芽孢杆菌蛋白生产细胞

                        发明领域

本发明涉及具有增加的所需多肽生产的芽孢杆菌细胞和所需多肽的生 产方法。

                        发明背景

芽孢杆菌细胞已广泛应用于所需多肽的工业生产。Kunst等，自然 (nature)390：249-256(1997)上公布了革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌的完整基因 组序列。

                        发明概述

本发明要解决的问题是提供能产生增加量的所需多肽的芽孢杆菌细 胞。

解决方案的基础是，本发明人鉴定出了一种能产生增加量的所需多肽的 芽孢杆菌细胞，该细胞中，含如SEQ ID NO：1所示DNA序列的基因以低 于野生型的水平表达。

该基因在枯草芽孢杆菌细胞中得到证实，并在所述芽孢杆菌细胞中命名 为yjbH。参见Kunst等自然(nature)390：249-256(1997)。

而且，本发明人在地衣芽孢杆菌中已鉴定出了一种同源yjbH基因(SEQ ID NO：3)。

如上所述，(见背景部分；Kunst等自然(nature)390：249-256(1997))在 本发明的优先权日以前，yjbH基因未被破译，即该基因未与优先权日前已知 的功能相联系。

根据本文的指导，本领域技术人员可利用常规知识，通过如与本文公开 的yjbH基因(SEQ ID NO：1和3)的DNA序列同源性，鉴定另一种芽孢杆菌 细胞中的同源基因，并由此，通过以上概述的方法，生产能产生增加量的所 需多肽的芽孢杆菌细胞。

此外，如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，与任何细胞中的任何其他 已知DNA序列的同一性都极低。在公知数据库中，例如EMBL中进行同源 搜索的结果表明：不存在与如SEQ ID NO：1所示DNA序列有任何相近的 同一性的序列。

同样的，用如SEQ ID NO：2所示的多肽序列在公用SWISSPROT数据 库中进行同源性搜索，结果表明没有任何同一性近似的多肽。

据此，本发明的第一方面涉及一种具有增加的所需多肽，优选淀粉酶， 生产的芽孢杆菌细胞，该芽孢杆菌的细胞以低于野生型的水平表达一种基 因，该基因包括：(a)如SEQ ID NO：1第1位到828位所示的的DNA序列；

(b)与项目(a)中DNA序列同一性至少为70％的DNA序列；

(c)编码如SEQ ID NO：2中第1位到275位所示多肽序列的DNA序列； 或

(d)编码与如SEQ ID NO：2中第1位到275位的序列同一性至少为70 ％的多肽的DNA序列。

而且，本发明人已证实：如SEQ ID NO：1第1到147位所示的部分序 列高度保守。

据此，本发明的第二方面涉及一种具有增加的所需多肽生产的芽孢杆 菌细胞，该芽孢杆菌细胞以低于野生型的水平表达一种基因，所述基因包 括：(a)如SEQ ID NO：1第1位到147位所示的DNA序列；

(b)与项目(a)中DNA序列同一性至少为70％的DNA序列；

(c)编码如SEQ ID NO：2中第1位到49位所示的多肽序列的DNA序 列；或

(d)编码与SEQ ID NO：2中第1位到49位所示的序列同一性至少为70 ％的多肽的DNA序列。

如上所显而易见，本文的芽孢杆菌细胞非常适合所需多肽的生产。

据此，本发明的第三方面是生产所需多肽的方法，其包括下列步骤：

(i)在允许所需多肽生产的条件下，培养上述第一或第二方面的芽孢杆 菌；

(ii)分离所需多肽。

定义：

在对本发明的具体实施例进行讨论之前，先对与本发明的主要方面相关 的特定术语进行定义。

术语“基因”在此处表示：能在所述细胞中表达为多肽的基因(DNA序 列)。据此，所述基因可定义为由一个起始密码子(一般为“ATG”，“GTG” 或“TTG”)开始到一个终止密码子(一般为“TAA”，“TAG”或“TGA”)终 止的开放阅读框。

如本领域技术人员所知，为了表达所述基因，必须有与该基因相关联 的，且在细胞中表达该基因所必须的元件。这些标准元件包括：启动子，核 糖体结合位点，终止序列及本领域所知的其它序列。

依照本发明第一和第二两方面的术语“ 芽孢杆菌以低于野生型的水平表 达一种基因”是指对能产生以低于野生型之水平表达一种基因的细胞的野生 型细胞的任何改变。这些改变可能是启动子和/或开放阅读框的改变，如缺 失，插入，移码或本领域所知的任何DNA操作。

如上述改变的芽孢杆菌细胞中基因的表达水平，可优选地通过比较所述 细胞与未经改变的亲代细胞中所需多肽的生产水平，来很好地确定。如果与 未经改变的亲代细胞相比，经改变的芽孢杆菌细胞产生更多的所需多肽，则 依本发明的第一和第二方面所得的芽孢杆菌细胞中的基因表达低于野生型 水平。测定所需多肽生产水平的实际分析将依赖于具体的所需多肽。选择合 适的分析方法是属于本领域技术人员的一般知识范围内的。

DNA序列的同一性：

涉及本发明第一方面中术语“ 与SEQ ID NO：中第1至828位所示的 DNA序列有至少70％同源性的DNA序列”和本发明第二方面中的术语“ 与 SEQ ID NO：1中第1至147位所示的DNA序列有至少70％同源性的DNA 序列”，的DNA序列同一性被确定为两个序列之间的同一性程度，其表示第 一个序列与第二个序列的偏差。同一性可通过本领域所知的计算机程序来确 定，例如，GCG程序包中的GAP程序(WISCONSIN软件包的程序使用手册， 1994年8月第8版，遗传学计算机组，575 SCIENCEDRIVEMADISON， 威斯康星，美国)53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)分子生物学杂 志，48，443-453)。使用带有下列设置的GAP程序进行DNA序列比较：GAP 创建罚分5.0，GAP延伸罚分0.3。上述的相似DNA序列具有与本发明第一 方面中第1到828位的DNA序列，或本发明第二方面中SEQ ID NO：1之1 到147位的DNA序列优选至少为70％，更优选至少为75％，更优选至少为 80％，更优选至少为90％，更优选至少为95％，更优选至少为97％的同一 性程度。

多肽序列的同一性：

涉及本发明第一方面中术语“与编码SEQ ID NO：2中第1至275位所 示多肽序列的DNA序列同一性至少为70％的DNA序列”和本发明第二方 面中的术语“与编码SEQ ID NO：2中第1至49位所示多肽的DNA序列同 一性至少为70％的DNA序列”的多肽序列同一性被确定为两个序列之间的 同一性程度，其指示第一个序列与第二个序列的偏差。同源性可通过本领域 所知的计算机程序来确定，例如，GCG程序包中的GAP(WISCONSIN软件 包的程序使用手册，1994年8月第8版，遗传学计算机组，575 SCIENCE DRIVE MADISON，威斯康星，美国)53711)(Needleman，S.B.和 Wunsch，C.D.，(1970)分子生物学杂志，48，443-453)。使用带有下列设置的 GAP程序进行DNA序列比较：GAP创建罚分3.0，GAP延伸罚分0.1，由本 发明中相似DNA所编码的多肽序列与本发明第一方面SEQ ID NO：2中第1 到275位的多肽序列，或本方面第二方面SEQ ID NO：2中1到49位的多肽 序列的同一性程度，优选至少为70％，更优选至少为75％，更优选至少为 80％，更优选至少为90％，更优选至少为95％，更优选至少为97％。

                        发明详述

依本发明第一或第二方面具有增加的所需多肽生产的芽孢杆菌细胞

此处所述的基因优选位于芽孢杆菌中的两个公知的遗传标记srfAA和 thyA之间。

术语“位于芽孢杆菌的两个公知的遗传标记srfAA和thyA之间”此处 是指所述基因位于枯草芽孢杆菌染色体上约32°处的srfAA的3’端和枯草芽 孢杆菌染色体上约162.5°处thyA的5’端之间(F.Kunst等，1997，自然， 390(20)：249-256)。

遗传标记srfAA编码芽孢杆菌中的枯草菌表面活性剂合成酶亚单位I， 详细内容参见(Fuma，S等，核酸研究1993；21(1)：93-7)。

遗传标记thyA编码芽孢杆菌中的胸苷酸合成酶A，详细内容参见 (Tam，N.H.等分子普通遗传学1998；258(4)：427-30)。

srfAA标记是多种不同原核细胞中发现的同源标记超家族的成员，例如 液化肠杆菌(Serratia liquefaciens)的swrA(Lindum等细菌学杂志，1998； 180(23)6384-8)和短芽孢杆菌(Bacillus brevus)的grsA(Krause，M.等细菌学杂 志1988；170：4669-74)。

thyA标记常见于多种原核细胞，例如：淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)(Carlson，J.H.等FEMS微生物学通讯.1997；151(2)：225-30)， 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus liquefaciens)(Tam，N.H.等分子普通遗传学.1998； 258(4)：427-30)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Cole，S.T.等自 然1998；393(6685)：537-44)。

此处所述的基因更优选位于芽孢杆菌中2个公知的遗传标记mecA和 tenA之间(F.Kunst等，1997，自然390(20)：249-256)。

术语“位于芽孢杆菌中2个公知的遗传标记mecA和tenA之间”此处指 所述基因位于枯草芽孢杆菌染色体上约105°处mecA的3’端和枯草芽孢杆 菌染色体上约106°处tenA的5’端之间(F.Kunst等，1997，自然390(20)： 249-256)。

遗传标记mecA编码芽孢杆菌遗传感受态的负调节因子，详细内容参见 (Kong，L等分子微生物学1993年7月；9(2)：365-73)。

遗传标记tenA编码一种多肽，该多肽可调节芽孢杆菌中胞外酶的产生， 详细内容参见(Pang，AS.等，细菌学杂志，1991，1月，173(1)：46-54)。

这两种遗传标记常见于多种不同原核生物细胞，例如：坚强芽孢杆菌 (Bacillus firmus)(Guo，D.等Biochim Biophys Acta 1998 1月5日；1389(1)：34- 42)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌 (S.epidermis)(Ryffel等，基因1990年9月28日；94(1)：137-8)，幽门螺杆菌 (Helcobacter pylori)(Tomb，JF.等，自然1997年8月7日；388(6642)：539-47)。

在以上述参考为基础的其他文献中，以本领域技术人员的一般知识，即 可在具体目标芽孢杆菌细胞中鉴定这些遗传标记基因，如：迟缓芽孢杆菌 (Bacillus lentus)，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)，Bacillus clausii，环状 芽孢杆菌(Bacillus circulans)，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，或苏云金芽孢 杆菌(Bacillus thuringiensis)。

其中优选的是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢杆菌 (Bacillus substilis)，或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的细胞。

本发明一个优选实施方案涉及此处所描述的芽孢杆菌细胞；其中由于一 个基因已失活，而使所述芽孢杆菌细胞以低于野生型的水平表达该基因。

基因的失活可以通过本领域技术人员所熟知的任何策略达到，例如在该 基因内或启动子中缺失，插入移码突变。

另一实施方案涉及此处所描述的芽孢杆菌细胞，其中所需多肽是酶，例 如蛋白酶，纤维素酶，脂肪酶，木聚糖酶，磷脂酶，或优选淀粉酶。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别公开了地衣芽孢杆菌中yjbH基因 的部分DNA序列和多肽序列。SEQ ID NO：1中第1到147位所示的DNA 序列与SEQ ID NO：3中第1到147位所示的DNA序列之间有76％的同一 性，SEQ ID NO：2中第1到49位的多肽序列与SEQ ID NO：4中第1到49 位的多肽序列之间有79％的同一性。

因此这些序列包括在本发明第一和第二方面的范围内。然后，本发明的 一个实施方案涉及芽孢杆菌细胞，该细胞中所述基因包含如SEQ ID NO：3 中第1到147位所示的DNA序列，或该基因包含编码如SEQ ID NO：4中 第1到49位所示多肽序列的DNA序列。

本发明进一步涉及具有增加的所需多肽生产的芽孢杆菌细胞，其中该芽 孢杆菌细胞以低于野生型的水平表达一种基因，该基因包括：

(a)如SEQ ID NO：3中第1到147位所示的DNA序列；

(b)与(a)项中所述DNA序列的同一性至少为70％的DNA序列；

(c)编码如SEQ ID NO：4第1到49位所示多肽序列的DNA序列；或

(d)编码与SEQ ID NO：4第1到49位所示多肽序列同一性至少为70％ 的的多肽序列的DNA序列。

所有与本发明第一和第二方面相关的实施方案，例如：更优选的同源性 特征和该基因在优选的遗传标记之间的位置也是与上述方面相关的优选实 施方案。

包含本发明第三方面的生产所需多肽的方法：

这一方法中的必需要素是使用此处所述的芽孢杆菌细胞。

允许所需多肽产生的具体培养条件可以是本领域技术人员所了解的多 种培养方法中的任意一种。

类似地，分离本发明第三方面第ii)项的所需多肽的特异性策略可以是本 领域技术人员已知的多种分离方案中的任何一种。

                        实施例

材料和方法

若无另外说明，体外DNA操作，细菌细胞的转化等均依分子生物学的 标准方法进行(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.“分子克隆实验室手 册”冷泉港实验室，1982；Ausubel，F.V.，等(编)“现代分子生物学技术”.John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌分子生物 学方法”.John Wiley和Sons，1990)。

若无另外说明，DNA操作所使用的酶依供应商提供的说明书使用。

所用培养基(TY，BPX和LB琼脂)见欧洲专利0506780。LBPSG琼脂是 添加了磷酸盐(0.01M K3PO4)、葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)的LB琼脂。如 WO94/19454所述含经染色的支链淀粉的琼脂平板在用于筛选提高的淀粉酶 生产的平皿中使用。用Spizizen’s基本培养基作为基本培养基，其中葡萄糖 替换为核糖。(Spizizen，1958.美国国家科学院学报44，1072-1078)。

α-淀粉酶分析

用Phadebas淀粉酶检测试剂盒(Pharmacia Diagnosics)测定培养上清中 的淀粉酶活性，测定方法由Phadebas试剂盒提供。

实施例1：

基因失活(其产生α-淀粉酶生产能力提高了的芽孢杆菌)：

表达染色体上整合基因所编码嵌合α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株通过 mini-Tn10转座子pIC333诱变(Steinmetz，M and Tichter，R.1994，细菌学杂志。 172：5019)。所用菌株为DN1885xylR∷pCJ203，其表达嵌合α-淀粉酶 AmyLQS55-4。该嵌合α-淀粉酶基因的确切组成和该菌株的构建已公开 (Christina lund Jensen(1997)，嵌合α-淀粉酶自枯草芽孢杆菌中的分泌，博士 论文，丹麦工业大学(DTU))。转座子整合到枯草芽孢杆菌染色体上可导致靶 基因的失活；那些因这类失活而致淀粉酶生产增加的基因，可通过在含0.4 ％葡萄糖、0.01M磷酸盐pH7、0.2％木糖、经染色的支链淀粉、6μg/ml氯霉 素和120μg/ml壮观霉素的LB培养基上晕圈的形成，筛选嵌合α-淀粉酶 AmyLQS55-4之生产增加的转座子文库而找到。

实施例2：

基因(SEQ ID NO：1)的鉴定，其在枯草芽孢杆菌中失活后可使所述细胞 增加α-淀粉酶的生产：

分离α-淀粉酶产量提高了的芽孢杆菌细胞，并依照下述方法鉴定基因 (SEQ ID NO：1)。

由于mini-Tn10包括pUC的复制起点，因此可轻易鉴定出因转座子插入 而失活的基因。为了挽救转座子插入位置两侧的DNA序列，必须使用不在 mini-Tn10转座子内部切割的限制性内切酶。有几种酶均可应用于该目的， 但本研究中使用了限制性内切酶EcoRI。大多数情况下可获得所需质粒。除 分离转座子插入位点周围的侧翼区外，为检测每个突变体中插入的转座子个 数，染色体DNA也用于Southern印迹分析。用EcoRI进行的转座子突变体 的Southern印迹分析显示：大多数的突变体只包含一个插入。仅有两个突变 体在其染色体上插入了不止一个转座子。

用EcoRI消化染色体DNA获得了转座子突变体的侧翼区，然后将其连 接并经由穿孔转化至大肠杆菌SJ2的电感受态细胞中(Diderichsen，B.等， 1990，细菌学杂志，172：4315-4321)，用壮观霉素(120μg/ml)抗性进行筛选。 所拯救的质粒经酶切分析验证。用引物TKp1(5’-CCAATA CGC AAA CGC CCT CTC-3’)和TKp2(5’-TAG TGA CAT TTG CAT GCT TC-3’)对所得质 粒进行序列分析可鉴定因转座子插入而失活的基因。DNA序列由自动测序仪 确定。为了所靶向的基因，将所得的序列对照枯草芽孢杆菌的完整基因组进 行了分析(F.Kunst等，1997，自然390(20)：249-256)。

通过分析实施例1中所获得的突变体，证实了下述基因中的转座子插 入：yjbH。转座子插入在yjbH开放阅读框中第711位核苷酸的后面。

实施例3：

在增加α-淀粉酶生产的枯草芽孢杆菌中证实基因(SEQ ID NO：1)的失 活：

在营养十分丰富的培养基中延长生长的过程中α-淀粉酶的积累。使 DN1885 xylR∷pCJ203菌株(其由染色体基因拷贝表达嵌合α-淀粉酶 AmyLQS55-4)的yjbH转座子突变体进行摇瓶培养，将培养上清中积累的α- 淀粉酶量与未经诱变的亲本株所积累的α-淀粉酶量相比较。在补充了0.2％木 糖、6μg/ml氯霉素的BPX培养基中37℃发酵7天后，用Phadebas试验测 量培养上清中α-淀粉酶的活性。观察到yjbH突变株的α-淀粉酶比野生型菌株 的提高了40％。

稳定生长期的枯草芽孢杆菌中α-淀粉酶的分泌

DN1885 xylR∷pCJ203菌株(其由染色体基因拷贝表达嵌合α-淀粉酶 AmyLQS55-4)的yjbH转座子突变体也在添加了1％木糖和6μg/ml氯霉素的 TY培养基中摇瓶培养，以诱导α-淀粉酶的合成。在37℃培养期间，取样测 定细胞密度(OD660/ml)和培养上清中的α-淀粉酶活性(NU/ml)。未突变的菌株 DN1885 xylR∷pCJ203做平行培养和取样。用下列等式计算α-淀粉酶的特异性 产率。

特异性产率＝(dP/dt)×(1/OD660)

特异性产率(NU/min/OD660)

P：产量/培养上清中的活性(NU/ml)

t：生长时间(min)

OD660：细胞密度(OD660/ml)

比活性可衡量给定时间段(此处指1min)内细胞产生α-淀粉酶能力。为计 算特异性产率，以时间的函数描述生长和以时间的函数描述α-淀粉酶活性的 等式由生长实验期间所获数据来估算。然后用这两个等式计算特异性产率。

观察到yjbH突变株中α-淀粉酶的特异性产率比亲代细胞的提高了。在 对数期后期，该突变株的α-淀粉酶特异性产率比亲代株高约70％。

对数生长的枯草芽孢杆菌细胞中α-淀粉酶的分泌。

枯草芽孢杆菌菌株DN1885 xylR∷pCJ199(Christina lund Jensen(1997)， 嵌合α-淀粉酶自枯草芽孢杆菌中的分泌，博士论文，丹麦工业大学(DTU))由 位于染色体上的一个基因拷贝表达地衣芽孢杆菌的野生型α-淀粉酶。通过用 来自yjbH突变株DN1885 xylR∷pCJ203的染色体DNA转化受体的感受态细 胞，可将yjbH转座子突变转到该菌株中。通过壮观霉素抗性进行筛选。

对菌株DN1885 xylR∷pCJ199和yjbH突变体衍生物进行摇瓶培养，所用 培养基是含1％核糖作为主要碳源的基本培养基，其中添加了6μg/ml氯霉素 和1％木聚糖以诱导淀粉酶的合成。在37℃培养期间，取样测定细胞密度 (OD660/ml)和培养上清中α-淀粉酶的活性(NU/ml)。如上述计算α-淀粉酶的特 异性产率。

在对数生长期内，特异性产率在yjbH突变株中比在亲代细胞中高约 60％。

从这些数据可以清楚地看出，yjbH突变株中α-淀粉酶的生产比野生型细 胞得到改善。

                    序列表

<110>Novo Nordi sk A/S

<120>芽孢杆菌蛋白生产细胞

<130>

<140>

<141>

<160>4

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>828

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(828)

<400>1

atg ttt gta gac cct tta tgt cct gaa tgc tgg tcc tta gag ccc gtc  48

Met Phe Val Asp Pro Leu Cys Pro Glu Cys Trp Ser Leu Glu Pro Val

  1               5                  10                  15

atc aaa aag ctg aaa atc aga tac gga cgt ttt ttc acc tta cgc att  96

Ile Lys Lys Leu Lys Ile Arg Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Leu Arg Ile

             20                  25                  30

atc gct tcc gca agc ctt acc gct tta aat aaa aag cga aaa aag cat  144

Ile Ala Ser Ala Ser Leu Thr Ala Leu Asn Lys Lys Arg Lys Lys His

         35                  40                  45

ctt ctc gca gaa gca tgg gaa aag atc gcg agc cgc tct ggc atg tca  192

Leu Leu Ala Glu Ala Trp Glu Lys Ile Ala Ser Arg Ser Gly Met Ser

     50                  55                  60

tgt gac ggc aat gtc tgg ttc gaa cag gat cag ccg ctt tca tcg cct  240

Cys Asp Gly Asn Val Trp Phe Glu Gln Asp Gln Pro Leu Ser Ser Pro

 65                  70                  75                  80

tat atg gct gct ctc gct ttt aaa gca gcc gaa ctg caa gga cga aaa  288

Tyr Met Ala Ala Leu Ala Phe Lys Ala Ala Glu Leu Gln Gly Arg Lys

                 85                  90                  95

gcc ggc atg caa ttt ctc aga aat atg cag gag agc cta ttt gtt tca    336

Ala Gly Met Gln Phe Leu Arg Asn Met Gln Glu Ser Leu Phe Val Ser

            100                 105                 110

aag aaa aat att acg gat gaa aac gtg ctt ttg gag att gct gaa aat    384

Lys Lys Asn Ile Thr Asp Glu Asn Val Leu Leu Glu Ile Ala Glu Asn

        115                 120                 125

aca agt ctc gat ctt gaa gaa ttc aaa aaa gat ctg cat tct caa agc    432

Thr Ser Leu Asp Leu Glu Glu Phe Lys Lys Asp Leu His Ser Gln Ser

    130                 135                 140

gcg gtc aag gcg ctt caa tgt gac atg aaa att gct gcc gag atg gat    480

Ala Val Lys Ala Leu Gln Cys Asp Met Lys Ile Ala Ala Glu Met Asp

145                 150                 155                 160

gtt tct gtt aat ccg aca ctg acg ttt ttt aat acg cag cat gag gat    528

Val Ser Val Asn Pro Thr Leu Thr Phe Phe Asn Thr Gln His Glu Asp

                165                 170                 175

gaa ggg ctt aaa gtt cct ggc agc tac tca tat gat gta tat gaa gaa    576

Glu Gly Leu Lys Val Pro Gly Ser Tyr Ser Tyr Asp Val Tyr Glu Glu

            180                 185                 190

att tta ttt gag atg ctt ggc gac gag ccg aag ccg tcg gaa aca ccg    624

Ile Leu Phe Glu Met Leu Gly Asp Glu Pro Lys Pro Ser Glu Thr Pro

        195                 200                 205

cct tta gaa tgt ttt att gaa tat ttc cgc ttc gtt gcc tcg aag gaa    672

Pro Leu Glu Cys Phe Ile Glu Tyr Phe Arg Phe Val Ala Ser Lys Glu

    210                 215                 220

att gct ctt gta tat gac ctg agc ctt gaa gag gta gaa aaa gaa atg    720

Ile Ala Leu Val Tyr Asp Leu Ser Leu Glu Glu Val Glu Lys Glu Met

225                 230                 235                 240

aaa aaa ctg gcg ttt gct aaa aag gtt gcc aaa gtg gaa gcc aaa cac    768

Lys Lys Leu Ala Phe Ala Lys Lys Val Ala Lys Val Glu Ala Lys His

                245                 250                 255

gga atg ttt tgg aag tct ctc agc act tat tct gat gaa tat caa tca    816

Gly Met Phe Trp Lys Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Asp Glu Tyr Gln Ser

            260                 265                 270

tgt gaa aaa tag                                                    828

Cys Glu Lys

        275

<210>2

<211>276

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>2

Met Phe Val Asp Pro Leu Cys Pro Glu Cys Trp Ser Leu Glu Pro Val

  1               5                  10                  15

Ile Lys Lys Leu Lys Ile Arg Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Leu Arg Ile

             20                  25                  30

Ile Ala Ser Ala Ser Leu Thr Ala Leu Asn Lys Lys Arg Lys Lys His

         35                  40                  45

Leu Leu Ala Glu Ala Trp Glu Lys Ile Ala Ser Arg Ser Gly Met Ser

     50                  55                  60

Cys Asp Gly Asn Val Trp Phe Glu Gln Asp Gln Pro Leu Ser Ser Pro

 65                  70                  75                  80

Tyr Met Ala Ala Leu Ala Phe Lys Ala Ala Glu Leu Gln Gly Arg Lys

                 85                  90                  95    

Ala Gly Met Gln Phe Leu Arg Asn Met Gln Glu Ser Leu Phe Val Ser

            100                 105                 110

Lys Lys Asn Ile Thr Asp Glu Asn Val Leu Leu Glu Ile Ala Glu Asn

        115                 120                 125

Thr Ser Leu Asp Leu Glu Glu Phe Lys Lys Asp Leu His Ser Gln Ser

    130                 135                 140

Ala Val Lys Ala Leu Gln Cys Asp Met Lys Ile Ala Ala Glu Met Asp

145                 150                 155                 160

Val Ser Val Asn Pro Thr Leu Thr Phe Phe Asn Thr Gln His Glu Asp

                165                 170                 175

Glu Gly Leu Lys Val Pro Gly Ser Tyr Ser Tyr Asp Val Tyr Glu Glu

            180                 185                 190

Ile Leu Phe Glu Met Leu Gly Asp Glu Pro Lys Pro Ser Glu Thr Pro

        195                 200                 205

Pro Leu Glu Cys Phe Ile Glu Tyr Phe Arg Phe Val Ala Ser Lys Glu

    210                 215                 220

Ile Ala Leu Val Tyr Asp Leu Ser Leu Glu Glu Val Glu Lys Glu Met

225                 230                 235                 240

Lys Lys Leu Ala Phe Ala Lys Lys Val Ala Lys Val Glu Ala Lys His

                245                 250                 255

Gly Met Phe Trp Lys Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Asp Glu Tyr Gln Ser

            260                 265                 270

Cys Glu Lys

        275

<210>3

<211>149

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(147)

<400>3

atg ttt gtc gac cct tta tct ccc gaa tgc tgg gca ttg gag ccg gcg  48

Met Phe Val Asp Pro Leu Ser Pro Glu Cys Trp Ala Leu Glu Pro Ala

  1               5                  10                  15

atc aaa aag ttg aaa atc cgc tac ggc cgc ttt ttc aca cta agg atc  96

Ile Lys Lys Leu Lys Ile Arg Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Leu Arg Ile

             20                  25                  30

atc gcc gca tgc agc att aca gcg ctg aac gtt cag aaa cgc aaa aag  144

Ile Ala Ala Cys Ser Ile Thr Ala Leu Asn Val Gln Lys Arg Lys Lys

         35                  40                  45

cgc cg                                                           149

Arg

<210>4

<211>49

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400>4

Met Phe Val Asp Pro Leu Ser Pro Glu Cys Trp Ala Leu Glu Pro Ala

  1               5                  10                  15

Ile Lys Lys Leu Lys Ile Arg Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Leu Arg Ile

             20                  25                  30

Ile Ala Ala Cys Ser Ile Thr Ala Leu Asn Val Gln Lys Arg Lys Lys

         35                  40                  45

Arg