一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用 |
|||||||
| 申请号 | CN201510268046.6 | 申请日 | 2015-05-22 | 公开(公告)号 | CN104894017A | 公开(公告)日 | 2015-09-09 |
| 申请人 | 徐州工程学院; | 发明人 | 高兆建; 王东星; 侯进慧; 唐仕荣; 孙会刚; 徐大伟; 郑义; 杨宪瑶; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用，该株地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)DBM12，保藏编号：CGMCC？No.8672。本发明的地衣芽孢杆菌不仅对 碳 源和氮源要求较低、 发酵 时间短、菌株安全无毒，可以在食品 饲料 工业中使用；而且遗传 稳定性 好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能 力 基本不变。 | ||||||
| 权利要求 | 1. 一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.8672。 |
||||||
| 说明书全文 | 一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用技术领域背景技术[0002] 阿魏酸(ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植物中的一种酚酸。具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸，必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的强度。但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。 [0003] 阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，feruloyl esterase)又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此，阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的应用潜能。 [0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。 发明内容[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用，该菌株不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变。 [0006] 一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.8672。 [0007] 本发明所述的地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤： [0008] 步骤1，土样采集及处理 [0010] 取5-10g土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上，120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80℃水浴加热15-30min，期间每隔5min中震荡一次。 [0011] 步骤2，富集培养 [0012] 取1-2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养20-24h。然后取1-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10％的富集培养基二中，继续在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养18-20h。 [0013] 富集培养基一：酵母提取物0.5g，KH2PO4 0.1g，NH4NO3 0.1g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.25g，微量元素1mL，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH4.0。 [0014] 富集培养基二：NH4NO30.5g，尿素0.1g，KH2PO40.1g，NaCl 0.1g，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH3.0。 [0015] 微 量 元 素：EDTA 5g，CaCl2·2H2O 6g，FeSO4·7H2O 6g，MnCl2·4H2O 1.15g，CoCl2·6H2O 0.8g，ZnSO4·7H2O 0.7g，CuCl2·2H2O 0.3g，H3BO3 0.3g，(NH4)6Mo7O2·4H2O0.25g，去离子水1000mL。 [0016] 步骤3，初筛 [0017] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液150-250μL涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封口，将培养皿置于40-45℃培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20℃培养箱中继续培养6-12h。 [0018] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60℃恒温培养24-48h。挑选出在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化培养基，于45-50℃培养1-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜面保藏培养基中4℃保存，接着进一步复筛。 [0019] 初筛培养基一：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.1g，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0.1g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O 0.025g，FeSO4·7H2O 0.001g，琼脂2.5，去离子水100mL，调节pH4.5。 [0020] 初筛培养基二：KH2PO4 0.2g，(NH4)2SO40.4g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O0.001g，MnSO4 0.001g，ZnCl2 0.001g，琼脂2.5g，去离子水100mL，pH4.0。培养基121℃、 15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。 [0021] 阿魏酸乙酯溶液：0.2g阿魏酸乙酯加到1.5mL无菌离心管中，再加入500μLN、N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500μL无菌水，充分摇匀。 [0022] 步骤4，复筛 [0023] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45℃恒温培养箱培养16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45℃，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10％的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50℃，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。 [0024] 复筛种子培养基：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.02g、加去离子水至100mL，pH4.5，121℃，灭菌15min。 [0025] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0.5g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O 0.04g、去离子水100mL，pH4.5，121℃，灭菌15min。 [0026] 所述的地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)DBM12在发酵产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤： [0027] 步骤1，将地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵周期2-3d，发酵温度35-40℃，接种量4-10％，摇床转速160-200r/min； [0028] 步骤2，将步骤1的发酵液8000r/min离心20min，上清用0.22μm过滤，收集滤液； [0029] 步骤3，按硫酸铵饱和度为75％，向步骤2所得滤液中添加硫酸铵，4℃静置12h，8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6.0磷酸缓冲溶液溶解，上样Sephedex G25分子筛凝胶柱脱盐，以pH6.5的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速率为15～20ml/h，得到粗酶液； [0030] 步骤4，将步骤3所得粗酶液加到麸皮粉中，再加水，调节pH6.5，摇床上震荡频率120r/min，50℃酶解12h，沸水灭酶，离心取上清，即为阿魏酸。 [0031] 作为上述发明的进一步改进，步骤1所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨2g、葡萄糖0.5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉1g、酵母提取物0.5g、NaCl 0.4g、KH2PO40.1g、MgSO4 0.05g，蒸馏水100mL，pH7.0-7.5。 [0032] 作为上述发明的进一步改进，步骤4中粗酶液用量为5mL，麸皮粉用量为10g，水用量为150mL。 [0033] 本发明的地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)DBM12不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变；该菌株所产阿魏酸酯酶耐热耐酸，在饲料加工中具有重要应用。附图说明 [0034] 图1为实施例1中的复筛平板图； [0035] 图2为实施例3中阿魏酸酯酶的最适作用pH及酸碱稳定性曲线图； [0036] 图3为实施例3中阿魏酸酯酶最适作用温度曲线图； [0037] 图4为实施例3中阿魏酸酯酶的热稳定性曲线图。 具体实施方式[0038] 实施例1 [0039] 地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)DBM12的筛选方法，包括以下步骤： [0040] 步骤1，土样采集及处理 [0041] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。 [0042] 取5-10g土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上，120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80℃水浴加热15-30min，期间每隔5min中震荡一次。 [0043] 步骤2，富集培养 [0044] 取1-2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养20-24h。然后取1-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10％的富集培养基二中，继续在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养18-20h。 [0045] 富集培养基一：酵母提取物0.5g，KH2PO4 0.1g，NH4NO3 0.1g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.25g，微量元素1mL，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH4.0。 [0046] 富集培养基二：NH4NO30.5g，尿素0.1g，KH2PO40.1g，NaCl 0.1g，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH3.0。 [0047] 微 量 元 素：EDTA 5g，CaCl2·2H2O 6g，FeSO4·7H2O 6g，MnCl2·4H2O 1.15g，CoCl2·6H2O 0.8g，ZnSO4·7H2O 0.7g，CuCl2·2H2O 0.3g，H3BO30.3g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.25g，去离子水1000mL。 [0048] 步骤3，初筛 [0049] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液150-250μL涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封口，将培养皿置于40-45℃培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20℃培养箱中继续培养6-12h。 [0050] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60℃恒温培养24-48h。挑选出在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化培养基，于45-50℃培养1-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜面保藏培养基中4℃保存，接着进一步复筛。初筛结果如表1所示。 [0051] 初筛培养基一：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.1g，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0.1g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O 0.025g，FeSO4·7H2O 0.001g，琼脂2.5，去离子水100mL，调节pH4.5。 [0052] 初筛培养基二：KH2PO4 0.2g，(NH4)2SO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O0.001g，MnSO4 0.001g，ZnCl2 0.001g，琼脂2.5g，去离子水100mL，pH4.0。培养基121℃、 15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。 [0053] 阿魏酸乙酯溶液：0.2g阿魏酸乙酯加到1.5mL无菌离心管中，再加入500μLN、N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500μL无菌水，充分摇匀。 [0054] 步骤4，复筛 [0055] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45℃恒温培养箱培养16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45℃，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10％的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50℃，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。 [0056] 复筛种子培养基：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.02g、加去离子水至100mL，pH4.5，121℃灭菌15min。 [0057] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0.5g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O 0.04g、去离子水100mL，pH4.5，121℃灭菌15min。 [0058] 酶活平板检测方法：0.02mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH4.5)100mL，琼脂粉2.5g，121℃、15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径90mm的培养皿中。琼脂充分凝固后用直径6mm的打孔器均匀打孔约3-10个。将发酵液离心后取上清100μL加到孔中，45℃过夜，查看透明圈情况。结果如图 1所示。 [0059] 步骤5，菌种保藏 [0061] LB斜面培养基配方为：蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母粉0.5g，琼脂1.5g，pH值5.0，121℃灭菌15min。 [0062] 表1 初筛平板筛选结果 [0063]筛选菌株 菌落直径D/cm 透明圈直径d/cm d/D DBM3 0.3 2.2 7.33 DBM4 0.4 1.5 3.75 DBM6 0.15 1.1 3.67 DBM9 0.52 1.5 2.88 DBM10 0.15 2.6 3.71 DBM16 0.4 2.3 5.75 DBM18 0.3 1.1 3.67 DBM24 0.4 2.1 5.25 DBM26 0.3 2.9 9.67 DBM12 0.3 3.1 10.33 DBM28 0.4 2.2 5.50 DBM29 0.6 2.3 3.83 DBM35 0.4 3.2 8.00 DBM42 0.6 2.1 3.50 DBM47 0.2 1.1 5.50 DBM49 0.3 2.4 8.00 DBM51 0.4 2.4 6.00 DBM58 0.5 2.1 4.20 [0064] 所得菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，菌落圆形，直径2.4-3.2mm；菌落为白色，不透明，表面较平且干燥，牢固附着培养基，难以挑取。在牛肉膏蛋白胨液体培养基中静止培养，无沉淀，液体清亮，培养基表面形成白色皱皮膜，表面有颗粒，膜较薄。观察菌体形态，革兰氏染色阳性，生长过程产生芽孢，孢囊无膨大，无伴孢晶体，菌体杆状，具有运动性。菌株DBM12具体的形态学及生理生化特征见下表2。菌落、染色特征和生理生化特征与《伯杰细菌鉴手册》(第八版)中的地衣芽孢杆菌比较接近，初步确定菌株DBM12为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。 [0065] 表2 菌株DBM12形态学及生理生化特性 [0066]特性 结果 特性 结果 厌氧生长 + 水解明胶 + 孢子囊 + 水解淀粉 + 接触酶试验 + 尿素利用 - V.P试验 + 硝酸盐利用 + 卵磷脂试验 - 吲哚试验 - 甲基红试验 + D-甘露醇 + 过氧化氢酶 + D-木糖 + 柠檬酸盐利用 + L-阿拉伯糖 + 2％NaCl + D-葡萄糖 + 5％NaCl + 酵素水解 + 7％NaCl + 生长温度10℃ + pH5.7 + 生长温度50℃ + [0067] 提取本申请菌株DBM12基因组，依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，其中正向引物为F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(如SEQ ID NO.2所示)；反向引物为R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(如SEQ ID NO.3所示)。PCR反应体系为(20μL):ddH2O 12.7μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTP mix(2.5mmol/L)2.0μL，正向引物(10μmol/L)1.0μL，反向引物(10μmol/L)1.0μL，Taq FlexiPolymerase(5U/μL)0.3μL,模板 1.0μL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。用pGM-T载体克隆测序。测得序列如SEQ ID NO.1所示，与从NCBI中比对获得的相近细菌的16S rDNA序列采用ClustalX1.83进行多序列比对，显示菌株DBM12的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(EU162839)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(maxident)达到99.2％。综合DBM12菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株DBM12鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。 [0068] 实施例2应用地衣芽孢杆菌DBM12发酵生产阿魏酸酯酶并制备阿魏酸 [0069] 将筛选得到的地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵培养基配方为：蛋白胨2g，葡萄糖0.5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉1g，酵母提取物0.5g、NaCl 0.4g、KH2PO4 0.1g、MgSO4 0.05g，蒸馏水100ml、pH7.0-7.5。发酵条件为：发酵周期2-3d，发酵温度35-40℃，接种量4-10％，摇床转速160-200r/min。 [0070] 发酵结束后，将发酵液8000r/min离心20min去除菌体，并用0.22μm滤除去残余菌体和不溶物质，收集滤出液。按照硫酸铵饱和度75％，向以上发酵滤出液中添加硫酸铵，充分溶解后，4℃静置过夜，8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6.0磷酸缓冲溶液溶解，上样Sephedex G25分子筛凝胶柱脱盐，层析柱以pH6.5的磷酸缓冲液平衡后以相同缓冲溶液进行洗脱，洗脱速率为15～20ml/h，得到粗酶液。本发明所述回收方法其回收率达95％以上，将获得的粗酶低温保存。 [0071] 在500mL三角瓶中加入去淀粉麸皮粉10g,加入本发明地衣芽孢杆菌DBM12发酵制得的阿魏酸酯酶5mL,水150mL，调节pH6.5，温度为50℃，摇床上震荡频率120r/min，酶解时间12h。沸水灭酶，离心取上清测定阿魏酸浓度。在此条件下阿魏酸释放量最高为8.24mg/g麦麸,阿魏酸释放率达到80％以上。利用本发明菌株发酵所产阿魏酸酯生产阿魏酸效率高，转化快，无污染，适用于工业生产阿魏酸。 [0072] 实施例3阿魏酸酯酶的酶活及酶学特性测定 [0073] 本实施例中以实施例2所得发酵液为样品进行测定。 [0074] 1.发酵液的阿魏酸酯酶活力测定 [0075] 向2mL离心管中加入0.5mL酶液，再加入0.5mL阿魏酸甲酯溶液，充分混匀，50℃保温20min，然后加入1mL体积分数为10％的冰乙酸以终止反应。样品于12000r/min离心10min，保留上清液，适当稀释后，用高效液相色谱(HPLC)法测定样品中的阿魏酸含量。空白样品为煮沸灭活的酶液，处理方法同上。阿魏酸酯酶的酶活定义：在50℃，pH值为6.5的条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量。阿魏酸采用高效液相色谱法测定。 [0076] 2.发酵液的阿魏酸酯酶酶学特性 [0077] 1)最适作用pH值 [0078] 选择的pH范围及体系如下(50mmol/L)：(柠檬酸缓冲溶液2.0～4.5；醋酸缓冲溶液4～5.5；磷酸缓冲溶液6～8；Tris-HCl缓冲溶液7～9；甘氨酸缓冲溶液8～12)。通过比较缓冲体系下酶活力差异，得出酶反应的最适pH。以最高酶活力为100％，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，结果见图2。该酶的最适pH值为pH5.0-8.0，当pH处于4.0～9.0之间时，该酶均有较高的相对酶活。故阿魏酸酯酶酸碱适应性较好，在较广的pH范围内，都可以发挥高的催化活力。 [0079] 2)pH耐受性 [0080] 酶液与不同pH值的缓冲液(柠檬酸缓冲溶液2.0～4.5；醋酸缓冲溶液4～5.5；磷酸缓冲溶液6～8；Tris-HCl缓冲溶液7～9；甘氨酸缓冲溶液8～12)于37℃保温12h后，再用缓冲液将其稀释，使pH值均达到pH6.5，测定酶活力。以最高酶活力为100％，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，结果见图2。结果表明酶在所检测的pH范围内均具有较强的稳定性，相对酶活均在90％以上。说明该酶在较宽的pH范围具有很好的酸碱稳定性。 [0081] 3)最适作用温度 [0082] 将酶液用pH6.5的磷酸缓冲液适当稀释后，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃下分别测定阿魏酸酯酶酶活力。以最高酶活力为 100％，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以酶活测定温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，结果如图3所示，酶的最适反应温度为50℃，在35～65℃之间均具有较高的活力，剩余酶活力在85％以上，高于65℃酶活力下降显著，在80℃时，剩余酶活力为 40％。故酶在催化反应时温度设定在35～65℃之间较为合适。 [0083] 4)温度耐受性 [0084] 将酶液用pH6.5的磷酸缓冲液适当稀释后，分别在40℃、50℃、60℃、70℃及80℃中保温不同时间，再在50℃下测定其残存酶活力。由图4可见，该酶具有较强的热稳定性，40℃～70℃保温100min，酶活力几乎没有损失，80℃保温60min仍保留80％的酶活力。以最高酶活力为100％，其它酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，结果如图3所示。该阿魏酸酯酶在40～70℃范围内稳定性较好，在70℃、60min时酶活力几乎不受影响，因此该酶属于耐热阿魏酸酯酶。该酶在pH4.0、 30℃条件下放置240小时即10天依然能保留较高的酶活力。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈