[0001] 本发明属于生物防治技术领域，本发明涉及对鞘翅目害虫高毒力的cry8G基因的核苷酸序列，涉及对鞘翅目害虫高毒力的蛋白质的氨基酸序列，涉及，人工设计合成的可以在植物中表达的cry8G基因的核苷酸序列，涉及该人工设计的cr8G基因的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列，涉及含有cry8G基因的重组菌株，涉及使用该基因构建表达载体，还涉及利用上述基因序列进行植物转化的方法。

[0002] 金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeidae)，其幼虫(俗称蛴螬，本发明以下也简称为“蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫，可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中的危害居首位，其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主，占总地下害虫量的70-80％以上。据统计每年全国蛴螬发生面积约1亿亩，严重年份曾达3亿2千万亩，产量损失高达20％以上，有些地块甚至绝产。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区，主要危害粮食、油料等作物；其它地区的危害情况也很严重，如危害甘蔗的蛴螬，在广东、广西、云南、四川、福建等地普遍发生；在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区，蛴螬的发生也很严重(魏鸿钧等，《中国地下害虫》，上海：上海科学技术出版社，1989，1-41；王永祥等，“冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”，《河北师范大学学报》(自然科学版)，1998，22(2)：268-270)。以在我国油料作物中种植面积仅次于油菜居第二位的花生为例。我国的花生产量占世界花生总产量的35％左右，居世界首位，年出口收入达207亿美元，2001年全国花生面积(500万公顷)和总产(1450万吨)均达到历史最高水平。但蛴螬对花生的危害十分严重。为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学、物理等综合防治策略，这虽有一定成效，却难以达到持续控制的效果。因此，寻找新的有效防治方法，已成为当务之急。

[0003] 在获得对蛴螬高毒力Bt基因的基础上，培育杀蛴螬的转基因植物是一条值得探索的新的防治途径。

[0004] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅 目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.And MolecularBiology Review，1998，62：3775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。

[0005] 目前人们已经克隆了近400种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属157种模式基因。近年国际上cry8类基因的研究动向引人瞩目。研究表明，这类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba，M.et al.，A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a highlarvicidal activity specific for scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，1992.14：54-57)，1994年Sato等从中克隆出一种新的杀虫基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein genefrom Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeidinsects，Curr.Microbiol.1994.28：15-19.4)。目前已发现11种cry8类基因，编码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。详细的信息见表1(Asano，S.，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein having insecticidal activity，DNA encoding theprotein，and controlling agent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A and JP 2002045186-A/2))。其中美国Mycogen公司分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性(Tracy E.Michaels，et al.，Bacillusthuringiensis toxins active against scarab pests，
1994，USP5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对西方玉米根叶甲(Western cornrootworm)具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，Andre，R.，DuckNicholas，B.，Feng，Xiang，Flannagan Ronald，D.，Kahn，Theodore，W.，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against coleopterans，2002，WO 02/34774A2)。在我国，河北省农业科学院植物保护研究所和河北农业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达
100％(冯书亮等，“一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株”，《中国生物防治》，2000，16(2)：74-78)。

[0006] 表1苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白

[0007]

[0008] 本发明提供一种对大黑鳃金龟等鞘翅目重要害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌cry8G模式基因序列，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

[0009] 苏云金芽孢杆菌菌株HBF-18，其保藏号为CGMCC2070。

[0010] 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ga1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

[0011] 一种工程菌菌株BioT8G，其特征在于含有cry8Ga1基因。

[0012] 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ga1蛋白，由上述cry8Ga1基因所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

[0013] cry8Ga1蛋白在制备杀害鞘翅目害虫药剂中的应用。

[0014] 一种蛋白，具有上述蛋白相同的功能，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示. [0015] 一种人工改造合成的mcry8Ga1基因，其编码上述的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

[0016] 一种植物表达载体pBSmGN，其特征是该植物表达载体由mcry8Ga1基因序列、组成型表达启动子或根特异性启动子、终止子和一种能在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体所构建。

[0017] mcry8Ga1基因在植物抗鞘翅目害虫中的应用。

[0018] 所述应用为将含有mcry8Ga1基因的植物表达载体pBSmGN转化植物或微生物，使之产生抗鞘翅目害虫的毒性。

[0019] 所述植物是烟草。

[0020] 所述应用为将mcry8Ga1基因表达的蛋白制备成药剂，用于杀灭鞘翅目害虫。 [0021] 本发明从河北土壤分离得到菌株HBF-18，其保藏编号为CGMCC2070，其生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时产生有毒杀作用的伴胞晶体。

[0022] 根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物：

[0023] SN5un85`-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3`

[0024] SN3un85`-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3`

[0025] PCR扩增鉴定HBF-18菌株，扩增结果(见附图1)，其显示条带与已知cry8类基因(见表3)均不同，表明菌株HBF-18中可能含有新的cry8杀虫基因。

[0026] 设计一对全长基因引物cry8G5/cry8G3用来扩增全长基因。并且引入BamHI/SalI用于克隆与表达，引物对cry8G5/cry8G3的序列如下：

[0027] BamHI

[0028] cry8G5：5′-CGCGGATCCGAAATGAGTCCGAATAATCA-3′

[0029] SalI

[0030] cry8G3：5′-ACGCGTCGACCTCTTCTTCTAACACGAGT-3′

[0031] 以菌株HBF-18的总DNA为模板，用pfuDNA聚合酶，进行PCR扩增，结果(见附图2)显示扩增出一3.5Kb的条带，与载体pET21b连接转化大肠杆菌JM110，得到重组质粒pSAS018(附图2)。对插入片断进行测序分析，得到序列SEQ ID NO 1为pSAS018中BamHI/SalI双酶切片段，序列全长3472bps，分析表明其含有开放阅读框，ORF1的位置是1-3472，GC含量为38.％，编码1157个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性，表4为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ga1。

[0032] 引物cry8G5/cry8G3分别引入BamHI和SalI位点，以菌株HBF-18质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSTK中得到重组质粒pSK018(见附图3)，转化大-肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73 中(该突变株来源于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可以向公众提供，见李海涛等，农业生物技术学报
2005Vol.13No.6P.787-791)，得到工程菌BioT8G。

[0033] 将上述工程菌BioT8G于30℃于牛肉膏培养基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌)中培养，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳分析(方法参见Sambrook，J.et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)，结果(见附图4)。结果表明工程菌Biot8G中的cry8Ga1基因获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。 [0034] Cry8Ga1蛋白的活性测定表明，表达的Cry8Ga1具有杀华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫的活性。

[0035] 根据微生物和植物对密码子偏好的不同，对cry8Ga1基因的1-2040bp的序列进行了优化。本发明按照cry8Ga1基因的人工改造序列进行了全基因合成，新基因见SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，对应蛋白序列见SEQ ID NO 4。cry8Ga1基因与mcry8Ga1(modified cry8Ca1)基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca1的37.6％提高为45.2％。调整了Cry8Ga1蛋白的氨基酸密码子使用频率，使mCry8Ga1蛋白的氨基酸密码子使用频率与植物中的使用频率接近，将cry8Ca基因的人工改造序列两端引入BamHI和KpnI、SacI位点(见SEQ ID NO 3)，连至pUC57载体(该载体为常用载体，GenBank登录号为Y14837)，重组质粒命名为pUC57-mcry8G。

[0036] 在人工合成改造的Bt cry8G基因时，用BamHI和SacI酶切质粒pUC57-mcry8G回收2.0kb片段，用同样的内切酶酶切质粒pBI121(该载体为常用载体，GenBank登录号为AF485783。见Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11：287-293)，回收12kb片段，将两个片段连接， 转化JM110，得到阳性转化子，把此新构建质粒命名为pBSmGN。该质粒含有组成型表达启动子CaMV35S(即一段DNA序列，可以驱动所连接的基因片段进行转录，进而翻译成蛋白质，组成型表达的启动子可以调控基因在生长发育的任何阶段和任何组织都有表达)、mcry8Ga1基因和NOS终止子(一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)。质粒构建图见附图5，该质粒可以转化植物，获得转基因植物。

[0037] 将人工合成改造的基因mcry8Ga1农杆菌转化，制备得到阳性克隆，再转化烟草，转基因烟草的生物活性检测表明，转基因植株表现出了良好的抗暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)性能。

[0038] 烟草是植物基因工程中验证基因功能常用的模式植物，转基因烟草的抗暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)性能是因为在植物体中有启动子启动人工改造的mcry8Ga1基因的转录，表达了Cry8G蛋白，双元载体中的表达盒——组成型启动子、人工改造的mcry8Ga1和终止子只有整合到烟草的基因组中才能表达外源基因，所以可以用此双元载体转化任何已建立农杆菌转化方法的植物，获得的转基因植物都具有抗暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)性能。

[0039] 生物保藏信息：

[0040] 微生物名称(属、种的学名)：苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis [0041] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0042] 保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号

[0043] 附图说明

[0044] 保藏日期：2007年6月1日

[0045] 保藏编号：CGMCC No.2070

[0046] 图1：菌株HBF-18的PCR-RFLP图谱。其中：

[0047] M.DNA分子量标准

[0048] 1.PCR产物酶切

[0049] 图2：重组质粒pSAS018酶切图谱。其中：

[0050] M.DNA分子量标准

[0051] 1.PCR产物BamHI/SalI酶切

[0052] 2.载体pET21bBamHI/SalI酶切

[0053] 3.重组质粒pSAS018BamHI/SalI酶切图谱

[0054] 图3：重组质粒pSK018酶切图谱。其中：

[0055] M.DNA分子量标准

[0056] 1.载体pSTK BamHI/SalI酶切

[0057] 2.PCR产物BamHI/SalI酶切

[0058] 3.重组质粒pSK018BamHI/SalI酶切图谱

[0059] 图4：cry8Ga1基因在Bt无晶体突变株中的表达。其中：

[0060] M.蛋白质分子量标准

[0061] 1.HBF-18

[0062] 2.Biot8G

[0063] 3.HD-73-

[0064] 图5：pBSmGN质粒构建图

[0065] 图6：转化烟草的分子检测，其中：

[0066] M.蛋白质分子量标准

[0067] 1、2.为部分阳性转基因植株检测结果

[0068] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0069] 实施例1

[0070] 1.1菌株185中cry基因鉴定

[0071] 根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物

[0072] SN5un85`-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3`

[0073] SN3un85`-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3`

[0074] 表2是这些基因与引物的同源序列，表3是用这对引物预测的cry8基因扩增产物酶切片段大小，通过这种PCR-RFLP方法可以分别鉴定出将这些基因。

[0075] 表2引物与cry8各基因的保守区配对情况及配对区在基因上的位置

[0076]

[0077] 表3cry8的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性

[0078]

[0079] 用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185：

[0080] 10×PCR buffer 5μL

[0081] MgCl2(20mM) 6μL

[0082] dNTP(10mM) 1μL

[0083] 引物对(10mM) 1μL/个

[0084] 模板 1uL

[0085] Taq聚合酶(5U/μL) 0.5μL

[0086] 超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

[0087] 扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。

[0088] 对PCR产物利用KpnI和DraI酶切分析，结果(附图1)显示条带是1260bp，570bp，320bp，与已知cry8类基因的图谱(表3)不同，表明菌株HBF-18中可能含有新的cry8杀虫基因.

[0089] 1.2菌株HBF-18中cry8G基因的克隆

[0090] 设计了一对全长基因引物cry8G5/cry8G3用来扩增全长基因。并且引入BamHI/SalI用于克隆与表达，引物对cry8G5/cry8G3的序列如下：

[0091] BamHI

[0092] cry8G5：5′-CGCGGATCCGAAATGAGTCCGAATAATCA-3′

[0093] SalI

[0094] cry8G3：5′-ACGCGTCGACCTCTTCTTCTAACACGAGT-3′

[0095] 以菌株HBF-18的总DNA为模板，用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。。 [0096]10×PCR buffer 5μL
dNTP(10mM) 1μL
引物对(10mM) 1μL/个
模板 1uL
pfuDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL

[0097] 超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

[0098] 扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。结果(见附图2)显示扩增出3.5Kb的条带，与载体pET21b连接转化大肠杆菌JM110，得到阳性转化子pSAS018。对插入片断进行测序分析，得到序列SEQ ID NO
1为pSAS018中BamHI/SalI双酶切片段，序列全长3472bps，分析表明其含有开放阅读框，ORF1的位置是1-3472，GC含量为38.％，编码1157个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性，表4为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ga1。

[0099] 表4Cry8Ga1与Cry8蛋白同源比较数据

[0100]

[0101] 本发明进一步分析了Cry8Ga1蛋白的氨基酸组成(见表6)，得知其分子量为131.56kDa，等电点为pH4.735(见表5)，分析了蛋白的生化指标(见表5)

[0102] 表5Cry8Ga1蛋白的生化特性

[0103]

[0104] 表6Cry8Ga1蛋白的氨基酸组成

[0105]

[0106]

[0107] 1.3cry8G基因的表达

[0108] 引物cry8G5/cry8G3分别引入BamHI和SalI位点，以含全长cry8Ga1的菌株HBF-18质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入Bt表达载体pSTK(见附图3)中，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中，得到工程菌BioT8G。 [0109] 分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基中培养30小时，取500μL菌液至Eppendorf管中，超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic，230V，T间隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5NNaOH，25℃作用5分钟；加入65μL3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μL β-巯基乙醇)，100℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果。结果(附图4)表明，工程菌Biot8G中的cry8Ga1基因均获得了表达，表达物的分子量为130kDa左右。

[0110] 1.4Cry8G蛋白的活性测定

[0111] 将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下，2倍梯度浓度稀释，将40ml菌悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在18％-20％。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲养，14天检查死虫数，计算LC50。结果(见表8)表明工程菌株对华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)具有极高的毒杀活性。
其表达的Cry8G蛋白具有杀华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟虫的活性。

[0112] 表7Bt工程菌和HBF-18菌株对华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)幼虫杀虫活性测定

[0113]8 8

[0114] 注：在结果的浓度单位中，×10/g土和×10/ml的换算，每200g土中加入36ml菌悬液。

[0115] 实施例2

[0116] 2.1人工设计合成的可以在植物中表达的cry8G基因的核苷酸序列

[0117] 根据微生物和植物对密码子偏好的不同，对cry8Ga1基因的1-2040bp的序列进行了优化。本发明按照cry8Ga1基因的人工改造序列进行了全基因合成，新基因见SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。cry8Ga1基因与mcry8Ga1(modified cry8Ca1)基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca1的37.6％提高为45.2％(表8)。调整了Cry8Ga1蛋白的氨基酸密码子使用频率，使mCry8Ga1蛋白的氨基酸密码子使用频率与植物中的使用频率接近(表9)。将cry8Ca基因的人工改造序列两端引入BamHI和KpnI位点，连至pUC57载体，重组质粒命名为pUC57-mcry8G。

[0118] 表8cry8Ga1基因与mcry8Ga1G+C含量比较与聚腺苷酸化的信号序列情况 [0119]

[0120] 表9植物、Cry8a1及mCry8Ga1中蛋白的氨基酸密码子使用频率

[0121]

[0122]

[0123]

[0124] 2.2植物表达载体的构建

[0125] 用BamHI和SacI酶切质粒pUC57-mcry8G(中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存)回收2.0kb片段，用同样的内切酶酶切质粒pBI121(该载体为常用载体，GenBank登录号为AF485783。见Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11：287-293)，回收12kb片段，将两个片段连接，转化JM110，得到阳性转化子，把此新构建质粒命名为pBSmGN。该质粒含有组成型表达的启动子CaMV35S(即一段DNA序列，可以驱动所连接的基因片段进行转录，进而翻译成蛋白质，组成型表达的启动子可以调控基因在生长发育的任何阶段和任何组织都有表达)、mcry8Ga基因和NOS终止子(一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)。质粒构建图见附图5，该质粒可以在植物中表达外源基因。

[0126] 2.3农杆菌转化

[0127] 取一管200μl农杆菌LBA4404的感受态细胞，加入1μg pBSmGN质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃恢复培养5分钟，加入1ml YEB液体培养基，28℃慢速振荡(＜100rpm)4小时，1,000rpm离心30秒种，弃上清，加入100μl YEB液体培养基重悬细胞，涂布于含有卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的YEB培养基的平板上，28℃培养48小时。将YEB抗性培养基平板上的克隆，摇菌，提取质粒，应用PCR方法检测阳性克隆。

[0128] 2.4烟草转化

[0129] 将含有pBSmGN质粒的农杆菌克隆接种于含有卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，1/50接种于MS盐
2
(pH7.0)中；将烟草无菌苗切成0.4×0.6cm 的小块，将烟草叶片浸入MS盐中，农杆菌侵染
10分钟；取出烟草叶片，用灭菌滤纸吸干菌液，放置到铺有一层滤纸的MS培养基中，28℃暗培养3天，3天后将烟草叶片转移至MS筛选分化培养基(MS培养基+100μg/ml卡那霉素+500μg/ml羧苄霉素+3mg/ml 6-BA+0.2mg/ml NAA)，28℃，光/暗＝16小时/8小时，2周后，在叶片边缘有绿色愈伤点出现，1周后，愈伤点分化成小植株，将小植株切下移至生根培养基(MS培养基+100μg/ml卡那霉素+500μg/ml羧苄霉素)生根，根部发育健壮后，移至花盆在土中继续生长(普通土∶营养土∶蛭石＝2∶1∶1)。

[0130] 2.5转化烟草的分子检测

[0131] 提取转化烟草的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下： [0132] 8GF1：5′-TTCAGTTGTCCACTCCGCCTA

[0133] 8GR1：5′-GCCATTCACAGCCTTCTTTGC

[0134] PCR扩增的反应条件为：94℃，5分钟，1个循环；94℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环。把产物电泳。如图6所示，阳性转化株扩增出大小为640bp的片段。 [0135] 2.6转基因烟草的生物活性检测

[0136] 从 田 间 采 集 华 北 大 黑 鳃 金 龟(Holotrichia oblita)、暗 黑 鳃 金 龟(Holotrichiaparallela)2种在我国北方危害比较严重的金龟子成虫群体，带回室内，分别放入40×40×50cm的饲养盒中，盒底放5-8cm厚的潮湿过筛细土，饲喂新鲜榆树叶片，26-28℃饲养。待其产卵后，将卵挑出，放在潮湿土中使孵化。将刚孵化的幼虫挑出，每个小饲养盒(Φ8cm，H5cm)放幼虫5头，饲喂土豆块和新鲜的玉米嫩根，待幼虫长到一定龄期后供生测用。

[0137] 采用群体种植和群体接虫的方法，进行生物测定。在大田土中采用分别种植及混合种植转基因植株和未转化植株的种植方法，每个处理12株。

[0138] 按照建立的危害程度分级标准，华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)幼虫对供试转基因植物的危害程度、危害指数统计如下，见表10。

[0139] 表10.转基因植株与非转基因株的危害统计。

[0140]

[0141] 从表10统计结果看，转pBSmGN植株的危害率为62.5％，危害指数为22.9；非转基因植株危害率100％，危害指数为72.9。转pBSmGN植株表现出了良好的抗华北大黑鳃金龟(Holo trichia oblita)的特性。

[0142] 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)幼虫对供试转基因植物的危害程度统计如下。转pBSmGN植株危害率为50％，危害指数为12.5，低于非转基因植株危害率为100％，未转化植株危害指数75.0相当。可见转pBSmGN植株表现出了良好的抗暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)。

[0143] 根据以上信息，利用可以在根部特异转录基因的启动子，可以使该基因在植物根部得到表达，从而只在植物根部获得对目标害虫暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)的抗性。

[0144] 附录：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列

[0145] SEQ ID NO 1(cry8Ga1基因的核苷酸序列)

[0146]

[0147] 1 TCCGA ATAATCAGAA CGAATATGAA ATTATAGATG CGTCATCACC TACTTCTGTA [0148] 61 TCTAATAACT CAGTGAAATA CCCTTTAGCA AGTGATCAAA CGACCACATT ACAAAATATG [0149] 121 AACTATAAAG ATTATCTGAG AATGTCTGAG GGAGAGAATC CTGAATTATT TGGAAATCCA [0150] 181 GAGACGTTTA TTAGTGCGCA GGATGCGGTT GGAACTGGGA TTGATATTGT GAGTAAACTA [0151] 241 CTAGGTAGTT TAGGGGTTCC ACTTGTTGGG CAAGCCGCAA CGGCACTTAA ATGGATTATA [0152] 301 GGTAAATTGT GGCCTTCTTC AGGAAACCCG TGGGATGATT TGATGACGGC AGTAGAAGAA [0153] 361 CTCATAAATC AAAAAATAGA AGCATATGCA AGAAGTAAGG CACTTGCTGA ATTGGGTGTT [0154] 421 TCGGGAAGAG CTGTAAAATC CTATCAAACC GCACTTGAAG AGTGGCAAAA AAACCCGAAT [0155] 481 AACGCGCGAA GCGCAGCACT TGTAAGGGAA AGATTTTCAG ATGCAGAACA TACATTGCGT [0156] 541 ACTCAAATGA GTTTATTTAC CGTTCGTGGT TATGAAATTC CGCTTTTAGC AACATATGCA [0157] 601 CAAGCTGCCA ATTTGCATTT GTTTGTAATG AAGGATATTC AAATTTACGG GAGAGAATGG [0158] 661 GGATATACTC AGGGAGATAT TAACCTTTTC TATCGAGAAC AAGTAGAATT TACAGGGGAA [0159] 721 TACTCTGATT ATTGTGTTAA GTGGTACAAT GCTGGCTTAG ATAAATTAAG AGGCTCGACT [0160] 781 GCTCTACAAT GGATTAACTA TAATCGTTTC CGCAGAGAAA TGACAGTGAT GGCACTGGAT [0161] 841 ATAGTTGCAT TATTCCCAAA TTATGACATA CGCATGTATC CAATGAAAAC AACCGCAGAA [0162] 901 TTAACGCGAA GAATTTATAC AGATCCGCTT GGTTATACGG GAAGTGGGTC TAACACGCCA [0163] 961 CCATGGTATA ATTATGGATA TTCTTTCTCA TGGATAGAAA ATAATGCCGT GCCAGCACCT [0164] 1021 GGATTGTTCC AGTGGTTACA AGGAATTGGG ATTTATACTA AATTTGCTCG TATAACTCCA [0165] 1081 TTTTATGCGA ACTATTGGTC AGGACATACT GTATTTTATA AATTTACTAA CGATTCTACT [0166] 1141 GAGAGACGTG TTCAGTATGG AGATACAGAT ACTCCAGAAT TAGATAGTTC TTCCTTTGAA [0167] 1201 AATGTTGACA TTTATAAGGT TTCAGCATCA GTTGGTTCGT ACAAAAGTAA TACCGTACTA [0168] 1261 TTACCAACTT TTAAAGCTAC TTTTGAGGGG GTAAATCAAA ATAATCAGTT AAAGACCTTT [0169] 1321 AGGTATCAAA AAGAATCTAA TGTCCCAAGT CAAACGAAAA ACTCAACCAC AGAGCTGCCT [0170] 1381 GTTCAGTTAT CAACTCCGCC TACTTACGGA GATTCTGAAC AGTACAGTCA TAGACTAGCC [0171] 1441 TATGTTTTTG ATGCCCCAAT CGATTCATAT ACAGGCATAT ATCGCATGTA TGGATTTGCC [0172] 1501 CCTATTCTTG GTTGGACACA TATTAGTGTA AGTCGTGACA ATAGGATTGA TCCAGATAAA [0173] 1561 ATTACTCAAA TTCCAGCTGT AAAGGCATAT GCTGAGGGTC TTGCTAATTA TATCAAAGAT [0174] 1621 CCGGGGTTTA CAGGAGGAGA TTTATTAGCT TTAGGTAGAA ACTCAAATAC TTCATTGATT [0175] 1681 GTCAATTTTT CGAAGCCTCA AACATACCGT ATTCGTATTC GTTATGCTGC TAGTAAAACT [0176] 1741 TCGTATTTTC AACTACGTGG GCTGCATAAT ATAGCTCAGT CTCAGCGTTT CGAAGCGACG [0177] 1801 TATTCTAATA AAAATGAAAA CGATTTGACA TTTAACGATT TTAAATATGT AGAAATTCAA [0178] 1861 AAAACTGTTT CAATAGACAA TCCATCAGAA AGTCGTAGTA TAAGTATATA CACTCAATCA [0179] 1921 GATACAGAAT ACTTATTATG GACAAATCGA ATTCATCCCA GTAGATGCAA CATTTGGAGC [0180] 1981 GGAACAAGAC CTAGATGTGG CAAAGAAAGC GGTGAATGGC TTGTGTACCA ATACAAAAGA [0181] 2041 TGCCTTACAG ACAAGTGTAA CGGATTATCA AGTCAATCAA GCGGCAAACT TAGTAGAATG [0182] 2101 CCTATCGATG AGTTATACCC AAATGAAAAA CGCATGTTAT GGGATGCAGT GAAAGAGGCG [0183] 2161 AAACGACTTG TTCAGGCACG TAACTTACTC CAAGATACAG GCTTTAATGT AATAAATGGA [0184] 2221 GAAAACGGAT GGACGGGAAG TACGGGAATT GAGGTTGTGG AAGGGGATGT TCTGTTTAAA [0185] 2281 GATCGTTCGC TTCGTTTGCC AAGTGCGAGA GAGATTGATA CAGAAACATA TCCAACGTAT [0186] 2341 CTCTATCAAC AAATAGATGA ATCGCTTTTA AAACCATATA CAAGATATAG ACTAAGAGGT [0187] 2401 TTTATAGGAA GTAGTCAAGA TTTAGAGATT AAATTAATAC GTCATCGGGC AAATCAAATT [0188] 2461 GTCAAAAATG TACCGGATAA CCTCTTGCCA GATGTACGCC CTGTCAATTC TTGTGGTGGA [0189] 2521 GTCGATCGCT GCAGTGAACA ACAGTATGTA GACGCGAATT TAGCACTCGA AAACAATGGA [0190] 2581 GAAAATAGAA ATATGTCTTC TGATTCCCAT GCATTTTCTT TCCATATGGA TACAGGTGAA [0191] 2641 ATAGATTTAA ATGAAAATAC AGGTATTTGG GTCGTATTTA AAATTCCGAC AACAAATGGA [0192] 2701 TACGCAACAT TAGGAAACCT TGAATTGGTA GAAGAGGGGC CATTATCAGG AGACGCACTA [0193] 2761 GAACGCTTGC AAAGAGAAGA ACAGCAGTGG AAGCTTCAAA GAACCAAAAG ACGTGAAGAG [0194] 2821 ACGGATAGAA AATATATGGC AGCAAAACAA GCCATTGATC GTTTATTCGC AGATTATCAA [0195] 2881 GACCAACAAC TCAATTCTGG TGTAGAAATG TCAGATTTGC TTGCAGCTCA AAACCTTGTA [0196] 2941 CAGTCCATTC CTTATGTGTA TAACGAAATG TTCCCAGAAA TCCCTGGAAT GAACTATACA [0197] 3001 AATTTCACAG AGTTAACAAA CAGACTCCAA CAAGCATGGA ATTTGTATGA TCTTCGAAAT [0198] 3061 GCTATACCAA ATGGAGATTT TCGAAATGGA TTAAGTGATT GGAATGCAAC ATCAGATATA [0199] 3121 AATGTGCAAC AACTAAACGA TACATCTGTC CTTGTCATTC CAAACTGGAA TTCTCAAGTG [0200] 3181 TCACAACAAT TTACAGTTCA ACCGAATTAT AGATATGTAT TACGTGTCAC AGCGAGAAAA [0201] 3241 GAGGGAGCAG GAGACGGATA TGTGATCATC CGTGATGGTA CAAATCAGAC AGAAACACTC [0202] 3301 GCATTTAATA CATGTGATAA TGATGCAGGT GTTTTATCTA CTAATCAAGC TAGCTATATC [0203] 3361 ACAAAAACAG TGGAATTCAC GCCATCTACA GAGCAAGTTT GGATTGACAT GAGTGAGACC [0204] 3421 GAAGGTGTAT TCAACATAGA AAGTGTAGAA CTCGTGTTAG AAGAAGAGTA AG [0205] [0206] SEQ ID N02(Cry8Ga1蛋白的氨基酸序列)：

[0207] 1 MSPNNQNEYE IIDASSPTSV SNNSVKYPLA SDQTTTLQNM NYKDYLRMSE GENPELFGNP [0208] 61 ETFISAQDAV GTGIDIVSKL LGSLGVPLVG QAATALKWI I GKLWPSSGNP WDDLMTAVEE [0209] 121 LINQKIEAYA RSKALAELGV SGRAVKSYQT ALEEWQKNPN NARSAALVRE RFSDAEHTLR [0210] 181 TQMSLFTVRG YEIPLLATYA QAANLHLFVM KDIQIYGREW GYTQGDINLF YREQVEFTGE [0211] 241 YSDYCVKWYN AGLDKLRGST ALQWINYNRF RREMTVMALD IVALFPNYDI RMYPMKTTAE [0212] 301 LTRRIYTDPL GYTGSGSNTP PWYNYGYSFS WIENNAVPAP GLFQWLQGIG IYTKFARITP [0213] 361 FYANYWSGHT VFYKFTNDST ERRVQYGDTD TPELDSSSFE NVDIYKVSAS VGSYKSNTVL [0214] 421 LPTFKATFEG VNQNNQLKTF RYQKESNVPS QTKNSTTELP VQLSTPPTYG DSEQYSHRLA [0215] 481 YVFDAPIDSY TGIYRMYGFA PILGWTHISV SRDNRIDPDK ITQIPAVKAY AEGLANYIKD [0216] 541 PGFTGGDLLA LGRNSNTSLI VNFSKPQTYR IRIRYAASKT SYFQLRGLHN IAQSQRFEAT [0217] 601 YSNKNENDLT FNDFKYVEIQ KTVSIDNPSE SRSISIYTQS DTEYLLWTNR IHPSRCNIWS [0218] 661 GTRPRCGKES GEWLVYQYKR CLTDKCNGLS SQSSGKLSRM PIDELYPNEK RMLWDAVKEA [0219] 721 KRLVQARNLL QDTGFNVING ENGWTGSTGI EVVEGDVLFK DRSLRLPSAR EIDTETYPTY [0220] 781 LYQQIDESLL KPYTRYRLRG FIGSSQDLEI KLIRHRANQI VKNVPDNLLP DVRPVNSCGG [0221] 841 VDRCSEQQYV DANLALENNG ENRNMSSDSH AFSFHMDTGE IDLNENTGIW VVFKIPTTNG [0222] 901 YATLGNLELV EEGPLSGDAL ERLQREEQQW KLQRTKRREE TDRKYMAAKQ AIDRLFADYQ [0223] 961 DQQLNSGVEM SDLLAAQNLV QSIPYVYNEM FPEIPGMNYT NFTELTNRLQ QAWNLYDLRN [0224] 1021 AIPNGDFRNG LSDWNATSDI NVQQLNDTSV LVIPNWNSQV SQQFTVQPNY RYVLRVTARK [0225] 1081 EGAGDGYVII RDGTNQTETL AFNTCDNDAG VLSTNQASYI TKTVEFTPST EQVWIDMSET [0226] 1141 EGVFNIESVE LVLEEE*

[0227] SEQ ID N03(人工设计基因的核苷酸序列)

[0228] BamHI

[0229] 1 CGCGGATCCGCGATGAGTCCGAATAACCAGAACGAATATGAGATCATCGATGCTTCCTCC [0230] 61 CCCACCTCTGTTTCTAATAACTCAGTGAAGTACCCTCTTGCAAGCGACCAGACGACCACA [0231] 121 TTGCAAAACATGAACTACAAAGATTACCTGCGGATGTCTGAGGGAGAGAATCCTGAACTT [0232] 181 TTTGGAAATCCCGAGACGTTCATTAGTGCTCAGGACGCTGTTGGCACTGGTATTGATATT [0233] 241 GTGAGCAAGCTGTTGGGTAGTTTGGGGGTTCCACTTGTTGGTCAGGCCGCCACGGCACTT [0234] 301 AAATGGATCATAGGTAAGTTGTGGCCTTCTTCCGGAAACCCCTGGGACGATTTGATGACG [0235] 361 GCCGTAGAAGAACTCATCAACCAGAAGATAGAAGCGTATGCCAGAAGCAAGGCACTTGCT [0236] 421 GAATTGGGTGTTAGCGGACGGGCTGTGAAGTCCTACCAAACCGCCCTTGAAGAGTGGCAG [0237] 481 AAGAACCCCAATAACGCTCGAAGCGCAGCCCTTGTCAGGGAAAGATTTTCAGACGCAGAA [0238] 541 CACACATTGCGTACCCAAATGAGTTTGTTCACCGTTCGTGGTTACGAAATTCCGCTTTTA [0239] 601 GCCACATATGCACAAGCTGCCAATTTGCACTTGTTTGTGATGAAGGATATTCAAATTTAC [0240] 661 GGTAGAGAATGGGGATACACTCAGGGCGACATCAACCTTTTCTACAGGGAACAAGTAGAA [0241] 721 TTCACAGGGGAATACTCTGATTATTGCGTTAAGTGGTACAACGCTGGCTTGGACAAACTT [0242] 781 AGAGGCAGCACCGCTCTACAATGGATTAACTACAATAGGTTCCGCAGAGAAATGACAGTG [0243] 841 ATGGCCCTGGATATCGTTGCACTTTTCCCCAATTACGACATCCGCATGTATCCAATGAAG [0244] 901 ACAACCGCAGAACTTACGCGAAGAATTTACACAGACCCCCTTGGTTACACGGGAAGCGGT [0245] 961 TCTAACACGCCACCATGGTATAACTACGGATACTCTTTCTCCTGGATAGAAAACAACGCC [0246] 1021 GTGCCAGCCCCTGGATTGTTCCAGTGGTTGCAAGGCATTGGGATCTATACCAAGTTTGCT [0247] 1081 CGTATCACTCCATTTTACGCGAACTACTGGTCAGGACATACTGTCTTCTACAAATTTACT [0248] 1141 AACGATTCTACTGAGAGACGTGTTCAGTATGGAGACACAGATACTCCAGAATTAGACAGT [0249] 1201 TCTTCCTTCGAAAACGTTGACATTTATAAGGTTTCCGCCTCAGTTGGTTCGTACAAGAGC [0250] 1261 AATACCGTGTTGTTACCAACTTTTAAAGCTACTTTCGAGGGTGTCAATCAGAACAATCAG [0251] 1321 CTTAAGACCTTTAGGTATCAAAAGGAATCTAATGTCCCAAGCCAAACGAAGAACTCAACC [0252] 1381 ACAGAGCTGCCTGTTCAGTTGTCCACTCCGCCTACTTACGGAGACTCTGAACAGTACAGT [0253] 1441 CACAGACTAGCCTACGTTTTCGATGCCCCAATCGACTCATATACAGGCATATACCGCATG [0254] 1501 TACGGCTTTGCCCCTATTCTTGGTTGGACACACATTAGCGTGAGTAGGGACAACAGGATC [0255] 1561 GATCCAGACAAGATTACTCAAATTCCAGCTGTAAAGGCATATGCTGAGGGTCTTGCTAAT [0256] 1621 TACATCAAAGATCCCGGGTTCACAGGAGGCGACTTACTTGCTTTAGGTAGAAACTCCAAT [0257] 1681 ACTTCATTGATTGTCAACTTTTCGAAGCCTCAAACATACCGTATCCGTATTAGGTACGCT [0258] 1741 GCTAGCAAAACTTCGTATTTCCAACTACGTGGTCTGCACAATATCGCTCAGTCTCAGCGT [0259] 1801 TTCGAAGCTACGTACTCTAATAAGAACGAAAACGATTTGACATTTAACGACTTCAAGTAC [0260] 1861 GTCGAAATTCAAAAAACTGTTTCCATCGACAATCCATCAGAAAGCAGGAGTATATCCATC [0261] 1921 TACACTCAATCAGATACAGAACTTCTTATTATAGACAAAATCGAATTCATCCCAGTAGAC [0262] 1981 GCCACATTTGAAGCGGAACAAGACCTAGATGTGGCAAAGAAGGCTGTGAATGGCTTGTTC [0263] KpnI SacI

[0264] 2041 ACGAACACAAAGTAACGGGGTACCCCGAGCTCG

[0265] SEQ ID N04(人工设计基因mCry8Ga1蛋白的氨基酸序列)

[0266] 1 MSPNNQNEYE IIDASSPTSV SNNSVKYPLA SDQTTTLQNM NYKDYLRMSE GENPELFGNP [0267] 61 ETFISAQDAV GTGIDIVSKL LGSLGVPLVG QAATALKWII GKLWPSSGNP WDDLMTAVEE [0268] 121 LINQKIEAYA RSKALAELGV SGRAVKSYQT ALEEWQKNPN NARSAALVRE RFSDAEHTLR [0269] 181 TQMSLFTVRG YEIPLLATYA QAANLHLFVM KDIQIYGREW GYTQGDINLF YREQVEFTGE [0270] 241 YSDYCVKWYN AGLDKLRGST ALQWINYNRF RREMTVMALD IVALFPNYDI RMYPMKTTAE [0271] 301 LTRRIYTDPL GYTGSGSNTP PWYNYGYSFS WIENNAVPAP GLFQWLQGIG IYTKFARITP [0272] 361 FYANYWSGHT VFYKFTNDST ERRVQYGDTD TPELDSSSFE NVDIYKVSAS VGSYKSNTVL [0273] 421 LPTFKATFEG VNQNNQLKTF RYQKESNVPS QTKNSTTELP VQLSTPPTYG DSEQYSHRLA [0274] 481 YVFDAPIDSY TGIYRMYGFA PILGWTHISV SRDNRIDPDK ITQIPAVKAY AEGLANYIKD [0275] 541 PGFTGGDLLA LGRNSNTSLI VNFSKPQTYR IRIRYAASKT SYFQLRGLHN IAQSQRFEAT [0276] 601 YSNKNENDLT FNDFKYVEIQ KTVSIDNPSE SRSISIYTQS DTEYLLWTNR IHPSRCNIWS [0277] 661 GTRPRCGKES GEWLVYQYKR