[0001] 本发明属于环境微生物修复技术领域，具体涉及一株对铬具有还原和固定作用的苏云金芽胞杆菌L68在铬污染土壤修复中的应用。该菌在纯培养和土壤中可以将六价铬还原为三价铬，促进可利用态铬向难利用态铬的转化，降低铬的毒性，有效减少烟草、白菜对铬的吸收。

[0002] 随着全球经济的快速发展，重金属污染问题已成为越来越重要的环境议题之一，铬(Cr)是一种广泛存在的重金属，被应用于合金、电镀、制革等行业。环境中主要以正三价和正六价形式存在。其中，三价铬为人体所必需微量元素，而六价铬对人体具有较强的毒害作用，具有潜在的致畸、致突变和致癌性。目前我国已经有许多地方相继报道因铬污染土壤和水体导致人们健康受到危害的事例，因此对铬污染环境的治理变得日益重要。重金属可以通过抽吸烟草时的主流烟气进入人体，也可以通过食用铬含量超标的食物进入人体内，控制人体铬的吸收最好从源头抓起，即对铬污染的土壤进行修复。

[0003] 而目前常见的铬污染土壤修复技术有固定化/稳定化技术、化学还原技术、电动修复技术等。固定化/稳定化技术，指运用物理或化学的方法将土壤中的铬固定起来，或者将铬转化成化学性质不活泼的形态，阻止其在环境中迁移、扩散。化学还原技术的原理是将一些对环境的危害作用相对小、容易得到的化学还原剂将土壤中的六价铬还原为三价铬，经还原生成的三价铬以氢氧化铬或与其它物质以共沉淀的形式存在，降低铬的生物可利用性。电动修复技术是通过将电极插入受铬污染土壤，通过两个电极施加微弱电流形成电场，利用电场产生的各种电动力学效应(包括电渗析、电迁移和电泳等)驱动铬离子沿电场方向定向迁移，从而将铬富集至电极区然后进行集中处理或分离。而以上修复技术具有高投入、高消耗、难以大规模利用和容易造成二次污染等缺点。

[0004] 微生物修复技术是利用微生物自身的特性，通过吸附、固定、转化、分解和氧化还原机理来达到污染物治理的目的。由于其成本低、操作简便、不会带来二次污染等众多优点备受关注。

[0005] 本发明目的在于克服现有技术的缺陷，将一株对铬具有还原和固定作用的苏云金芽胞杆菌应用于铬污染土壤中六价铬的还原和固定，以降低铬的毒性，缓解铬污染对植物生长的抑制作用并减少植物对铬的吸收。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现：

[0007] 本发明人从本实验室分离保存的73株苏云金芽胞杆菌中筛选得到了对铬具有还原作用的菌株苏云金芽胞杆菌L68，该原始菌株分离自湖北省武汉市洪山区华中农业大学狮子山土壤中，然后将苏云金芽胞杆菌L68采用LB培养基培养后应用于铬污染盆栽烟草、白菜土壤的修复，进行相关验证。

[0008] 本发明的细菌苏云金芽胞杆菌L68在铬污染土壤中的修复方案参见图1所示的技术流程。采用加入外源铬酸钾(K2CrO4)的方法来模拟土壤中的六价铬污染，加入的铬酸钾的量为80mg/kg土，六价铬的量为21.4mg/kg。通过设置空白对照、微生物对照等两种对照组及加铬未修复组、加铬微生物修复组等4个不同处理来研究微生物的修复效果(其中烟草每盆装土15kg，每个处理10个重复，试验白菜的处理每盆装土3kg，每个处理5个重复)。铬酸钾以水溶液的形式加入土壤中，边加边搅拌土壤，使之均匀分布于土壤中。为防止铬液淋溶损失，土样装盆前在盆底部放置一个盆垫。待铬酸钾溶液全部加入土壤中后放置一天左右，使加入的铬在土壤中平衡。所述苏云金芽胞杆菌L68按1％的接种量接种于5L的LB培养基中(28℃，160r/min)摇床培养30h，离心收集菌体细胞并用生理盐水悬浮，得菌体悬液，然后将菌体悬液与水混匀后按照修复方案均匀拌入土壤中(不加菌的空白对照处理中只拌入相应的水)，盆栽土壤维持恒定水分放置3天后开始移栽烟苗(或撒入白菜种子)，各个处理留1盆作为土壤模拟实验测定六价铬含量变化。分别在烟草种植后的50天、110天(白菜种植后70天)取样测定其农艺性状及植株体内各部位铬含量，并进行显著性分析，最终确定出细菌L68对铬污染土壤具有明显的修复效果。

[0009] 申请人将筛选得到的对铬污染修复具有明显效果的菌株命名为苏云金芽胞杆菌L68，Bacillus thuringiensis L68于2015年3月2日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2015078

[0010] 苏云金芽胞杆菌L68的生物学特性：

[0011] 革兰氏染色显阳性，营养体呈杆状，两端钝圆。在LB培养基中24h开始产芽胞，在含有1mmol/L的铬酸钾的LB中27h开始产生芽胞，芽胞卵圆形，有光泽，通常在菌体一端，伴胞晶体在菌体另一端，形态不一。

[0012] 该菌株的保藏方法是：采用50％的甘油与等体积的菌株混匀保存于-80℃冰箱中。

[0013] 将L68菌株按1％的接种量接种到含有1mmol/L铬酸钾和不含铬酸钾的LB培养基中，在600nm波长下测OD值，绘制得到了菌株L68在铬浓度1mmol/L和不含铬酸钾的培养条件下的生长曲线如图2。在相差显微镜下观察看到铬对苏云金芽胞杆菌的菌体、芽胞、晶体的形态无影响，芽胞晶体的形态如图4。

[0014] 更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。附图说明

[0015] 序列表SEQ ID NO：1是苏云金芽胞杆菌L68菌株16SrRNA的核苷酸序列。

[0016] 图1：是本发明的苏云金芽胞杆菌L68应用于铬污染土壤中修复的流程图。

[0017] 图2：是本发明的苏云金芽胞杆菌L68分别在含有1mmol/L铬酸钾和不含铬酸钾的LB中的生长曲线图。

[0018] 图3：是本发明的苏云金芽胞杆菌在含有1mmol/L铬酸钾LB中的还原曲线图。

[0019] 图4：是本发明的苏云金芽胞杆菌L68在相差显微镜下的菌体形态图(10×100)；图中：Spore表示芽胞，Crystal表示其伴胞晶体。

[0020] 图5：是实施例2中六价铬污染土壤中苏云金芽胞杆菌L68还原六价铬的曲线。

[0021] 图6：是实施例3中烟草白菜土壤中铬形态分布百分比。其中图6中的A图为烟草土壤中形态铬分布百分比图；图6中的B图为白菜土壤中形态铬分布百分比图；图中F1代表水溶态铬，F2代表可交换态铬，F3代表碳酸盐结合态铬，F4代表铁锰氧化态铬，F5代表有机结合态铬，F6代表残渣态铬。

[0022] 图7：是实施例4中试验烟草种植后110天时烟草的农艺性状。其中图7中A图是烟草种植110天后的根干重；图7中的B图是烟草种植110天后的茎干重；图7中的C图是烟草种植110天后的叶干重；图7中的D图是烟草种植110天后的株高。

[0023] 图8：是实施例4中试验白菜种植后70天时白菜的生物量。其中图8中A图是白菜种植70天后的湿重；图8中B图是白菜种植70天后的干重。

[0024] 图9：是实施例5中试验烟草种植后110天时烟草不同部位铬含量。其中图9中的A图是烟草种植110天后根部铬含量；图9中的B图是烟草种植110天后茎部铬含量；图9中的C图是烟草种植110天后叶部铬含量；图9中的D图是烟草种植110天后植株中总铬含量。

[0025] 图10：是实施例5中实验白菜种植后70天时白菜叶中的铬含量。

[0026] 实施例1：苏云金芽胞杆菌L68对溶液中六价铬的还原试验

[0027] 将苏云金芽胞杆菌L68接入5mLLB液体培养基中(LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；pH 7.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min)经过夜活化后，按1/100(v/v)接种量分别转接至50mL含有1mmol/L铬酸钾和不含铬酸钾新鲜灭菌LB培养基中，28℃，160rpm摇床培养，每隔3个小时取样，在600nm波长下测菌株L68在铬浓度1mmol/L和不含铬酸钾的培养条件下的生长曲线，如图2所示；在540nm波长下测的苏云金芽胞杆菌L68在铬浓度1mmol/L培养条件下的还原曲线，如图3所示。

[0028] 实施例2：苏云金芽胞杆菌L68对土壤中六价铬的还原试验

[0029] 土壤中六价铬含量测定采用热碱消解提取法。具体方法为：将所取土样自然风干，粉碎后过60目筛，取2.5g(精确值0.01g)置于50mL三角瓶中，加入50mL 0.28M/L Na2CO3+0.5M/L NaOH的混合碱液于其中，加入0.4g MgCl2和0.5mL的0.5M K2HPO4/0.5M KH2PO4配制成的缓冲液，持续搅拌5-10min，90～95℃加热60min(加热过程中不间断振荡三角瓶)。消解完成后，用0.45μm滤纸过滤除去土样残渣并收集消解液，润洗消解容器，收集润洗液后合并至消解液中。在消解液中加入5.0M/L的硝酸，调节pH至7.5±0.5，如果调节过程中发现pH<7，则需弃去消解液重新进行消解。消解液调节好pH后过滤收集滤液，采用0.45μm滤纸过滤，如果用0.45μm滤膜过滤产生絮状沉淀堵住滤孔，则更换更大孔径滤纸过滤。过滤完成后转移滤液至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，用二苯碳酰二肼分光光度法检测其中六价铬的含量(参照中华人民共和国国家标准，标准号GB/T7467-1987，水质六价铬的测定二苯碳酰二肼分光光度法,国家环境保护局,1987-03-14，中国标准出版社，1987-07-01)，对所测数据经换算后即得土壤中六价铬含量。

[0030] 图5为铬污染土壤中苏云金芽胞杆菌L68的还原曲线。从图5中可以看出：

[0031] 在铬污染土壤施加细菌L68后，其在50d内使土壤中的六价铬的含量减少了73.3％，且最终使六价铬在土壤中的含量下降到了1.03mg/kg。

[0032] 实施例3:苏云金芽胞杆菌L68对土壤中铬的固定作用试验

[0033] 根据铬与土壤中不同组分的结合作用可将土壤中铬的存在形态分为以下六种：水溶态铬、交换态铬、碳酸盐结合态铬、铁锰氧化物结合态铬、有机结合态铬和残渣态铬。其中水溶态铬和交换态铬的稳定性较差，容易被植物体吸收和利用，铬污染的危害主要来自于这两种不 稳定形态，而后四种铬形态相对较为稳定，不容易被植物体吸收和利用。因此将土壤中水溶态铬和交换态铬转化为碳酸盐结合态铬、铁锰氧化物结合态铬、有机结合态铬和残渣态铬有助于土壤中铬的固定，降低铬的生物可利用性。

[0034] 采用改进的连续提取法(Tessier et al 1979)按一定土液比(具体按以下的操作步骤进行)，提取水溶态铬、交换态铬、碳酸盐结合态铬、铁锰氧化物结合态铬、有机结合态铬和残渣态铬。

[0035] (1)水溶态铬：称取1.0000g(精确至0.0001g)土样于10mL塑料离心管中，加10mL去离子水，室温下以200rpm持续震荡1h，然后以10000r/min离心30min，取上清液测定其中铬含量。残余土样留于原离心管中用于提取可交换态铬，测试的残渣留作后续步骤使用。

[0036] (2)可交换态铬：将上步残渣加入1mol/L MgCl2溶液8mL(pH＝7.0)，室温下以200rpm持续震荡1h，用与上述相同的方法离心，取上清液测定其中铬含量。残余土样留于原离心管中用于提取碳酸盐结合态铬。

[0037] (3)碳酸盐结合态铬：用上步残渣中加入溶液1.0mol/L NaAc溶液8mL(用HAc调节pH＝5)，25℃以200rpm的速度振荡6h，用与上述相同的方法离心，取上清液测定其中铬含量。残余土样留于原离心管中用于提取铁锰氧化物结合态铬。

[0038] (4)铁锰氧化物结合态铬：用上步残渣加入0.04mol/L NH2OH·HCl的HAc(25％，V/V)溶液8mL，在96±3℃的恒温水浴箱中保持6h(期间间隔震荡)，用上述相同的方法离心，取上清液测定其中铬含量。残余土样留于原离心管中用于提取有机结合态铬。

[0039] (5)有机结合态铬：用上步残渣中加入0.02mol/L HNO33mL，再加入30％的H2O25mL(HNO3调节pH＝2)，在85±2℃的恒温箱中保持2h(期间每隔10min搅动一次)；然后再加入30％H2O23mL，继续在85±2℃的恒温箱中保持3h(期间每隔10min搅动一次)；取出冷却到室温后，加入3.2mol/L NH4Ac HNO3(20％，V/V)溶液5mL，25℃连续震荡0.5h，用前述的方法离心，取上清液测定其中铬含量。残余土样留于原离心管中用于提取残渣态铬。

[0040] (6)残渣态铬：用HCI-HNO3-HF-HClO4进行消解后测定其中铬含量(HJ 491－2009)。

[0041] 以上各种形态铬的含量的测试均采用“火焰原子吸收分光光度计”(北京普析通用仪器有限责任公司)进行测定，实验数据采用SPSS 17.0软件(http://www.ddooo.com/softdown/53379.htm)分析，其中方差分析采用One-Way，ANOVA，Duncan检测法进行各处理间数据的比较分析，显著性水平为p<0.05。图6中A、B分别表示为烟草、白菜土壤中铬形态分布百分比图，从图中可以看出，当土壤中添加苏云金芽胞杆菌L68L68后，有效的促进了铬由水溶态、可交换态向碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机 结合态铬、残渣态转化。

[0042] 实施例4：苏云金芽胞杆菌L68对植物铬毒害的缓解作用试验

[0043] 将本发明中盆栽烟草于第50天、110天采收前测定其株高，采收后将其根部的泥土去净，经杀青，即110℃、30min，70℃烘干至恒重，分别收集根部、茎部和叶部测量其干重；白菜于种植后70天测其鲜重，按照化学分析常规样品分析的方法烘干称其干重。对实验数据采用SPSS 17.0软件进行分析，其中方差分析采用One-Way，ANOVA，Duncan检测法进行各处理间数据的比较分析，显著性水平为p<0.05，显著性差异采用不同的小写英文字母进行标示。

[0044] 实验结果表明，在本发明中，铬污染土壤中施加苏云金芽胞杆菌L68能有效缓解铬对烟草、白菜生长的抑制作用。

[0045] 实施例5：苏云金芽胞杆菌L68对植物铬吸收的抑制作用实验

[0046] 利用实施例3中所述的方法将烟草杀青、烘干后分别收集根部、茎部和叶部，白菜收集根部叶部。经粉碎机粉碎后过100目筛。精确称取烟草(白菜)各部位粉末样品2.0000g(精确至0.0001g)于镍坩埚中，置于电炉上小火炭化至无烟后，放置在马弗炉中
550℃干灰化6h，干灰化完成后取出坩埚冷却至室温，将干灰化后的粉末样品转移至消解管中，加入10mlHNO3-HClO4(体积比4:1)混合酸，电炉上小火加热处理至近干，不使干涸(注：
若灰化不彻底，则加热至近干后，再加入适量HNO3-HClO4(体积比4:1)混合液反复处理至无碳颗粒)，冷却，加入5ml盐酸洗涤消解管数次，洗涤液并入容量瓶中，定容至刻度线，摇匀，待测，同时做试剂空白对照。

[0047] 对测得的数据采用SPSS 17.0软件进行分析，其中方差分析采用One-Way，ANOVA，Duncan检测法进行各处理间数据的比较分析，显著性水平为p<0.05，显著性差异采用不同的小写英文字母进行标示。

[0048] 图9为烟草根部、茎部、叶部中铬含量及烟草体内铬总量，图10为白菜叶片中铬含量，由图9、图10可以看出：在本发明中，铬污染土壤中施加苏云金芽胞杆菌L68,能明显抑制烟草、白菜对铬的吸收，分析可能是苏云金芽胞杆菌L68对土壤中的起铬固定作用，降低了铬的生物可利用性，从而减少了植物对铬的吸收。

[0049] 主要参考文献

[0050] 1.黄顺红.铬渣堆场铬污染特征及其铬污染土壤微生物修复研究.[博士学位论文].长沙:中 南大学图书馆，http://d.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1538763.aspx，2009；

[0051] 2.苏长青.铬污染土壤中Cr(VI)的微生物还原及Cr(III)的稳定性研究.[硕士学位论文].长沙:中南大学图书馆，http://d.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1718920.aspx，2010；

[0052] 3.B R James,Remediation by reduction strategies for chromate contaminated soils.Environ Geochem.Health,2001,23:175–179

[0053] 4.Jinxia Yang,Minyan He,Gejiao Wang Removal of toxic chromate using free and immobilized Cr(VI)-reducing bacterial cells of Intrasporangium sp.Q5-1.World J Microbiol Biotechnol,2009,25:1579-1587。