的微生物相比较，PGA生产能力更优异。

[0027] 另外，本发明的微生物即使在谷氨酸不存在下也可以以甘油作为唯一的碳源来大量生产PGA。

[0028] 进一步，使用所述微生物的本发明的PGA的生产方法能够大量生产PGA。

[0029] 本发明的上述以及其它的特征和优点根据下述的记载可以明确。

[0030] 本说明书中的“野生型的微生物”是指从自然界分离或单离得到的微生物，并且没有施以人工诱变处理或人工基因重组操作的状态的微生物。

[0031] 本发明的微生物与具有PGA生产能力的现有的野生型的微生物相比较，是PGA生产能力优异的野生型的微生物。另外，本发明的微生物是即使在谷氨酸不存在下也能够以甘油作为唯一的碳源大量生产PGA的野生型的微生物。

[0032] 进一步，施用所述微生物的本发明的PGA的生产方法能够大量生产PGA。

[0033] 以下对本发明进行详细地说明。

[0034] 本发明的微生物中，地衣芽孢杆菌KSM-PG121株在2014年7月15日以保藏号NITE BP-01552保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。

[0035] 地衣芽孢杆菌KSM-PG115株在2014年7月15日以保藏号NITE BP-01551保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。

[0036] 地衣芽孢杆菌KSM-FFA033株在2014年7月15日以保藏号NITE BP-01553保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。

[0037] 地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株在2014年7月11日以保藏号NITE BP-01554保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。

[0038] 地衣芽孢杆菌KSM-FFA039株在2014年7月15日以保藏号NITE BP-01555保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。

[0039] 本发明的这些微生物都是野生型的微生物。进一步，本发明的这些微生物都在分类学上被分类为地衣芽孢杆菌。

[0040] 接着，对本发明的微生物所具有的16S rDNA进行说明。

[0041] 地衣芽孢杆菌KSM-PG121株具有由序列号7所示的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-PG121株具有由与序列号7所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-PG121株具有由序列号7所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA。

[0042] 地衣芽孢杆菌KSM-PG115株具有由序列号8所示的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-PG115株具有由与序列号8所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-PG115株具有由序列号8所 示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA。

[0043] 地衣芽孢杆菌KSM-FFA033株具有由序列号9所示的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-FFA033株具有由与序列号9所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-FFA033株具有由序列号9所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA。

[0044] 地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株具有由序列号10所示的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株具有由与序列号10所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株具有由序列号10所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA。

[0045] 地衣芽孢杆菌KSM-FFA039株具有由序列号11所示的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-FFA039株具有由与序列号11所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列构成的16S rDNA。或者地衣芽孢杆菌KSM-FFA039株具有由序列号11所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA。

[0046] 在此，在本发明中，碱基序列的同源性可以使用公开的数据库NCIMB(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，http://www.ncbi.nlm.gov/)的选单“Nucleotide”内的“BLAST”中的“Basic BLAST”算出。或者，也可以通过使用Genetyx-Win(基因信息处理软件，GENETYX CORPORATION制造)的同源性分析程序，将单元尺寸(k-tuple)作为6进行分析来算出碱基序列的同源性。

[0047] 另外，在序列号7所示的碱基序列与序列号8所示的碱基序列之间，通过Genetyx-Win(基因信息处理软件，GENETYX CORPORATION制造)的同源性分析程序算出碱基序列的同源性。其结果，在序列号7所示的碱基序列与序列号8所示的碱基序列之间，同源性为100％。该 结果显示由序列号7所示的碱基序列构成的16S rDNA与由序列号8所示的碱基序列构成的16S rDNA实质上是相同的16S rDNA。

[0048] 接着，对本发明的微生物的细菌学性质进行说明。

[0049] 本发明的微生物分别具有下述表1所示的细菌学性质。

[0050] [表1]

[0051]

[0052] 表中所记载的“+”表示阳性，“-”表示阴性，

[0053] 另外，“+※”表示培养第2天的判定结果。

[0054] 如表1所示，本发明的微生物具有半乳糖醇不利用性的性质作为共通的性质。因此，本发明的微生物优选不具有半乳糖醇利用性作为细菌学性质。

[0055] 进一步，如表1所示，地衣芽孢杆菌KSM-PG121株和地衣芽孢杆 菌KSM-PG115株，关于表1所记载的细菌学性质具有实质上相同的性质。

[0056] 本发明的微生物在谷氨酸不存在下以含有甘油作为唯一的碳源的培养基进行培养来生产PGA。具体来说，根据培养条件，是在使用下述所示的组成的7.5％甘油-M培养基或10％甘油-M培养基培养所述微生物时，每1L培养基具有1.2g/4天以上、优选为3.0g/4天以上、进一步优选为4.0g/4天以上、更加优选为6.0g/4天以上的PGA的生产能力的野生型的微生物。

[0057] 以下在下述表2和3中显示7.5％甘油-M培养基以及10％甘油-M培养基。

[0058] [表2]

[0059]

[0060] [表3]

[0061]

[0062] 本发明的微生物还取决于培养条件，在培养基中的甘油以高浓度存在的条件下，即标准的模式菌株(例如，地衣芽孢杆菌ATCC9945a株等)时在如发现有抑制繁殖的环境下也难以抑制繁殖。即，本发明的微生物优选在甘油高浓度的条件下比模式菌株繁殖度高。

[0063] 具体来说，优选在使用甘油含量为15％(w/v)的培养基进行培养 的情况下，将模式菌株(例如，地衣芽孢杆菌ATCC9945a株)的繁殖度设定为100％时，本发明的微生物的繁殖度为115％以上，优选为120％以上，进一步优选为150％以上。或者，优选在使用甘油含量为20％(w/v)的培养基进行培养的情况下，将模式菌株(例如，地衣芽孢杆菌ATCC9945a株)的繁殖度设定为100％时，本发明的微生物的繁殖度为120％以上，优选为200％以上，进一步优选为280％以上。

[0064] 另外，在使用甘油含量为15％(w/v)的培养基进行培养时的本发明的微生物的繁殖度优选为使用甘油含量为10％(w/v)的培养基进行培养时的繁殖度的85％以上，优选为95％以上，进一步优选为100％以上，更加优选为120％以上。或者，在使用甘油含量为20％(w/v)的培养基进行培养时的本发明的微生物的繁殖度优选为使用甘油含量为10％(w/v)的培养基进行培养时的繁殖度的30％以上，优选为40％以上，进一步优选为50％以上，更加优选为55％以上，特别优选为70％以上。

[0065] 另外，本说明书中的“繁殖度”可以通过测定培养后的培养液的吸光度(OD600)来相对地算出。

[0066] 本发明的微生物通过通常的方法来单离、取得。

[0067] 具体来说，使用含有甘油作为唯一的碳源的培养基，在谷氨酸不存在下进行培养，与其它微生物相比较选择PGA的生产量高的野生型的微生物，并单离、取得。

[0068] 如上所述，非专利文献6所记载的地衣芽孢杆菌WBL-3株具有8.9g/L/4天这样的高的PGA生产性。然而，地衣芽孢杆菌WBL-3株不是野生型的微生物而是突变型的微生物，本发明的野生型的微生物与地衣芽孢杆菌WBL-3株不同。

[0069] 如果具体地进行说明，则地衣芽孢杆菌WBL-3株是地衣芽孢杆菌ATCC9945a株的突变株，对于地衣芽孢杆菌ATCC9945a株进行He-Ne激光照射。

[0070] 本发明的PGA的生产方法使用上述的本发明的微生物进行PGA的生产。

[0071] 如上所述，本发明的微生物与现有的野生型的微生物相比较PGA生产能力优异。因此，根据本发明的PGA的生产方法，可以大量生产 PGA。

[0072] 另外，本发明的微生物即使在谷氨酸不存在下，也可以以甘油作为唯一的碳源大量生产PGA。如上所述，谷氨酸广泛地被用作食品的原料。因此，根据本发明的PGA的生产方法，可以不与粮食生产相竞争地以低成本大量生产PGA。

[0073] 在使用本发明的微生物生产PGA时，在适当的培养基中培养本发明的微生物，从培养基中回收菌体外生产的PGA。

[0074] 作为培养基，可以使用含有甘油、葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、淀粉等的糖类作为用于生产PGA的碳源的培养基。另外，可以使用含有柠檬酸、醋酸等的各种有机酸或其盐、以及谷氨酸或其盐等作为用于生产PGA的碳源的培养基。在本发明的PGA的生产方法中，作为用于生产PGA的碳源，可以使用上述碳源中的1种，也可以将2种以上组合使用。在本发明的PGA的生产方法中，可以优选使用含有甘油作为碳源的培养基、不含谷氨酸而以甘油作为唯一的碳源的培养基、以甘油作为主要的碳源并且以选自有机酸、谷氨酸以及它们的盐中的至少1种作为辅助碳源的培养基等。在此，“主要的碳源”以及“辅助碳源”是表示培养基中的各碳源的含量的大小。

[0075] 在本发明的PGA的生产方法中使用的培养基中，也可以根据需要含有各种大豆蛋白质等的天然物质，氨基酸、多聚蛋白胨、胰蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵或尿素等的氮源等。进一步，在本发明的PGA的生产方法中使用的培养基中，也可以含有钠盐、镁盐、钙盐、钾盐等的无机盐类及其它需要的营养源、微量金属盐等。另外，本发明的PGA的生产方法中使用的培养基可以是合成培养基，也可以是天然培养基。

[0076] 本发明的微生物即使在谷氨酸不存在下也能够以甘油作为碳源大量生产PGA。因此，从生产成本的观点出发，优选用不含谷氨酸而含有甘油作为碳源的培养基、或者含有甘油作为唯一的碳源的培养基培养本发明的微生物来生产PGA。

[0077] 用于PGA的生产的甘油可以是市售品，也可以是生物燃料等的制造时作为副产物产生的甘油。通过使用作为副产物产生的甘油，可以得到由剩余物质处理而产生的能源降低、降低由废弃造成的环境污染 等的辅助效果，还与环境负荷的降低有关联。进一步，由于作为副产物产生的甘油可以廉价地购入，因此，从生产成本的观点出发，也优选。

[0078] 在本发明的PGA的生产方法中，在使用甘油作为用于生产PGA的碳源的情况下，培养基中的甘油含量根据使用的微生物种类可以适当选择。具体来说，优选为1％(w/v)以上，进一步优选为5％(w/v)以上，进一步更优选为10％(w/v)以上，优选为30％(w/v)以下，进一步优选为20％(w/v)以下。

[0079] 所述微生物的培养条件可以根据使用的微生物等而适当选择。具体来说，最适温度优选为20℃以上(优选为25℃以上，进一步优选为30℃以上)且50℃以下(优选为45℃以下，进一步优选为40℃以下)。最适pH优选为5以上(优选为5.5以上，进一步优选为6.5以上)且8以下(优选为7.5以下，进一步优选为7以下)。另外，培养天数为种菌接种后1天以上(优选为3天以上，进一步优选为4天以上)。对于培养方法没有特别地限制，可以列举振荡培养、搅拌培养、通气培养、静置培养等。

[0080] 在回收培养基中积蓄的PGA时，需要除去生产了PGA的微生物菌体。作为除去菌体的方法，可以列举利用离心分离的方法、使用微滤或超滤膜的方法、电透析法、通过将pH维持在PGA的等电点附近来作为沉淀回收的方法等。在本发明中也可以将上述方法适当组合使用。

[0081] 另外，对于从培养基中回收PGA的方法也没有特别地限制，可以利用将生产的物质单离、回收时通常所用的方法来进行。例如，可以通过凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、氯仿/甲醇提取法、己烷提取法、乙醇提取法等将目标的PGA单离、回收。

[0082] 通过本发明生产的PGA可以用于化妆品、医药品、食品、水质净化剂、保水材料、增粘剂等各种用途。特别是由于本发明的微生物的PGA的生产性与其它微生物相比较更优异，因此，可以大幅度地降低PGA的生产成本。

[0083] 关于上述的实施方式，本发明进一步公开以下的微生物、以及PGA的生产方法。

[0084] <1>一种微生物，其中，以保藏号NITE BP-01552、NITE BP-01551、NITE BP-01553、NITE BP-01554或NITE BP-01555特定。

[0085] <2>如上述<1>所述的微生物，其中，以保藏号NITE BP-01552特定的微生物具有由序列号7所示的碱基序列、或者与序列号7所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列、或者序列号7所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA，[0086] 以保藏号NITE BP-01551特定的微生物具有由序列号8所示的碱基序列、或者与序列号8所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列、或者序列号8所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA，

[0087] 以保藏号NITE BP-01553特定的微生物具有由序列号9所示的碱基序列、或者与序列号9所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列、或者序列号9所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA，

[0088] 以保藏号NITE BP-01554特定的微生物具有由序列号10所示的碱基序列、或者与序列号10所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列、或者序列号10所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA，

[0089] 以保藏号NITE BP-01555特定的微生物具有由序列号11所示的碱基序列、或者与序列号11所示的碱基序列有99.5％以上、优选为99.8％以上的同源性的碱基序列、或者序列号11所示的碱基序列中的1～14个、优选为1～7个、进一步优选为1～3个的碱基缺失、置换、插入或添加后的碱基序列构成的16S rDNA。

[0090] <3>如上述<1>或<2>所述的微生物，其中，以保藏号NITE BP-01552特定的微生物具有由序列号7所示的碱基序列构成的16S rDNA，以保藏号NITE BP-01551特定的微生物具有由序列号8所示的碱基序列构成的16S rDNA，以保藏号NITE BP-01553特定的微生物具 有由序列号9所示的碱基序列构成的16S rDNA，以保藏号NITE BP-01554特定的微生物具有由序列号10所示的碱基序列构成的16S rDNA，以保藏号NITE BP-01555特定的微生物具有由序列号11所示的碱基序列构成的16S rDNA。

[0091] <4>如上述<1>～<3>中任一项所述的微生物，其中，由序列号7所示的碱基序列构成的16S rDNA与由序列号8所示的碱基序列构成的16S rDNA实质上是相同的16S rDNA。

[0092] <5>如上述<1>～<4>中任一项所述的微生物，其中，所述微生物为地衣芽孢杆菌。

[0093] <6>如上述<1>～<5>中任一项所述的微生物，其中，所述微生物为野生型的微生物。

[0094] <7>如上述<1>～<6>中任一项所述的微生物，其中，所述微生物分别具有所述表1所记载的细菌学性质。

[0095] <8>如上述<1>～<7>中任一项所述的微生物，其中，所述微生物分别具有半乳糖醇不利用性的性质。

[0096] <9>如上述<1>～<8>中任一项所述的微生物，其中，关于所述表1所记载的细菌学性质，以保藏号NITE BP-01552特定的微生物与以保藏号NITE BP-01551特定的微生物相互具有实质上相同的性质。

[0097] <10>如上述<1>～<9>中任一项所述的微生物，其中，所述微生物在谷氨酸不存在下用含有甘油作为唯一的碳源的培养基进行培养来生产PGA。

[0098] <11>如上述<1>～<10>中任一项所述的微生物，其中，在使用所述7.5％甘油-M培养基或10％甘油-M培养基培养所述微生物时，每1L培养基的所述微生物的PGA的生产能力为1.2g/4天以上、优选为3.0g/4天以上、进一步优选为4.0g/4天以上、更加优选为6.0g/4天以上。

[0099] <12>如上述<1>～<11>中任一项所述的微生物，其中，在使用甘油含量为15％(w/v)的培养基进行培养的情况下，将地衣芽孢杆菌ATCC9945a株的繁殖度设定为100％时的所述微生物的繁殖度为115％以上，优选为120％以上，进一步优选为150％以上。

[0100] <13>如上述<1>～<12>中任一项所述的微生物，其中，在使用甘油含量为20％(w/v)的培养基进行培养的情况下，将地衣芽孢杆菌 ATCC9945a株的繁殖度设定为100％时的所述微生物的繁殖度为120％以上，优选为200％以上，进一步优选为280％以上。

[0101] <14>如上述<1>～<13>中任一项所述的微生物，其中，在使用甘油含量为15％(w/v)的培养基进行培养时的所述微生物的繁殖度为使用甘油含量为10％(w/v)的培养基进行培养时的繁殖度的85％以上，优选为95％以上，进一步优选为100％以上，更加优选为120％以上。

[0102] <15>如上述<1>～<14>中任一项所述的微生物，其中，在使用甘油含量为20％(w/v)的培养基进行培养时的所述微生物的繁殖度为使用甘油含量为10％(w/v)的培养基进行培养时的繁殖度的30％以上，优选为40％以上，进一步优选为50％以上，更加优选为55％以上，特别优选为70％以上。

[0103] <16>如上述<1>～<15>中任一项所述的微生物，其中，以保藏号NITE BP-01552或NITE BP-01551特定。

[0104] <17>一种PGA的生产方法，其中，培养上述<1>～<16>中任一项所述的微生物来生产PGA。

[0105] <18>如上述<17>所述的PGA的生产方法，其中，使用含有甘油作为碳源的培养基来培养所述微生物。

[0106] <19>如上述<17>或<18>所述的PGA的生产方法，其中，使用以甘油作为主要碳源并且以选自有机酸、谷氨酸以及它们的盐中的至少1种作为辅助碳源的培养基来培养所述微生物。

[0107] <20>如上述<17>或<18>所述的PGA的生产方法，其中，使用不含谷氨酸而含有甘油作为唯一的碳源的培养基来培养所述微生物。

[0108] <21>如上述<18>～<20>中任一项所述的PGA的生产方法，其中，在使用甘油作为用于生产PGA的培养基中的碳源的情况下，培养基中的甘油含量为1％(w/v)以上，优选为5％(w/v)以上，进一步优选为10％(w/v)以上，优选为30％(w/v)以下，进一步优选为20％(w/v)以下。

[0109] <22>如上述<18>～<21>中任一项所述的PGA的生产方法，其中，培养基中所含的所述甘油为生物燃料等的制造时作为副产物产生的甘油。

[0110] 实施例

[0111] 以下基于实施例来更详细地说明本发明，但是本发明不限定于此。另外，对于没有记载生产商的试剂，可以使用通常能够获得的试剂。

[0112] 试验例1微生物的取得

[0113] 在预先经过灭菌的4.0mL的0.85％(w/v)氯化钠水溶液中添加在国内各地收集的土壤样品和食品样品，进行搅拌、混合之后，在80℃下进行30分钟加热处理，调制样品原液。将该样品原液使用同样的氯化钠水溶液调制稀释至10-2倍、10-4倍的样品稀释液。接着，在LB琼脂培养基(培养基组成：1.0％(w/v)Bacto trypton(Becton，Dickinson and Company)、0.5％(w/v)酵母提取物(Becton，Dickinson and Company)、1.0％(w/v)氯化钠、
1.5％(w/v)琼脂)以及Margaritis琼脂培养基(培养基组成：3.82％(w/v)谷氨酸钠一水合物、1.0％(w/v)硫酸铵、3.06％(w/v)柠檬酸三钠二水合物、2.0％(w/v)甘油、0.05％(w/v)硫酸镁七水合物、0.005％(w/v)氯化铁六水合物、0.02％(w/v)氯化钙七水合物、0.003％(w/v)硫酸锰四-五水合物、0.1％(w/v)磷酸氢二钾、0.1％(w/v)磷酸氢二钠十二水合物、
0.00005％(w/v)生物素、0.01％(w/v)L-色氨酸、1.5％(w/v)琼脂)中涂抹各200μL的所述样品原液和样品稀释液之后，在30℃下培养2～4天。恒温下进行培养之后，挑选琼脂培养基上出现的菌落。进一步，为了菌株纯化，将挑选的菌落在用于土壤样品和食品样品的涂抹中的相同组成的琼脂培养基中划线涂抹于铂环上，在30℃下培养2～4天。在琼脂培养基上用铂环采集作为单一菌落繁殖的菌体，将其悬浊于含有20％(w/v)的甘油的LB培养基(培养基组成：1.0％(w/v)Bacto trypton(Becton，Dickinson and Company)、0.5％(w/v)酵母提取物(Becton，Dickinson and Company)、1.0％(w/v)氯化钠)中之后，在-80℃下冷冻保存。

[0114] 实施例1

[0115] 在LB琼脂培养基上划线涂抹试验例1中挑选的微生物的-80℃保存样品，在30℃下静置培养一晚。将得到的单一菌落接种于5mL的非专利文献2记载的GB培养基(培养基组成：1.0％(w/v)极东胨(极东制药工业)、1.0％(w/v)PREMedia普通肉汤培养基(极东制药工 业)、0.5％(w/v)氯化钠(和光纯药工业)，调整为pH7.0)中，在30℃、250rpm下进行振荡培养
18～24小时。进一步，在30mL 7.5％甘油-M培养基(培养基组成：7.5％(w/v)甘油、1.8％(w/v)氯化铵、0.15％(w/v)磷酸氢二钾、0.035％(w/v)硫酸镁七水合物、0.005％(w/v)硫酸锰五水合物、3.0％(w/v)碳酸钙)中接种0.6mL所述培养液(2％(w/v))，在30℃、150rpm下进行振荡培养4天。其后，测定各菌株的PGA生产性。

[0116] 将各菌株的PGA生产性的结果示于表4中。

[0117] [表4]

[0118]菌株 PGA生产性(g/L/4天)
枯草芽孢杆菌TAM-4 0.6(非专利文献2记载的信息)
地衣芽孢杆菌ATCC9945a 2.7±2.2
地衣芽孢杆菌KSM-PG121 1.6±0.3
地衣芽孢杆菌KSM-PG115 2.5±0.2

[0119] 如表4所示，在与非专利文献2同样的实验条件下进行培养，结果确认，与公知的枯草芽孢杆菌TAM-4株相比较，本发明的微生物显示高的PGA生产性。

[0120] 另外，也重新确认了与非专利文献5所记载的内容相反，作为公知的菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株将甘油作为唯一的碳源不依赖谷氨酸地生产PGA。

[0121] 实施例2

[0122] 包含试验例1中挑选的其它微生物，将下述表5所示的微生物划线涂抹于LB琼脂培养基上，在30℃下静置培养一晚。将得到的单一菌落接种于5mL LB培养基中，在30℃、250rpm下进行振荡培养18～24小时。进一步，将0.6mL(2％(v/v))所述培养液接种于30mL 
7.5％甘油-M培养基中，在37℃、210rpm下进行振荡培养4天。其后，测定各菌株的PGA生产性。

[0123] 将各菌株的PGA生产性的结果示于表5中。

[0124] [表5]

[0125]菌株 PGA生产性(g/L/4天)
地衣芽孢杆菌ATCC9945a 2.2±1.2
地衣芽孢杆菌KSM-PG121 7.7±3.6
地衣芽孢杆菌KSM-PG115 10.0±4.5
地衣芽孢杆菌KSM-FFA033 7.7±1.0
地衣芽孢杆菌KSM-FFA036 7.3±2.2
地衣芽孢杆菌KSM-FFA039 6.1±2.6

[0126] 如表5所示，确认了相对于非专利文献2的实验条件，通过种子培养基组成的变更以及培养条件的变更，本发明的微生物显示更高的PGA生产性。

[0127] 另外，确认了通过将培养条件最优化，与作为公知菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株相比，本发明的微生物能够将甘油作为唯一的碳源不依赖谷氨酸地效率良好地生产PGA。

[0128] 实施例3

[0129] 将试验例1中挑选的微生物划线涂抹于LB琼脂培养基上，在30℃下静置培养一晚。将得到的单一菌落接种于5mL的LB培养基与10％甘油-M培养基(培养基组成：10％(w/v)甘油、1.8％(w/v)氯化铵、0.15％(w/v)磷酸氢二钾、0.035％(w/v)硫酸镁七水合物、0.005％(w/v)硫酸锰五水合物、3％(w/v)碳酸钙)的混合培养基(LB培养基：M培养基＝2:8，以下作为“LB培养基”)，在30℃下、250rpm下进行振荡培养18～24小时。进一步，将所述培养基接种于10％甘油-M培养基30mL中以使OD600成为约0.1，在30℃、210rpm下进行振荡培养5天。其后，测定各菌株的PGA生产性。

[0130] 将各菌株的PGA生产性的结果示于表6中。

[0131] [表6]

[0132]菌株 种子培养基 评价培养基 生产性(g/L/5天)
地衣芽孢杆菌KSM-PG121 LM培养基 M培养基 17.6±6.5
地衣芽孢杆菌KSM-PG115 LM培养基 M培养基 9.1±5.1

[0133] 如表6所示，确认了本发明的微生物，特别是地衣芽孢杆菌KSM-PG121株通过将甘油浓度等培养条件最优化，显示更高的PGA生产性。

[0134] 实施例4

[0135] 将试验例1中挑选的微生物划线涂抹于LB琼脂培养基上，在30℃下静置培养一晚。将得到的单一菌落接种于5mL LB培养基中，在30℃、250rpm下进行振荡培养18～24小时。进一步将所述培养液0.6mL(2％(v/v))接种于30mL的GC-E培养基(培养基组成：8％(w/v)甘油、1.84％(w/v)柠檬酸三钠二水合物、0.7％(w/v)氯化铵、0.05％(w/v)磷酸氢二钾、
0.05％(w/v)硫酸镁七水合物、0.0148％(w/v)硫酸锰五水合物、0.015％(w/v)氯化钙二水合物、0.00017％(w/v)硫酸锌七水合物、0.000043％(w/v)硫酸铜一水合物、0.000006％(w/v)氯化钴六水合物、0.00073％(w/v)氯化钙七水合物、0.000006％(w/v)钼酸钠二水合物)中，在37℃、210rpm下进行振荡培养4天。其后，测定各菌株的PGA生产性。

[0136] 将各菌株的PGA生产性的结果示于表7中。

[0137] [表7]

[0138]菌株 PGA生产性(g/L/4天)
地衣芽孢杆菌ATCC9945a 0.7±0.0
地衣芽孢杆菌KSM-PG121 5.0±1.0
地衣芽孢杆菌KSM-PG115 4.8±0.8
地衣芽孢杆菌KSM-FFA033 7.7±2.7
地衣芽孢杆菌KSM-FFA036 10.0±0.7
地衣芽孢杆菌KSM-FFA039 10.7±0.6

[0139] 如表7所示，即使在使用含有甘油作为主碳源并且含有有机酸作为辅助碳源的培养基培养本发明的微生物的情况下，本发明的微生物也能够大量生产PGA。

[0140] 实施例5

[0141] 将试验例1中挑选的微生物划线涂抹于LB琼脂培养基上，在30℃下静置培养一晚。将得到的单一菌落接种于5mL LB培养基中，在30℃、250rpm下进行振荡培养18～24小时。进一步将所述培养液0.6mL(2％(v/v))接种于30mL的GCM-E培养基(培养基组成：8％(w/v)甘油、1.84％(w/v)柠檬酸三钠二水合物、2.54％(w/v)谷氨酸钠一水合物、0.7％(w/v)氯化铵、0.05％(w/v)磷酸氢二钾、0.05％(w/v) 硫酸镁七水合物、0.0148％(w/v)硫酸锰五水合物、0.015％(w/v)氯化钙二水合物、0.00017％(w/v)硫酸锌七水合物、0.000043％(w/v)硫酸铜一水合物、0.000006％(w/v)氯化钴六水合物、0.00073％(w/v)氯化钙七水合物、
0.000006％(w/v)钼酸钠二水合物)中，在37℃、210rpm下进行振荡培养4天。其后，测定各菌株的PGA生产性。

[0142] 将各菌株的PGA生产性的结果示于表8中。

[0143] [表8]

[0144]菌株 PGA生产性(g/L/4天)
地衣芽孢杆菌ATCC9945a 1.8±0.3
地衣芽孢杆菌KSM-PG121 11.3±1.5
地衣芽孢杆菌KSM-PG115 9.7±1.3
地衣芽孢杆菌KSM-FFA033 28.6±1.9
地衣芽孢杆菌KSM-FFA036 28.0±0.8
地衣芽孢杆菌KSM-FFA039 29.6±0.1

[0145] 如表8所示，即使在使用含有甘油作为主碳源并且含有有机酸和谷氨酸作为辅助碳源的培养基培养本发明的微生物的情况下，本发明的微生物也能够大量生产PGA。

[0146] 试验例2微生物的繁殖度的测定

[0147] 将试验例1中挑选的微生物划线涂抹于LB琼脂培养基上，在30℃下静置培养一晚。将得到的单一菌落接种于5mL的LB培养基中，在30℃、250rpm下进行振荡培养18～24小时。
进一步将所述培养液0.05mL(1％(v/v))接种于含有10％、15％、20％的甘油的5mL M/MOPS培养基(培养基组成：10.0～20.0％(w/v)甘油、1.8％(w/v)氯化铵、0.15％(w/v)磷酸氢二钾、0.035％(w/v)硫酸镁七水合物、0.005％(w/v)硫酸锰五水合物、100mM MOPS缓冲液(吗啉丙磺酸，pH7.0))中，在37℃、250rpm下进行振荡培养4天。

[0148] 将用10％甘油-M/MOPS培养基培养作为模式菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a株的情况下的繁殖度(OD600)设定为100，用相对值测定各菌株的繁殖度。将其结果示于表9中。另外，将各甘油浓度下的所述模式菌株的繁殖度设定为100，以15％和20％甘油浓度下各自繁殖度的相对值进行测定。将其结果示于表9的括号内。

[0149] [表9]

[0150]

[0151] 如表9所示，作为模式菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a株在高浓度甘油的条件下繁殖度大大降低。相对于此，本发明的微生物在高浓度甘油的条件下的繁殖度的降低小。

[0152] 进一步，在本发明的微生物中的特征是，甘油15％下的繁殖度为甘油10％下的繁殖度的90％以上，或者即使为90％以下，甘油20％下的繁殖度为甘油10％下的繁殖度的50％以上。即，启示了这些性质是即使在谷氨酸不存在下将甘油作为唯一的碳源也显示高的PGA生产性的菌株这一共通特征的可能性。

[0153] 另外，启示了与模式菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a株相比较，含有甘油浓度10％～20％的培养基中的本发明的微生物的繁殖度高是共通特征的可能性。具体来说，特征是含有甘油浓度10％～20％的培养基中的本发明的微生物与模式菌株相比较为109％以上。

[0154] 试验例3细菌学的各性质

[0155] 对所述地衣芽孢杆菌的各菌株(KSM-PG121株、KSM-PG115株、KSM-FFA033株、KSM-FFA036株、以及KSM-FFA039株)的细菌学性质进行讨论。将其结果示于表10中。

[0156]

[0157] 关于由糖生成酸和气体，确认了对于特定糖类的利用性在试验例1中挑选的菌株与作为公知菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株之间不同。

[0158] 具体来说，地衣芽孢杆菌KSM-PG115株以及KSM-PG121株不具有对于L-山梨糖、L-鼠李糖、半乳糖醇、D-蜜二糖、菊糖、D-棉子糖以及葡萄糖酸的利用性，与地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株不同。

[0159] 另外，地衣芽孢杆菌KSM-FFA033、KSM-FFA036以及KSM-FFA039株不具有对于半乳糖醇、N-乙酰氨基葡萄糖以及D-乳糖的利用性，与作为模式菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株不同。

[0160] 另外，地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株不具有对于D-蜜二糖以及D-松二糖的利用性，与地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株不同。

[0161] 进一步，地衣芽孢杆菌KSM-FFA039不具有对于L-山梨糖以及龙胆二糖的利用性，与作为模式菌株的地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株不同。

[0162] 如表10所示，地衣芽孢杆菌ATCC9945a模式菌株具有半乳糖醇利用性。相对于此，试验例1中挑选的菌株共通地不具有半乳糖醇利用性，启示了即使在谷氨酸不存在下将甘油作为唯一的碳源也显示高的PGA生产性的菌株这一共通特征的可能性。

[0163] 进一步，如表10所示，地衣芽孢杆菌KSM-PG121株和地衣芽孢杆菌KSM-PG115株关于表10所示的细菌学性质具有实质上相同的性质。这些细菌学性质启示了在使用不含谷氨酸而含有甘油作为唯一的碳源的培养基进行培养的情况下，显示特别高的PGA生产性的地衣芽孢杆菌的特征的可能性。

[0164] 试验例4各菌株的16S rDNA碱基序列的分析

[0165] 关于所述地衣芽孢杆菌的各菌株(KSM-PG115株、KSM-PG121株、KSM-FFA033株、KSM-FFA036株、以及KSM-FFA039株)，进行通过16S rDNA碱基序列的细菌学鉴定。

[0166] 将冷冻保存菌体用1mM TE缓冲剂(pH8.0)稀释30倍，将由此稀释后的物质作为PCR反应的模板，使用表11所示的碱基序列的引物17f以及1525r进行PCR反应，扩增16S rDNA区域的全长DNA片 段。DNA聚合酶使用TaKaRa LA Taq(Takara Bio)。PCR反应条件为在95℃下使模板DNA变性5分钟之后，将95℃下1分钟、55℃下30秒、72℃下2分钟作为1个循环进行30个循环，进一步在72℃下恒温2分钟。对于得到的16S rDNA区域约1.5kb的DNA片段，分别将表11所示的碱基序列的引物27f、f2L(-)、926f、rE1L、r2L'以及1525r用作测序用引物，进行DNA碱基序列的分析。另外，在测序分析样品的调制中，使用BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Life Technologies)，按照所附的协议进行样品调制。在分析前的样品精制中使用Montage SEQ96Sequencing Reaction Cleanp kit(Merck Millipore)。

[0167] [表11]

[0168]引物 碱基序列 序列号
27f 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1
1525r 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ 2
rE1L 5’-GTAGGAGTCTGGACCGTGT-3’ 3
f2L(-) 5’-CCAGCAGCCGCGGTAATA-3’ 4
926f 5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3’ 5
r2L’ 5’-GACTACCAGGGTATCTAATC-3’ 6

[0169] 制得的测序样品使用DNA测序仪(商品名：ABI 3130xl Genetic Analyzer，Life Technologies)进行序列分析，确定碱基序列。将地衣芽孢杆菌KSM-PG121株的16S rDNA的碱基序列示于序列号7。将地衣芽孢杆菌KSM-PG115株的16S rDNA的碱基序列示于序列号8。将地衣芽孢杆菌KSM-FFA033株的16S rDNA的碱基序列示于序列号9。将地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株的16S rDNA的碱基序列示于序列号10。将地衣芽孢杆菌KSM-FFA039株的16S rDNA的碱基序列示于序列号11。

[0170] 使用Genetyx-Win(基因信息处理软件，GENETYX CORPORATION制造)将得到的各碱基序列1片段化。另外，在序列号7所示的碱基序列与序列号8所示的碱基序列之间，使用Genetyx-Win(基因信息处理软件，GENETYX CORPORATION制造)的同源性分析程序算出碱基序列的同源性。其结果，在序列号7所示的碱基序列与序列号8所示的碱基序列之间，同源性为100％。根据该结果，可以确认由序列号7所示的碱基序列构成的16S rDNA与由序列 号8所示的碱基序列构成的16S rDNA是实质上相同的16S rDNA，KSM-PG121株和KSM-PG115株具有相同的16S rDNA。

[0171] 序列的同源性检索使用公开数据库NCIMB(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，http://www.ncbi.nlm.gov/)的选单“Nucleotide”内的“BLAST”中的“BasicBLAST”，根据BLAST程序选择“nucleotide blast”。在检索对象的数据库中指定“Reference genomic sequences(refseq_genomics)”，在选择方案中指定“Highly similar sequences(megablast)”，基于各碱基序列的同源性检索结果进行近缘种的推测。将其结果示于表12中。

[0172] [表12]

[0173]菌株 解读序列长(bp) 同源性(％) 鉴定结果
地衣芽孢杆菌KSM-PG121 1,458 99 地衣芽孢杆菌ATCC 14580,全基因组
地衣芽孢杆菌KSM-PG115 1,458 99 地衣芽孢杆菌TCC 14580,全基因组
地衣芽孢杆菌KSM-FFA033 1,437 99 地衣芽孢杆菌ATCC 14580,全基因组 地衣芽孢杆菌KSM-FFA036 1,520 99 地衣芽孢杆菌ATCC 14580,全基因组 地衣芽孢杆菌KSM-FFA039 1,514 99 地衣芽孢杆菌ATCC 14580,全基因组 [0174] 16S rDNA碱基序列分析的结果明确了所述菌株都具有与地衣芽孢杆菌ATCC14580株最高同源性的16S rDNA的碱基序列。

[0175] 因此，所述菌株与细菌学性质一并判断为类似地衣芽孢杆菌的安全性高的微生物菌株。

[0176] 另外，地衣芽孢杆菌KSM-PG121株在2013年2月28日以保藏号NITE BP-01552保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。另外，地衣芽孢杆菌KSM-PG115株在2013年2月28日以保藏号NITE BP-01551保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。另外，地衣芽孢杆菌KSM-FFA033株在2013年2月28日以保藏号NITE BP-01553保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。另外，地衣芽孢杆菌KSM-FFA036株在2013年2月28日以保藏号NITE BP-01554保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。另外，地衣芽孢杆菌KSM-FFA039株在2013年2月28日以保藏号NITE BP-01555保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。

[0177] 试验例5培养液上清液样品中的高分子物质的鉴定

[0178] 将培养结束后的培养液样品在室温下以14,800rpm供给离心分离30分钟(机种名称：himacCF15RX，日立工机)，对于得到的离心分离后的样品上清液中所含的高分子物质进行鉴定。

[0179] 将成为分析对象的上清液样品0.5～1.0mL采集于带螺帽的试管(商品名：ST-15S，日本电子理化硝子)中，对于该上清液样品新加入2倍容量的乙醇。用触摸式混合器进行搅拌，将混合后的样品在4℃下恒温放置一晚。其后，以4℃、3,000rpm提供30分钟离心分离(机种名称：himacCF7D2，日立工机)，回收沉淀组分。接着，将沉淀组分再次溶解于0.5mL的1％NaCl溶液中，添加2倍容量的乙醇，在上述同样的离心分离条件下回收生成的沉淀组分。回收的沉淀生成物用离心蒸发器(机种名称：CVE-200D，EYELA)使之干固，测定回收的固体成分的重量。将该干固样品再次用0.5mL蒸馏水溶解，在其中加入0.5mL浓盐酸进行搅拌之后，封入氮，在105～110℃下进行加热处理16小时。加热处理后，在气流内在氮气气流下馏去盐酸和水分(约6小时)，将得到的干固物作为水解样品。

[0180] 另外，作为PGA样品使用市售PGA(分子量880k，Meiji Food Material Co.,Ltd.)，作为水解样品的对照使用L-谷氨酸和D-谷氨酸(和光纯药工业公司制造)。

[0181] 接着，适当稀释得到的水解样品，用全自动氨基酸分析装置(机种名称：L-8900，Hitachi High-Technologies Corporation)进行样品中的各种氨基酸分析、以及谷氨酸的定量。另外，使用L-谷氨酸测定试剂盒(YAMASA CORPORATION)，按照试剂盒所附的协议记载的方法进行L-谷氨酸量的测定。通过全自动氨基酸分析装置的测定中，将光学活性异构体(D/L)的总量作为定量结果得到。从其中减去用L-谷氨酸测定试剂盒得到的定量结果的差值作为D-谷氨酸量。将这些结果示于表13中。

[0182] [表13]

[0183]

[0184] 由于通过上述方法，几乎没有检测出谷氨酸以外的氨基酸，因此，将培养上清液中高分子物质判断为PGA。

[0185] 进一步，地衣芽孢杆菌的各菌株(KSM-PG115株、KSM-PG121株、KSM-FFA033株、KSM-FFA036株、以及KSM-FFA039株)生产的PGA的D:L比是与至今为止报道的地衣芽孢杆菌生产的PGA的D:L比接近的值。

[0186] 试验例6 PGA的定量法

[0187] 实施例1～5中调制的PGA的定量通过下述所示的方法来进行。

[0188] 将实施例1～5中实施的评价培养的培养液样品在室温下以14,800rpm提供30分钟离心分离(机种名称：himacCF15RX，日立工机)，调制培养液上清液样品。将该上清液样品用0.1M硫酸钠适当稀释，使用MULTI SCREEN MNHV45(MILLIPORE制造，0.45μm Durapore膜)进行为了除去不溶物的前处理。将该调制样品作为HPLC分析样品，进行使用了凝胶过滤柱的体积排除色谱法。对于分析柱， 使用TSKGel G4000PWXL和TSKGel G6000PWXL(商品名，Tosoh Corporation)。洗脱液使用0.1M硫酸钠，将流速设定为1.0mL/分钟，将柱温度设定为
50℃，将UV检测波长设定为210nm。另外，浓度检测中使用用分子量为88万的PGA(Meiji Food Material Co.,Ltd.)制作的校正曲线。

[0189] 尽管将本发明与其实施方式一起进行说明，但是，除非我们特别指定，本发明并不限于说明的任意详细部分，认为可以在不违反附加的权利要求所示的发明精神和范围的情况下进行广泛的解释。

[0190] 本申请基于2013年9月3日在日本进行了专利申请的日本特愿2013-182367以及2014年8月27日在日本进行了专利申请的日本特愿2014-172346主张优先权，这些在此作为参照并将其内容作为本说明书记载的一部分引入。