在日本Inland Sea(内陆海)的沿海地区(Kyushu、Okinawa等海 岸)迄今为止养殖着各种鱼类和甲壳类。其中有大量的对虾、小虹 鲹、鳎类等的养殖场，在这里养殖的鱼类和甲壳类被大量运往市场。
养殖鱼类和甲壳类需要注意环境因素(例如水温和饲料量)， 因为当这些因素恶化时，鱼类和甲壳类的存活率就会下降。目前在 众多因素中，养殖场产生的硫化物正成为一个严重的问题。这些硫 化物主要包含金属硫化物和硫化氢。前一种硫化物是沉积在养殖场 底部沙地上的淤泥状黑色物质，构成鱼类和甲壳类减产的原因。后 一种硫化物导致池塘散发异味，并且对生物呼吸有抑制作用，并造 成水中溶解氧的消耗。
一般认为硫化物的产生机制如下：首先，通过两个形成途径形 成了硫化氢。更具体地说，一种情况中，在由饲料和/或类似物质中 溶解出来的蛋白质中包含的含硫氨基酸发生脱硫反应，形成硫化 氢，一种情况是硫酸根离子通过同化性还原形成硫化氢。有多种细 菌参与这些反应。然后，已形成的硫化氢与底部沉积物中的铁盐等 反应。由此形成的金属硫化物以淤泥的形式累积。为了阻止这些硫 化物的累积采取了各种措施。
例如，实行的做法有用沙泵将水底淤泥泵出并进行处理，散布 过氧化钙(每年至少300吨)，等等。但是，不能说这些方法就是 适用的方法，因为人们认为这些方法不具有抑制污染进展的效果， 而从成本角度来说，也是一个沉重的负担。另外，目前市场上有一 些能分解水底淤泥的微生物制品。但是使用这些微生物制品被认为 效果不理想。
另一方面，可能在某些情况中，不仅是养殖场，多层建筑的地 下排水槽等处也会产生硫化物。这些硫化物还构成从建筑物散发的 气体中的恶臭成分。市场上出售微生物制品等作为抑制恶臭散发的 措施。但它们没有公认的显著效果。
因此，本发明的一个目的是提供一种硫化物发生的抑制剂，它 能抑制容易产生硫化物的环境(如养殖场和高层建筑的排水槽)产 生硫化物，净化这些环境，防止散发恶臭，并使鱼类和甲壳类的产 量提高等等。
发明公开
针对上述情况，本发明人进行了大量研究。结果惊奇地发现， 能够同化水溶性肽或水溶性蛋白质的芽孢杆菌属细菌，能抑制淤泥 之类的地方中硫化物的产生，自然抑制异味的散发和改善上述环 境，从而实现了本发明。
根据本发明，提供了一种硫化物产生的抑制剂，其中包含有同 化水溶性肽或水溶性蛋白质能力的芽孢杆菌属细菌。
根据本发明，还提供了一种含硫化物淤泥的净化剂，其中包含 有同化水溶性肽或水溶性蛋白质能力的芽孢杆菌属细菌。
根据本发明，进一步提供了一种改善鱼类和甲壳类养殖场水底 沉积物的试剂，其中包含有同化水溶性肽或水溶性蛋白质能力的芽 孢杆菌属细菌。
根据本发明，再进一步提供了鱼类和甲壳类的一种养殖方法， 它包括将上述硫化物产生抑制剂施加到鱼类和甲壳类养殖场中实行 养殖。
根据本发明，还提供了一种抑制异味散发的方法，它包括将上 述硫化物产生抑制剂施加到地下排水槽中。
根据本发明，还提供了一种净化环境的方法，它包括将上述硫 化物产生抑制剂用于该环境。
实施本发明的最佳方式
对可用于本发明的芽孢杆菌属的细菌，可以使用任何细菌而不 必具体限定，只要它们有同化水溶性肽或水溶性蛋白质的能力即 可。
在芽孢杆菌属的这种细菌中，优选用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或迟缓芽孢杆菌(B.lentus)抑制硫化物产生。更优选选 自短小芽孢杆菌A-1株系、迟缓芽孢杆菌A-2株系、迟缓芽孢杆菌 A-3株系和短小芽孢杆菌A-4株系中的一或多种细菌。这四种芽孢杆 菌属细菌是从大约30种分离自Oita的Beppu湾海底淤泥和东京湾 Yokohama海岸海水的微生物中筛选得到的。以它们在培养基上的生 长度作为筛选的指标，该培养基是通过从对虾的混合饲料(Ebian， Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.产品)提取水溶性蛋白质并用琼脂使 其凝固得到的。从由此得到的一组细菌中挑选病原性低的属，得到 了上述4株菌。又及，根据布达佩斯条约，将A-1株系、A-4株系、 A-2株系和A-3株系保藏在国立生命科学和人体技术研究所、工业科 学和技术局(1-3，Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken， 305-8566，Japan)，保藏号分别为FERM BP-6280(原保藏日：1997 年3月21日)、FERM BP-6281(原保藏日：1997年3月21日)、 FERM BP-6278(原保藏日：1998年3月3日)和FERM BP-6279(原 保藏日：1998年3月3日)。
按照以下方法检测了这四株菌的真菌学特性。结果示于表1、2 和3。
(检测方法)
(1)首先按照“医学细菌鉴定手册”(第三版，Cowan和Steels， 57页，Kindai Shuppan)作革兰氏染色等，并按照“新编细菌培养 教程，末卷”(第二版，156页，Kindai Shuppan)做嗜盐性检测。 (表1)
(2)用研究细菌生物化学特性的试剂盒(Api 20 NE，Nippon Biomeryu Bitec产品)研究四株菌的生物化学特性(表2)。
(3)再用研究细菌生物化学特性的试剂盒(Api 50 CHB，Nippon Biomeryu Bitec产品)进一步研究四株菌的生物化学特性。首先将 每株菌培养在琼脂培养基上，随后刮下一个菌落，悬浮在1ml无菌 生理盐水溶液中来制备细菌的浓悬液。再用无菌生理盐水溶液将该 悬液稀释，并接种到Api 50 CHB培养液(其成分后面有描述)中。 将接种了细菌的培养液分装含有碳源(50种)的小试管中，并于30 ℃培养。培养开始后过24小时和48小时，根据每支试管的颜色变 化判定为阳性或阴性。结果示于表3。
(Api 50 CHB培养液)
硫酸铵                     2g
酵母提取物              0.50g
胰蛋白胨                   1g
酚红                   0.18ml
矿物碱M/100              10ml
磷酸盐缓冲液(pH7.8)    1000ml
pH(灭菌后)                7.5
检测结果
                                 表1     A-1    A-2   A-3    A-4     革兰氏染色     形状     芽孢     运动能力     在空气中的生长   厌氧条件下的生长     过氧化氢酶     氧化酶     OF 在蜡状芽孢杆菌选择培养     基上的阳性反应     嗜盐性检测     0％     1％     2％     3％     4％     5％     6％     7％     8％     9％     10％      +    杆状      +      +      +      +      +      -      F      -      +      +      +      +      +      +      +      ±            -      -      -     +   杆状     +     +     +     +     -     F     -     +     +     +     +     ±         -     -     -     -     -     -     +   杆状     +     +     +     +     +     -     F     -     +     +     +     +     +     +     -     -     -     -     -     +    杆状     +     +     +     +     +     +     F     -     +     +     +     +     +     +     -     -     -     -     -
                                    表2     (Api 20 NE)     A-1     A-2     A-3     A-4     硝酸盐的还原      -      +      +      -     吲哚的产生      -      -      -      -     葡萄糖的酸化      ±              +      +      -     精氨酸脱水酶      -      -      -      -     脲酶      -      -      -      -     β-葡糖苷酶      +      +      +      +     蛋白酶      +      +      +      -     β-半乳糖苷酶      +      +      +      +     同化葡萄糖      +      +      +      +     同化L-阿拉伯糖      +      -      -      +     同化D-甘露糖      +      +      -      -     同化D-甘露糖醇      +      +      -      + 同化N-乙酰基-D-葡糖胺      +      +      +      +     同化麦芽糖      +      +      +      +     同化葡糖酸钾      -      +      +      -     同化正癸酸      -      -      -      -     同化己二酸      -      -      -      -     同化d1-苹果酸      +      -      +      +     同化柠檬酸钠      +      -      -      +     同化醋酸苯      -      -      -      -
                                                             表3   (Api 50 CHB)   A-1   A-2    A-3    A-4   (Api 50 CHB)    A-1    A-2    A-3    A-4     甘油     赤藻糖醇   D-阿拉伯糖   L-阳拉伯糖     核糖     D-木糖     L-木糖     阿东糖醇   β-甲基木糖苷     半乳糖     D-葡萄糖     D-果糖     D-甘露糖     L-山梨糖     鼠李糖     半乳糖醇     肌醇     甘露醇     山梨醇 α-甲基-D-甘露糖苷 α-甲基-D-葡糖苷   N-乙酰葡糖胺     苦杏仁苷     熊果苷     七叶苷   +   -   -   +   +   ±     -   -   -   +   +   +   +   -   -   -   ±    +   -   +   +   ±     +   +   +    +    -    -    +    +    -    -    -    +    +    +    +    -    -    -    ±      +    -    ±       ±       ±       +    +    +     -     -     -     -     ±         -     -     -     -     -     +     ±        -     -     -     -     -     -     -     -     -     +     -     +     +     +     -     -     +     +     +     -     -     -     -     +     +     +     +     -     -     -     ±        +     -     +     +     ±        +     +     +     Salicitol     纤维素二糖     麦芽糖     乳糖     蜜二糖     蔗糖     海藻糖     菊粉     松三糖     D-棉子糖     阿米酮     糖原     木糖醇     β-龙胆二糖     D-松二糖     D-Lyxsose     D-塔格糖     D-岩藻糖     L-岩藻糖   D-阿拉伯糖醇   L-阿拉伯糖醇     葡萄糖酸 2-Ceto-葡萄糖酸盐 5-Ceto-葡萄糖酸盐     +     +     +     ±          +     +     +     -     -     ±         -     -     -     -     +     -     +     -     -     -     -     -     -     -     +     +     +     ±        +     +     +     +     ±         ±         +     -     ±         -     +     -     +     -     -     -     -     -     -     -     +     ±         +     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     -     +     +     +     ±        +     +     +     -     -     ±         -     -     -     -     +     -     +     -     -     -     -     -     -     -
使用Api 50 CHB判定的结果：
A-1：短小芽孢杆菌(鉴定概率*＝99.9％)
A-2：迟缓芽孢杆菌(24小时培养物的鉴定概率*＝95.6％)
A-3：迟缓芽孢杆菌(鉴定概率*＝56.8％)
     侧孢芽孢杆菌(鉴定概率*＝22.0％)
     蜂房芽孢杆菌(鉴定概率*＝9.4％)
A-4：短小芽孢杆菌(鉴定概率*＝99.9％)
鉴定概率：
概率表示选自分布图中的一个分类学组相对数据库中另一个分 离组被鉴定出来的程度。
当以上描述过的任何菌株被用于抑制硫化物的产生这一目的 时，可以将培养后的细菌原样施加。但是，在许多情况中，优选在 施加前将细菌固定在载体上。例如，由于养殖场的硫化物积聚在水 底的沙上，所以必须使细菌沉到水底。通过使用载体可以容易地实 现这一点。
对本文中使用的载体没有特别的限定。但是，考虑到细菌的保 持性，优选沸石、石英prophyry(Bakuhanseki)、活性碳、火成 岩、珊瑚石等。从经济角度来说，特别优选火成岩。可以考虑所用 的环境、成本和效果来合适地确定载体中的细菌数。但是，优选的 菌数通常为大约106到109cfu/g，特别优选大约108cfu/g。
施加到养殖场、地下排水槽等处的芽孢杆菌属细菌的浓度也可 以合适地确定。但是，优选施加细菌至浓度通常大约107cfu/m2到2 ×1011cfu/m2，特别优选大约109cfu/m2到2×1010cfu/m2。
另一方面，在将细菌施加到养殖场、排水槽等处前将其固定在 载体的情况中，为了取得好的效果，载体用量优选大约0.1到2× 103g/m2，特别优选大约10到200g/m2(假设载体中的细菌数是108 cfu/g)。由于固定化菌株的活性在大约30天后丧失，优选以大约 30天的间隔重复施加这种载体。
由于在本发明中用芽孢杆菌属细菌作硫化物产生抑制剂，因此 要考虑到微生物所加入的水池等处的水温会改变细菌的活性。更具 体地说，养殖鱼类和甲壳类的水池等通常安置在露天的开放体系 中，其水温取决于户外的气温。因此，本发明菌株的活性在夏季(水 温：大约30℃)更高，冬季更低。但是，这并不带来特别的问题， 因为参与硫化物产生过程的细菌组的活性在冬季也降低，因此硫化 物的产生程度也低，另外，养殖鱼类和甲壳类通常是在水温高的季 节进行。
根据本发明的硫化物产生抑制剂可以被用作含硫化物淤泥的净 化剂。例如，它不仅可以用在养殖场和地下排水槽中，还可以用于 各种环境中来改善环境。更具体地说，可以将该抑制剂用于从湖泊、 池塘和下水道系统到家庭养鱼缸的多种环境。
实施例
通过以下实施例对本发明进行更详细地描述。但是，本发明并 不仅限于以下实施例。
实施例1：菌株筛选
(1)分离水底淤泥同化细菌
从Oita的Beppu海湾采集的海底淤泥于20℃放置18天后，将 它涂布在平板培养基[通过向牛肉汤干粉(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd产品)加入氯化钠(3％)和琼脂(1.5％)制得，pH8.0]， 于28℃培养3天，从而分离出10个优势菌株。另外，从东京海湾 Yokohama海岸的海水中分离到有同化特殊化合物能力的19个株系 细菌。
将养殖对虾的饲料(Ebian，Kyowa Hakko Kogyo有限公司产品) 研磨并悬浮在人工海水中后，分别用前面得到的29个株系接种一份 悬浮液。将识别出能生长的每个株系再涂布到平板培养基(其成分 随后描述)上以便观察生长情况，该培养基是通过从养殖对虾的饲 料(Ebian，Kyowa Kakko Kogyo有限公司产品)中提取出水溶性蛋 白质、再用琼脂使该提取物凝固而得到的。
(培养基成分)
琼脂                      15g
水溶性蛋白质               1g
用人工海水调至1000ml
由以上结果，挑选出以下4个株系；
短小芽孢杆菌A-1株系；
迟缓芽孢杆菌A-2株系；
迟缓芽孢杆菌A-3株系，以及
短小芽孢杆菌A-4株系。
实施例2：硫化氢分解能力实验
将A-1和A-4株系按1×108cfu/g比例、A-2和A-3株系按1× 107cfu/g比例固定在火成岩上得到的组合物(100g)、3％NaCl(90ml) 和得自对虾饲料的水溶性组分提取物(5w/v％，10ml)加入1L烧瓶，将 烧瓶于28℃静置2小时。然后，向烧瓶上部注入硫化氢气体，并将 烧瓶密封塞好，随时间用检测管确定上部硫化氢浓度的变化。又及， 将与上述组合物相同的组合物预先高压蒸气灭菌用来作为对照。
结果发现，如表4所示，实验组的硫化氢气体浓度较之对照组 明显降低，因此A-1到A-4株系具有分解硫化氢的能力。
表4
硫化氢气体浓度(括号内的数字表示液相的pH) 对照组(ppm) 实验组(ppm)     0小时     2小时     4小时   620(7.5)     300   150(7.4)   680(7.6)     200     50(7.4)
实施例3：用其上固定有微生物的载体分解养虾池塘沉积物的实 验
(实验的具体方法)
在Yamaguchi的Ube对虾养殖场的培养池中，将其上固定了微 生物的载体混合到培养池的底沙中养殖对虾，观察对虾的生长情 况。这时，仍用检测管测量培养池中的硫化氢气体量。
(1)培养池：2m×2m×1m，4-t露天池塘。
(2)对虾：大约1000只对虾/池。
(3)选择固定微生物的载体：
选用火成岩(Palsand，2.5-3.5mm)是因为它适合作为载 体，并且比较便宜。
(4)微生物：将A-1和A-2株系以大约107cfu/g的比例固定在 载体上。
(5)散布载体的方法：在对照组中，以1kg/池的量散布其上未固 定微生物的载体。实验组中，开始以1kg/池的量散布其上固定有微 生物的载体，过29天散布同样的量，过45天再散布同样的量。
(实验结果)
测试开始后过55天，对照组中几乎所有的底部沉积物均变黑， 可闻到恶臭味。
另一方面，在散布了其上固定有微生物的载体的实验组中，只 有部分底部沉积物变黑，也可稍微闻到恶臭味。在排水之前，采集 培养池中的水作为分析样品，然后排水至可见到底部的淤泥。结果， 对照组中，整个池塘底沙表面由于硫化物而变黑，在底沙表面看到 对虾(它们有在白天钻到底沙里面的特性)。经过55天的时间仍存 活的对虾数和在相同时期内收集的培养池底部沉积物的分析结果分 别示于表5和表6。用检测管测量到的硫化氢气体量见表7。又及， 在使用A-2和A-3株系的实验中得到了相似的结果。
表5
存活对虾的数量等     对照组     实验组 存活对虾的数量   844只对虾   1010只对虾     重量 545g/200只对虾 550g/200只对虾
*两组间重量没有差别，但对照组中个体间的差别较大。
表6
对底部沉积物的分析结果 对底部沉积物   的分析结果         对照组         实验组     (1)     (2)     (1)     (2) 高锰酸钾消耗   量(mg/g)     1.7     2.0     1.2     1.8     硫化物     (mg/kg)     140     570     58     398
备注1：对照组和实验组的样品采集自底部沉积物没有发生颜色 变化的区域[如样品(1)]，和底部沉积物变黑的区域[样品(2)]。
表7   硫化氢   存活对虾的数量   对照组    3ppm     844只对虾   实验组    1ppm     1010只对虾
实施例4：抑制地下排水槽恶臭散发的实验
将微生物加入中央研究院(KABUSHIKE KAISHA YAKULTO HONSHA， Kunitachi-shi，Tokyo)的地下排水槽来考察微生物对异味散发的抑 制效果。
(1)排水槽：3.75×1.5×1m
(2)加入的微生物：
将A-1和A-4株系加入排水槽至终浓度为大约104cfu/ml。
(3)异味散发情况的测评方法：
排水槽在加入微生物之前作为对照，根据感觉每周测评异味散 发情况一次。然后每周将微生物加入同一个排水槽至前述的浓度， 并每次根据感觉测评异味散发情况。按照以下6级气味强度进行感 官测评。
表8 气味强度 等级 0 1 2 3 4 5 无味 几乎感觉不到气味 可判断是从何处散发的微弱气味 可很容易感觉到的气味 浓的气味 强烈的气味
(4)实验结果：
异味散发情况如表9所示。与对照组相比，实验组中异味的散 发被抑制到一定程度。用A-2和A-3株系进行实验也得到了相似的 结果。
表9  0天  7天  14天  21天  28天 对照组   4   4    3    3    4 实验组   4   2    2    1    2
实施例5：微生物对鱼的急性毒性实验
(1)实验概况：
通过参照JIS K 0102 71的方法，用himedaka确定24小时和 48小时后微生物的LC50*，进行该实验。
*：LC50(半数致死浓度)：在该浓度下有50％实验用鱼被杀死， 与TLM含义相同。
(2)样品：A-1或A-4株系
(3)实验过程：
以使被检测微生物的浓度达到103、105和107cfu/ml的方式准备 三种实验用水后，在这些实验用水中养殖被检测的鱼48小时，随时 间计数每种实验水体中被杀死的鱼的数量。
(4)实验用鱼：
himedaka(平均长度：2.5cm，平均体重：0.25g，得自Yoshida 养鱼场(Hachiojishi，Tokyo))。
(5)实验条件：
①实验方法：静止水系统
②实验用鱼的数量：每种实验用水中有7条鱼
③实验用水量：3升
④实验用水温度：22℃±2℃
⑤光照：10小时/天
⑥养鱼池：圆形玻璃池
⑦稀释水：自来水(脱氯水)
(6)实验结果：
①LC50：用himedaka在24小时和48小时后得到的被测微生物 的LC50数值都大于107cfu/ml。
②浓度和死亡率：
各个实验浓度随时间的死亡率示于表10。用A-2和A-3株系进 行的实验得到了相似的结果。
表10          死亡率(％)   24小时后   48小时后   A-1株系   103cfu/ml     0      0   105cfu/ml     0      0   107cfu/ml     0      0   A-4株系   103cfu/ml     0      0   105cfu/ml     0      0   107cfu/ml     0      0
工业应用： 通过使用本发明所述硫化物产生抑制剂，可以减少各种鱼类和甲 壳类培养过程中所用的水池里和地下排水槽中污染物和恶臭物质(例 如含有硫化物的淤泥)的产生。