New heparitinases, its production method and its producing bacteria

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパラン硫酸及びヘパリンを分解する新規酵素ヘパリチナーゼ、その製法及びその生産菌に関する。

【０００２】ヘパリチナーゼは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとウロン酸との二糖単位の繰り返しを基本構造とする、複合多糖であるヘパラン硫酸（以下ＨＳと略す）やヘパリン（以下Ｈｅｐと略す）のグルコサミニド結合を切断する酵素で、ＨＳやＨｅｐの生体内での機能あるいは生体成分中のこれら物質の分析研究試薬として有用である。 また、近年、抗血栓剤として開発が進められている低分子ヘパリン調製時の低分子化剤として、あるいは体外循環装置による治療の際問題となるＨｅｐの副作用を軽減するための素材（Ｈｅｐ除去剤）としても有用性が注目されており、診断、治療の目的に多様な用途が期待される。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】これら用途に用いうる酵素は、糖鎖に結合する硫酸基の有無、
結合位置など、糖鎖構造の違いを認識する種々の基質特異性の異なるヘパリチナーゼを取り揃えることが必要であり、また、酵素源としては安定的に大量供給出来るものが望ましい。 かかる観点から、本発明者らは上記用途を満足する酵素を微生物起源に求め、該酵素生産菌を検索し、既にフラボバクテリューム属細菌からヘパリチナーゼを三種見いだした（特開平２−５７１８３号）。

【０００４】微生物起源のヘパリチナーゼに関して精製や性質まで詳細に言及した報告としては、他にフラボバクテリューム属細菌やバチルス属細菌などから採取した酵素が知られ、例えば第１０回国際グリココンジュゲートシンポジウム要旨集〔３３０頁、１９８９年〕や特開平２−１４２４７０号公報に開示されている。 これら公知の酵素類は上記の目的のために有用であるが、更に基質特異性の異なる新規ヘパリチナーゼが上記の目的達成のために求められている。

【０００５】本発明者らはかかる理由から、更に新規ヘパリチナーゼ生産菌を広く自然界に検索した結果、埼玉県下の土壌から分離したバチルス・サーキュランス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＨｐＴ２９８菌株が新規ヘパリチナーゼを生産する能力を持つことを見いだした。 これらヘパリチナーゼを分画・精製し、理化学的性質や特異性の異なる４種の新しいヘパリチナーゼを単離した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記のような課題を解決するためになされたもので、ＨＳおよびＨｅ
ｐを分解する新規酵素、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−II、ヘパリチナーゼＴ−III 及びヘパリチナーゼＴ−IVのうちヘパリチナーゼＴ−IV（以下、本酵素と呼ぶ）に関するものであり、また本酵素の生産能を有するバチルス属の細菌から本酵素を効率よく製造する方法に関するものである。 以下に本発明を更に詳細に説明する。

【０００７】本酵素の生産に用いる微生物は、本酵素の生産能を有するバチルス属細菌であればいずれの菌株でもよいが、本発明の実施例に用いたバチルス・サーキュランスＨｐＴ２９８株は本発明者らがＨｅｐ資化性菌の検索によって埼玉県下の土壌から分離した新菌株で、その菌学的性質は次の通りである。

【０００８】（Ａ） 形態学的性質 グラム染色 ： 陰性 細胞の形状 ： 桿菌（０．４〜０．５μｍ×２．０〜
３．６μｍ） 胞子形状 ： 卵円形 胞子嚢の膨潤 ： 陽性 パラ胞子クリスタル： 陰性 運動性 ： 陽性

【０００９】 （Ｂ） 生育特性 好気的生育 ： 陽性 嫌気的生育 ： 陰性 生育温度 １５℃： 陽性 ２０℃： 陽性 ３０℃： 陽性 ４０℃： 陽性 ５０℃： 陽性 ５１℃： 陽性 ５２℃： 陰性 リゾチーム（０．００１％）存在下での生育： 陽性 ＮａＣｌ存在下での生育 ２％： 陽性 ５％： 陰性 ７％： 陰性 ｐＨ６．８（栄養培地）での生育： 陽性 ｐＨ５．７（サブローデキストロース培地）での生育： 陽性 生育ｐＨ ： ５．０〜９．０、特に６．５〜７．５が最適 ＮａＣｌ及びＫＣｌの要求性： 陰性

【００１０】（Ｃ） 生理学的性質及びその他の性質 カタラーゼ ： 陽性 Ｖ−Ｐ試験 ： 陰性 Ｖ−Ｐ培地でのｐＨ： ６．０以下 酸生成 Ｄ−グルコースから ： 陽性 Ｄ−キシロースから ： 陽性 Ｄ−マンノースから ： 陽性 Ｌ−アラビノースから： 陽性 Ｄ−マンニトールから： 陽性 ソルビトールから ： 陰性 Ｄ−グルコースからのガス生成： 陰性 インドール生成 ： 陰性 カゼインの加水分解： 陰性 デンプンの加水分解： 陽性 チロシンの分解 ： 陰性 フェニルアラニンの脱アミノ反応： 陰性 硝酸塩の還元 ： 陽性 クエン酸の資化性 ： 陽性 プロピオン酸の資化性： 陰性 ヘパリンの資化性 ： 陽性 ヘパラン硫酸の資化性： 陽性 コンドロイチン硫酸の資化性： 陽性 ケラト硫酸の資化性： 陰性 グアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量： ５３．０モル％ 主たるイソプレノイドキノン： メナキノン−７（ＭＫ
−７） 細胞壁ペプチドグリカン中のジアミノピメリン酸（ＤＡ
Ｐ） ： ｍｅｓｏ−ＤＡＰ

【００１１】上記の菌学的性質を有するＨｐＴ２９８株の分類学上の位置を、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマテック・バクテリオロジー、第１版、第２巻（１９８６年）を参照して検討すると、本菌は運動性を有する好気性グラム陰性桿菌で芽胞を形成し、主たるイソプレノイドキノンがメナキノン−７であり、細胞壁のペプチドグリカンにｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を含むことから、バチルス属に属する菌株と判定された。 更にその他の性質をバチルス属の公知種と比較すると、本菌株はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の種に属すると同定された。 しかしながら、公知のバチルス・サーキュランス菌株、例えばＩＦＯ１３６３２、ＩＦＯ１３６３５及びＩＦＯ１３
６３６は本発明の酵素を生産せず、この点で公知の菌株と区別される新菌株である。

【００１２】バチルス属のＨＳ及びＨｅｐの分解酵素生産菌は、バチルス・ＳＰ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ）Ｂ
Ｈ１００株が知られているが（特開平２−１４２４７０
号）、嫌気条件での生育、最高生育温度、Ｖ−Ｐ培地でのｐＨ、デンプンの加水分解能、ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量の項目で試験結果が異なることから明らかなように、前記ＨｐＴ２９８株はＢＨ１００株とは相違する。 なお、
前記ＨｐＴ２９８株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物国際受託番号ＢＰ−３７６５として寄託されている。

【００１３】本発明の新規なヘパリチナーゼＴ−IVは、
バチルス・サーキュランスＨｐＴ２９８株あるいはバチルス属に属する本酵素生産菌を、通常微生物の培養に用いられる栄養培地、好ましくは酵素生産能を高めるためにＨｅｐやＨＳあるいはこれらを含む物質を添加した培地で培養することにより、培地液あるいは菌体中に生産蓄積されるので、公知の方法で精製酵素を得ることができる。

【００１４】更に具体的に説明すると、バチルス属に属する本酵素生産菌を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類とＨｅｐやＨＳあるいはこれらを含む物質などを含む培地で菌を培養し、本酵素を培地中か菌体中に生産蓄積させる。 炭素源としては、資化できるものはいずれの物質も利用でき、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、澱粉及びその加水分解物、糖蜜、クエン酸塩、各種ペプトン類などが挙げられる。 窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、各種ペプトン類、各種肉エキス類、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンステープリカー、アミノ酸溶液、アンモニウム塩など有機無機の窒素化合物又はこれら含有物が利用できる。 無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。 そして更に必要に応じて菌の生育あるいは酵素生産に必要な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加することができる。

【００１５】本発明においては、本酵素の誘導物質としてＨｅｐやＨＳまたはそれらを含有する物質を添加すれば大量に本酵素を生成させることができる。 これら誘導物質の添加は培養当初からでも培養途中に行ってもよい。 添加量としてはＨｅｐやＨＳとして通常０．２％〜
２％添加すれば良い結果が得られる。

【００１６】培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、通常は液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。 本発明における培養条件は、本酵素の生産に最も有利な条件を適当に選択、
調節して行う。 培養温度は１５〜５１℃の範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいのは４０〜４５
℃である。 培養時間は培養条件によって異なるが１〜２
日程度であって、本酵素が最高蓄積量になる時期に培養を終了すればよい。 培地のｐＨは培地調製時に中性付近にあればよく、通常の場合特に調節の必要はない。

【００１７】このようにして得た培養液の上清液及び菌体抽出液の双方から前記４種の酵素を得ることができる。 培養上清液については、硫酸アンモニウムを加え、
０．６飽和として析出した沈澱物を透析した後、ハイドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、ゲルろ過剤、吸着剤を用いて酵素を分画精製する。 また、菌体内酵素については、菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波または機械的破砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、
その遠心上清液を培養上清液に用いたのと同様の手法により精製できる。 しかし、これら精製の手法により本発明は何ら制約を受けるものではない。

【００１８】本酵素の力価は、本酵素がヘキソサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウロン酸の４位と５位の炭素間に形成される二重結合が紫外吸収を持つことを利用し、その増大を測定することにより求められる。

【００１９】酵素の基質には、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、
ヘパリチナーゼＴ−II及びヘパリチナーゼＴ−III については、ウシ腎臓由来のＨＳを、ヘパリチナーゼＴ−IV
については、ブタ腸粘膜由来のＨｅｐを用いる。

【００２０】即ち、上記基質１０mg／ml水溶液２５μl
に対し、酵素液１０μl 、１００mMトリス・酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５μl、２０mM塩化カルシウム２５μl
及び水１５μl を加え、４５℃で１０分間反応させる。
この液に対し、０．０６N 塩酸溶液５００μl を加え反応を停止させ、２３２nmにおける紫外吸収Ａを測定する。 対照液として同溶液のゼロ時間における紫外吸収Ａ
₀を測定する。

【００２１】酵素力価の表示は、上記反応条件で１分間に１μmol の分解量を生じさせる力価を１単位として、
次の式から算出する。 Ａ−Ａ ₀ ／５．５（分子吸光係数を用いたモル補正）×
６００／１０（酵素希釈補正）×１／１０（１分当りの補正）＝Ｕ／ml（使用酵素１ml当りの単位)

【００２２】本発明の新規なヘパリチナーゼＴ−IV及び他のヘパリチナーゼ類の理化学的性質を示す。 （１） 作 用いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸のグリコサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断部のグルクロン酸又はイズロン酸の４位と５位の炭素の間に二重結合を形成する。

【００２３】（２） 基質特異性 （図１−図２） ヘパリチナーゼＴ−１及びヘパリチナーゼＴ−IIはＨｅ
ｐには殆ど作用せず、主としてＨＳに作用し、分解物として生ずる不飽和二糖は非硫酸化物（以下「△ＤｉＨＳ
−ＯＳ」という）及び少量のウロン酸−グルコサミン−
Ｎ−硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ＮＳ」という）である。
ヘパリチナーゼＴ−III はＨｅｐには殆ど作用せず、主としてＨＳに作用し、分解物として生ずる不飽和二糖は△ＤｉＨＳ−ＯＳ及び△ＤｉＨＳ−ＮＳである。 ヘパリチナーゼＴ−IVはＨｅｐ及びＨＳに作用し、分解物として生ずる不飽和二糖は△ＤｉＨＳ−ＮＳ、ウロン酸−グルコサミン−Ｎ，６−ジ硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉ
Ｎ，６Ｓ」という）、ウロン酸−２−硫酸−グルコサミン−Ｎ−硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉＵ，ＮＳ」という）及びウロン酸−２−硫酸−グルコサミン−Ｎ，６−
ジ硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｔｒｉＳ」という）である。

【００２４】（３） 至適ｐＨ （図３） 本酵素等の至適ｐＨを５０mMの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩衝液及びトリス・塩酸緩衝液を用い、４５℃、１０
分間の反応で調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−IIはいずれもｐＨ５．５〜６．５であり、ヘパリチナーゼＴ−III はｐＨ７．０〜８．０、
ヘパリチナーゼＴ−IVはｐＨ７．５〜８．０である。

【００２５】（４） 安定ｐＨ範囲 （図４） 本酵素等の安定ｐＨ領域を１００mMの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を用い、３７℃、３０分間処理して調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−ＩはｐＨ４．５〜
９．５、ヘパリチナーゼＴ−IIはｐＨ５．０〜９．５、
ヘパリチナーゼＴ−III はｐＨ５．０〜９．５、ヘパリチナーゼＴ−IVはｐＨ５．０〜１０．０の範囲でそれぞれ安定である。

【００２６】（５） 作用至適温度 （図５） 本酵素等の至適温度を５０mMのトリス・酢酸緩衝液ｐＨ
７．０を用い、１０分間の反応で調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−IIはいずれも５
５℃、ヘパリチナーゼＴ−III は５０℃、ヘパリチナーゼＴ−IVは４０℃である。

【００２７】（６） 安定温度範囲 （図６） 本酵素等の安定温度範囲を５０mMのトリス・酢酸緩衝液ｐＨ７．０を用い、６０分間各温度で処理して調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−II
はいずれも５０℃以下、ヘパリチナーゼＴ−III は４５
℃以下、ヘパリチナーゼＴ−IVは４０℃以下でそれぞれ安定である。

【００２８】（７） ｐＨ、温度などによる失活の条件
（図４、図６） 本酵素等を１００mMの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を用い、３７℃、３０分間処理することにより、調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−II及びヘパリチナーゼＴ−III はｐＨ４．５以下、ｐＨ１０．０以上で、ヘパリチナーゼＴ−IVはｐＨ
４．５以下、ｐＨ１０．５以上でそれぞれ急激に失活する。 また、本酵素等を５０mMのトリス・酢酸緩衝液ｐＨ
７．０を用い、６０分間各温度で処理して調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−IIはそれぞれ５５℃以上、ヘパリチナーゼＴ−III は５０℃
以上、ヘパリチナーゼＴ−IVは４５℃以上でそれぞれ急激に失活する。

【００２９】（８） 無機イオンの影響 （表１） 本酵素等の活性は各種イオンにより賦活又は阻害される。 ヘパリチナーゼＴ−ＩはＣａ ²⁺ 、Ｃｏ ²⁺ 、Ｍｇ ²⁺ 、
Ｍｎ ²⁺で賦活され、Ｚｎ ²⁺で阻害される。 ヘパリチナーゼＴ−IIはＢａ ²⁺ 、Ｃａ ²⁺ 、Ｃｏ ²⁺ 、Ｍｇ ²⁺ 、Ｍｎ ²⁺で賦活され、Ｚｎ ²⁺で阻害される。 ヘパリチナーゼＴ−II
I はＺｎ ²⁺で阻害される。 ヘパリチナーゼＴ−IVはＢａ
²⁺ 、Ｃａ ²⁺ 、Ｍｇ ²⁺で賦活され、Ｃｏ ²⁺ 、Ｚｎ ²⁺で阻害される。

【００３０】

【表１】

【００３１】これら４種のヘパリチナーゼの酵素化学的性質を公知酵素と比較検討すると、ヘパリチナーゼＴ−
Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−II及びヘパリチナーゼＴ−III
はヘパリンには殆ど作用せずヘパラン硫酸に作用し、分解物がフラボバクテリューム属細菌の公知酵素のものと異なる理由から、また、ヘパリチナーゼＴ−IVは、ヘパリン及びヘパラン硫酸に作用するがフラボバクテリューム属細菌の公知酵素とは分解物が異なること及びバチルス属細菌の酵素とは至適温度や温度安定性が異なる等の理由から、上記４種のヘパリチナーゼは公知酵素とは異なる性質を有する新規酵素と確認された。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではない。 実施例 ペプトンＡ（極東製薬製）０．７５％、酵母エキス（極東製薬製）０．５％、ヘパリンナトリウム（シンテックス製）０．５％、Ｋ ₂ ＨＰＯ ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ ₄・
７Ｈ ₂ Ｏ ０．０２％、ＮａＣｌ０．１％、消泡剤アデカノールＬＧ１０９（旭電化製）０．００５％（ｐＨ
７．０）の組成からなる生産培地２００００mlを３００
００ml容のジャーファーメンターに仕込み、１２０℃で２０分間蒸気滅菌後、予めハートインヒュージョン寒天培地（栄研化学製）で４５℃一日培養後、生産培地と同組成（但し、ヘパリンナトリウムは０．２％、消泡剤は無添加）の種培地に接種して、４５℃、２０時間振盪培養しておいたバチルス・サーキュランスＨｐＴ２９８株の培養液６００ml（３％）を無菌的に接種し、４５℃で１８時間通気（１v.vm)撹拌（３００rpm)培養を行った。 培養終了後、培養液を連続遠心分離にて処理して菌体を集め、この菌体（湿潤量１１０g ）のうち半量を３
００mlの０．１M リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中に懸濁し、超音波破砕器を用いて破砕した。 破砕後、遠心分離により不溶物を除去し、得られた上清液に硫酸アンモニウムを加え０．６飽和とした。 沈澱物を集め、２０mMトリス・酢酸緩衝液ｐＨ７．０で一夜透析し、透析液をＤ
ＥＡＥ−セファセルカラム（４．２×２５cm）に負荷し、同緩衝液で溶出させた。 その溶出液をハイドロキシアパタイトカラム（３．２×２４cm）に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を０〜０．５Mまで直線的に上昇させることにより溶出させた。 ＨｅｐおよびＨＳを基質として活性を測定したところ、通過液でヘパリチナーゼＴ−Ｉ
が、０．２M 前後でヘパリチナーゼＴ−IIが、０．４M
前後でヘパリチナーゼＴ−III 及びヘパリチナーゼＴ−
IVが溶出された。 それぞれの画分を限外ろ過膜を用いて脱塩し、次いで５０mMトリス・酢酸緩衝液に置換した。
そのうちヘパリチナーゼＴ−ＩとヘパリチナーゼＴ−II
の両画分については、それぞれをセファクリルＳ−３０
０カラム（３．８×１００cm）に負荷し、０．２M 食塩を含む５０mMトリス・酢酸緩衝液でゲルろ過を行い、それぞれの活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて濃縮脱塩し、酵素液を得た。 又、ヘパリチナーゼＴ−III 及びヘパリチナーゼＴ−IVが同時に溶出された画分については、硫酸化セルロファインカラム（３．２×２０cm）に負荷し、５０mMトリス・酢酸緩衝液中で食塩濃度０〜
０．３M まで直線的に上昇させることにより溶出させた。 ０．１M 前後でヘパリチナーゼＴ−III が、０．１
５M 前後でヘパリチナーゼＴ−IVが溶出され、それぞれの画分を限外ろ過膜を用いて濃縮脱塩し、酵素液を得た。

【００３３】各酵素の収量 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ ： １２Ｕ ヘパリチナーゼＴ−II ： ６Ｕ ヘパリチナーゼＴ−III ： ５０Ｕ ヘパリチナーゼＴ−IV ： ６Ｕ

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、ヘパリン及びヘパラン硫酸を分解する新規のヘパリチナーゼＴ−IVを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヘパリン（ブタ腸粘膜由来）及びヘパラン硫酸（ウシ腎臓由来）に対する各酵素の分解能を示す。

【図２】酵素分解物の二糖成分をそれぞれ調べた結果を示す。

【図３】至適ｐＨを示す。

【図４】安定ｐＨ範囲を示す。

【図５】作用至適温度を示す。

【図６】安定温度範囲を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:09） (72)発明者 吉田 圭一 東京都東大和市立野３丁目1253番地 生 化学工業株式会社 東京研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl. ⁷ ，ＤＢ名) C12N 9/88 C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)