[0001] 本发明属于益生菌筛选领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用。

[0002] 地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)在细菌分类上隶属于厚壁菌门(Firmicutes)(低G+C革兰氏阳性菌)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽孢杆菌目(Bacillales)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)。地衣芽孢杆菌普遍存在于土壤及植物体表，也是人、动物肠道内常见的共生菌之一。地衣芽孢杆菌是1989年美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)公布的44种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物”之一，也是2008年12月我国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录》中规定的16种可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种之一。地衣芽孢杆菌和双歧杆菌、乳酸菌等传统益生菌相比，其活菌成分是芽孢休眠体，具有耐酸、耐高温、耐干燥等优势，可用于生产活菌制剂等，应用十分广泛。

[0003] 地衣芽孢杆菌为需氧菌，在生长过程中需消耗大量氧气，从而有效降低肠道内的氧气浓度，抑制需氧有害菌的生长，易于良好胃肠道微生态平衡的建立和维持，因此当前以饲料添加剂在水产养殖中的应用最多。地衣芽孢杆菌在生长过程中，可分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、几丁质酶、脂肪酶、碱性蛋白酶等酶类，以及脂肽类、磷脂类、多烯类等抗生素，不仅有助于饲料的消化吸收，还可提高动物的免疫力和抗病力。地衣芽孢杆菌繁殖快，生长条件低，能迅速定植在肠粘膜上，在短时间内成为肠道的优势菌，构成肠道生物屏障，阻碍病菌的人侵和定植。地衣芽孢杆菌属于安全、有益的微生物，在水产动物养殖生产中有很好的应用前景。

[0004] 但目前对虾养殖生产中应用的地衣芽孢杆菌菌株较少，且存在着菌种生物学性状平平，活菌数量偏低，作用效果不稳定等不足，特别是还没有抗对虾病毒病菌株的应用。病毒性疾病是危害对虾养殖生产的主要病害，约占对虾病害总损失率的六成；特别是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，简称WSSV)引起的白斑病，由于宿主范围广、感染死亡率高，是我国乃至全世界影响最大、危害最为严重的病毒性疾病。因此，有必要筛选出抗对虾病毒的地衣芽孢杆菌菌株。

[0005] 本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌及其应用，该菌株来源于对虾消化道，具有增强对虾细胞和体液的免疫水平，特别是提高对虾抗病毒感染能力的生物学活性。

[0006] 本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV005菌株于2013年6月16日在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013262。

[0007] 地衣芽孢杆菌LV005菌株可用于制备地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液。

[0008] 地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中地衣芽孢杆
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菌LV005活菌浓度≥10CFU/mL。

[0009] 地衣芽孢杆菌LV005的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.5％；酵母粉，0.4％；蔗糖，1.0％；氯化钠，2.5％；磷酸高铁，0.001％；硫酸镁，0.02％；硫酸锰，0.05％。

[0010] 本发明的地衣芽孢杆菌可以添加到对虾饲料原料中，也可以直接施用于对虾养殖水环境中

[0011] 本发明的地衣芽孢杆菌LV005筛选自对虾消化道，具有改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；通过提高对虾溶菌酶、过氧化氢酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相关免疫酶活性，增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会。该菌株能够激活对虾酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率；从而提高对虾蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反应能力等多种生物学功能。

[0012] 本发明所筛选的地衣芽孢杆菌菌株通过反复养殖实验证实该菌株可激活对虾酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率，从而有效阻断病毒病的发生与流行。另外，目前对虾养殖生产中应用的地衣芽孢杆菌菌株大多是来源于陆生动物的成熟菌株，更适应陆生动物的消化道环境。本发明的地衣芽孢杆菌分离自健康对虾的消化道，相比于外来菌株在其自身内外环境更容易形成优势，特别是在对虾消化道具有更优越的定植能力，从而改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖。

[0013] 实施例1：地衣芽孢杆菌的筛选

[0014] 本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV0005菌株筛选自凡纳滨对虾消化道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75％的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道组织用无菌的PBS(pH＝7.0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌PBS缓冲液适当稀释，取0.1ml涂布于2216E固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216E平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216E海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216E海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养
16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。

[0015] 纯化的菌株活化培养后稀释至105～107CFU/ml，注射健康凡纳滨对虾，每个梯度为一组，每组3个平行，每个平行10尾，用于考察该菌株的对养殖对虾的安全性。在此基础上通过对虾养殖实验和病原感染实验，综合考察该菌株提高对虾免疫水平和抗病原感染能力的效果，与对照组对虾比较达到显著性差异的初步结果后，该菌株作为抗病候选菌株，并进行下一步生理生化特性分析和16sRNA分子特性鉴定。

[0016] 地衣芽孢杆菌在2216E培养基上的菌落形态：菌落直径约2-3mm，菌落呈圆形，白色、半透明，表面光滑湿润、有凸起且边缘整齐，菌落黏稠不易挑起，培养时间延长菌落中间会塌进去形成中间扁平四周高的形状。

[0017] 碳源利用情况为：β-甲基-D-葡萄糖苷、D－阿糖醇、腺苷、D-丙氨酸、松二糖、L-乳酸、L-丙氨酸、麦芽三糖、木糖醇、L-丙氨酰-甘氨酸、N-乙酰-L谷氨酸、D-蜜三糖/棉子糖、D-木糖、琥珀酸单甲基酯、α-甲基-D-半乳糖苷、D-甘露糖、L-鼠李糖、丙酮酸甲酯、5'-磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、γ-羟丁酸、3-甲基-D-葡萄糖、2,3-丁二醇、6-磷酸-D-葡萄糖、苦杏仁苷在Biolog中碳源消耗中呈现阳性。

[0018] 其它生理生化特性：淀粉水解阳性，明胶液化阳性，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性。

[0019] 实施例2：

[0020] 将制得的100mL地衣芽孢杆菌LV005溶液与10Kg基础对虾饲料原料(含鱼粉30％、虾粉10％、豆粉25％、花生粉25％、面粉3％、玉米粉3％、复合维生素1％)混合，制成含地衣芽孢杆菌LV005的免疫饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，准确称重后逐级充分混匀，以褐藻酸钠作为粘合剂，加适量水用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料，在40℃条件下烘干至水分含量10％以下，分袋包装，于4℃冰箱中保存备用。

[0021] 健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组养殖对虾50尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。水温24-26℃，连续充气；每日换水1次，日换水量为1/3；每日投喂饲料4次，日投饵量约为1.2-1.4克/10尾，投喂1h后吸去剩余饲料，并根据残饵的多少调节投饵量。免疫饲料养殖21天后，进行白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。攻毒后各组继续投喂相应饲料，每天及时捡出死虾，记录死亡数量，14d后结束感染实验。实验组和对照组每日平均累计死亡率结果见下表，实验结果显示在感染5d内，实验组与对照组累积死亡率为差异不显著(P>0.05)；
从第6d始各组均呈明显的上升趋势，对照组累积死亡率较实验组差异显著(P<0.05)；至感染实验结束前1天对照组的累积死亡率为100％，实验组的累积死亡率为75％。

[0022]

[0023] 实施例3：

[0024] 含1％(V/W)地衣芽孢杆菌LV005溶液的对虾免疫饲料(活菌总浓度≥107CFU/mL)的制备方法同实施例1。

[0025] 健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组养殖对虾150尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。免疫饲料养殖21天后，进行WSSV人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。免疫期间分别在1、3、7和15d进行取样，攻毒期间分别在6h，18h，96h，192h取样，采用实时荧光定量PCR法测定复合芽孢杆菌制剂对凡纳滨对虾肠道硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)基因表达量的影响。以对照组Trx表达量为1，实验组Trx的相对表达量见下表。从表中数据可以看出实验组Trx相对表达量在整个免疫期间呈上调再下调趋势，不同时刻的实验组的Trx相对表达量较对照组有显著差异；WSSV感染期间实验组Trx相对表达量呈上调再下降的趋势，不同时刻都可看出免疫饲料组较对照组有显著差异。结果表明投喂含复合芽孢杆菌饲料后，凡纳滨对虾肠道Trx基因的表达水平可显著提高。

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[0027] 实施例4：

[0028] 含1％(V/W)地衣芽孢杆菌LV005溶液的对虾免疫饲料(活菌总浓度≥107CFU/mL)的制备方法同实施例1。

[0029] 健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组养殖对虾150尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。免疫饲料养殖21天后，进行WSSV人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。分别在病毒感染后的6、18、96和192h取样，采用实时荧光定量PCR法测定虾鳃的病毒拷贝数，结果见下表。

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