利用微生物生产酰胺化合物的方法

本发明涉及利用微生物生产酰胺化合物的方法，该微生物具 有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。

近年来，生物催化剂(如微生物)已广泛应用于化学反应中。例 如人们所熟悉的，可利用芽孢杆菌属、芽孢不动菌属、微球菌属或 短杆菌属(USP4,001,081)、棒状杆菌属或奴卡氏菌属(USP4, 248,968)、假单胞菌属(USP4,555,487)、红球菌属或微杆菌属 (EP-188,316)或镰刀菌属(JP-A-64-86889/1989)的某个菌 株，通过水合作用把腈化合物转变成酰胺化合物。

不过，所有这些微生物均属嗜常温性细菌，它们在55℃或更高 温度下不能生长。

此外，在高于室温的温度范围内，嗜常温性细菌把腈化合物转 为成其相应的酰胺化合物的水合作用活性也是不稳定的。由于这 个原因，利用这种嗜常温性细菌生产酰胺化合物通常是在较低温度 下进行的。在这种情况下，需要有冷却设备使反应器维持在较低温 度，而且因冷却消耗了大量能量，这些都导致生产成本的极大上升。

在这些情况下，本发明人极力寻找某些微生物，它们具有可在 高于室温的温度条件下把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的 水合作用活性。结果发明人发现，从(日本)冈山县某个温泉土壤中 分离出的嗜热性微生物符合这样的要求，从而完成了本发明。

因此，本发明提供了一种生产酰胺化合物的方法，其包括：在 细菌细胞培养液(内含完整的细菌细胞、破裂的细菌细胞或酶)存 在下或在经固定内含的完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶而形成的 固定化制剂存在下，通过水合腈化合物把该腈化合物转变成其相 应的酰胺化合物，其中的细菌细胞是具有把腈化合物转变成其相 应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性微生物的生物纯培养物 的细胞。

本发明还提供了一种新型嗜热性微生物的生物纯培养物，该 微生物具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活 性，将其命名为史密斯芽孢杆菌(B.smithii)SC-J05-1(FERM BP-4935)。

依照本发明的方法，可把许多腈化合物转变成其相应的酰胺 化合物。腈化合物的实例有脂族腈，如正丁腈、正戊腈、异丁腈、乙 腈和新戊腈；含卤素的腈，如2-氯丙腈；不饱和脂族腈，如丙烯腈、 丁烯腈和甲基丙烯腈；羟基腈化合物，如乳腈和扁桃腈；氨基腈化合 物，如2-苯基甘氨酸腈；芳族腈化合物；如苯并腈和氰基吡啶；二 腈化合物，如丙二腈、丁二腈和己二腈。优选的是正丁腈、正戊腈、异 丁腈、乙腈、新戊腈、2-氯丙腈、丙烯腈、丁烯腈、甲基丙烯腈、苯 并腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、丙二腈、丁二腈和 己二腈。

在细菌细胞培养液(内含完整的细菌细胞、破裂的细菌细胞或 酶)存在下或在经固定内含的完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶而 形成的固定化制剂存在下，通过水合腈化合物实现了腈化合物向 酰胺化合物的转变。细菌细胞是嗜热性微生物的生物纯培养物的细 胞，该微生物具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作 用活性。

本发明中所使用的微生物并没有特殊限制，只要其是具有将 腈化合物转变为其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性细 菌即可。这里所用的术语“嗜热性微生物”是指具有在55℃或更高 培养温度下生长能力的微生物。

例如，所需的微生物可通过下列程序得到。首先，采集自然界中 的土壤，把适量的采集土壤或将土壤完全悬浮于水中所得到的上 清液加入到熟知的微生物生长培养基(例如含有甘油、多胨、酵母 膏和麦芽汁主要成分的液体培养基或琼脂培养基)中，然后在55℃ 或更高的温度下培养24小时到3个月不等。把用这种方法得到的 培养液或所分离的部分细菌细胞铺覆在含有同上成分的琼脂平板 培养基上，随后进一步培养形成一些菌落，由此可分离出嗜热性微 生物。

由自然界中得到的或在各种微生物保藏机构保藏的嗜热性微 生物通过在含有上述培养基成分和腈化合物或酰胺化合物(如异 戊腈、丁烯腈或丁烯酰胺)的液体培养基的试管或烧瓶中，在55℃ 或更高的温度下培养适当的时间，例如12小时到7天不等而得以 生长。把培养液加入到腈化合物(如丙腈或丙烯腈)的水溶液中，在 例如30℃的温度下进行反应，时间约为10-60分钟。然后，检查反 应混合物以确定酰胺化合物是否生成，这样可能容易地找到具有 把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性 微生物。为了检测酰胺化合物，例如可使用如下所述的气相色谱分 析方法。

作为一个典型的实例，史密斯芽孢杆菌SC-J05-1可应用于 本发明的方法中。这个菌株是芽孢杆菌属的嗜热性微生物，本发明 人发现它具有水合腈化合物的腈基团的较高活性，该菌株于1993 年12月24日被寄存在日本工业科学技术会社的国立生物科学与 人类技术研究所中，登记号为FERM P-14037，后于1994年12 月14日转存于布达佩斯条约国际收藏中心，登记号为FERM BP -4935。该菌株已按中国专利法实施细则第25条的规定于1995 年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武 汉)，保藏号为CCTCC M94073。

史密斯芽孢杆菌SC-J05-1的细菌学特性如下：

(a)形态学

1．细胞形态与大小

形状：杆状

大小：0.5-0.8μm×0.8-2μm 2．多形性：无 3．游动性：灵活、周毛性鞭毛 4．孢子形成：已发现有 5．革兰氏染色：多变 6．抗酸性：无 (b)生长特性： 1．营养琼脂平板培养：圆、凸、无光泽、淡褐色 2．营养琼脂斜面培养：无光泽、淡褐色 3．营养液体培养：均匀性混浊生长 4．营养液体明胶穿刺培养：未液化 5．石蕊牛乳：无变化 (c)生理学特性： 1．硝酸盐还原：- 2．反硝化作用：- 3．甲基红试验：+ 4．VP试验：- 5．吲哚形成：- 6．硫化氢形成：+ 7．淀粉水解作用：- 8．柠檬酸利用 科泽氏培养基：± 9．无机氮源利用 NaNO3：- (NH4)2SO4：+ 10．色素形成： 金氏培养基A：- 金氏培养基B：- 11．脲酶：- 12．氧化酶：+ 13．触酶：-至± 14．生长条件 pH值：4.1-7.5 温度：30-60℃ 15．对氧气的反应：略为好氧 16．氧化-发酵试验：发酵 17．糖中的酸及气体形成

           酸   气体 L-阿拉伯糖：    -    - D-木糖：        +    - D-葡萄糖：      +    - D-甘露糖：      +    - D-果糖：        +    -

D-半乳糖：   +    -

麦芽糖：     +    -

蔗糖：       +    -

乳糖：       -    -

海藻糖：     +    -

D-山梨糖醇： -    -

D-甘露糖醇： +    -

肌醇：       +    -

甘油：       +    -

淀粉：       -    -

(d)其它特性：

1．DNA的Mol％G+C:40.6％

人们对表现出上述特性的微生物文献进行了广泛的检索，L. Ｋ.Nakamura等人在国际系统细菌学杂志(38期，63-73页， 1988年)上报导了史密斯芽孢杆菌表现出同上所述的特性。根据 这些结果，由本发明人所发现的菌株SC-J05-1被鉴定为史密斯 芽孢杆菌的一个菌株。

有关史密斯芽孢杆菌微生物具有把腈化合物转变为其相应的 酰胺化合物的水合作用活性这方面的信息尚不得而知。在这方面， 可以认为史密斯芽孢杆菌SC-J05-1(FERM BP-4935)是一个 新菌株。另外，从史密斯芽孢杆菌SC-J05-1(FERM BP-4935) 得到的菌株变种(即突变体、细胞融合菌株或重组菌株)也可用于本 发明的方法中。

本发明方法中所用的微生物培养物可以在多种含碳和氮源、有 机和(或)无机盐等的培养基中加以制备。这些培养基都已广泛应用 于制备普通细菌的培养物。

碳源的实例有葡萄糖、甘油、糊精、蔗糖、有机酸、动、植物油和 糖浆。

氮源的实例为有机和无机氮源，如肉汤、胨、酵母膏、麦芽汁、大 豆粉、玉米浆、棉籽粉、干酵母、酪蛋白氨基酸、硝酸钠和尿素。

有机和无机盐的实例有诸如钾、钠、镁、铁、锰、钴及锌等元素的 氯化物、硫酸盐、乙酸盐、碳酸盐和磷酸盐。其具体实例有氯化钾、氯 化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、 碳酸钙、碳酸钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠和磷酸二氢 钠。

在本发明的方法中，最好在培养基中加入腈化合物(如异戊腈 和丁烯腈)和酰胺化合物(如丁烯酰胺)，旨在提高所用微生物的腈 水合作用活性。例如，这些化合物用量可在每100ml培养基中约为 10mg-1g。

本发明方法中所用微生物的培养物可依据用于制备普通细菌 培养物的常规方法进行制备，如使用试管、往复或旋转振荡器的固 体或液体振荡培养，以及使用发酵罐的其它培养。

微生物的培养物通常是在有氧条件下进行培育的。特别是使用 发酵罐时，有必要导入无菌气体，导入速度通常为每分钟大约0.1 -2倍的培养体积。

培养温度可在所用微生物能在培养中存活的温度范围内变化。 例如，培养温度约为30℃-100℃。要对pH值加以控制，例如控制 在大约2-11。

特别是在培养史密斯芽孢杆菌时，培养温度应在约30℃- 100℃范围内，最好为约40℃-55℃，培养基的pH值范围约为5- 7。

培养时间可依据不同培养条件而定，通常约为1-7天。

例如，本发明的方法可按下述进行。

把细菌细胞、完整细菌细胞或经处理按上述方法制备的细菌细 胞而得到的材料在水或水溶液(如磷酸盐缓冲液)中悬浮，然后把 该悬浮液加入到腈化合物中进行反应。

这里所用的术语“经处理细菌细胞而得到的材料”是指所含的 破裂的细菌细胞或酶，是由诸如超声波分解、用法国压榨机进行的 均化作用或破裂作用等常规技术而得到的；或者是指依据固定化方 法(如载体载带方法，其中这些材料通过共价键、离子键、吸附等载 于适当的载体上)或者包含方法(其中这些材料被包含在聚合体的 网状结构中)，通过固定其中所合的完整或破裂细菌细胞或酶使其 在不能溶解之后处于易除去状态而得到的固定化制剂。

细菌细胞或经处理细菌细胞而得到的材料的通常使用浓度约 为0.01-20％(重量)，最好约为0.01-10％(重量)。就酶或固定化 制剂而言，其浓度可依其纯度或所用的固定化方法而变化；例如，优 选的是使制得的酶和固定化制剂具有与细菌细胞或经处理细菌细 胞而得到的材料水合腈基团之活性相似的活性。在加入腈化合物 之前，细菌细胞的培养液可在不进行任何进一步处理的条件下加以 使用。优选的是稀释或浓缩细菌细胞培养液使其具有与细菌细胞或 经处理细菌细胞而得到的材料水合腈基团之活性相似的活性。

反应条件通常为温度约为0-70℃，最好约为0-50℃，pH值 约为5-10，最好约为6-9，时间约为10分钟到72小时。当把pH 值控制在上述范围内时，细菌细胞能储集所生成的酰胺化合物，得 到高浓度的反应混合物。

这样生成的酰胺化合物可利用任何本领域内已知的常规方法 从反应混合物中加以回收。例如，可通过离心从反应混合物中分离 出细菌细胞或经处理细菌细胞而得到的材料，继而利用活性炭或离 子交换树脂进行处理以除去杂质。纯化的混合物经在减压条件下蒸 馏或蒸发加以浓缩，把析出的晶体在有机溶剂(如甲醇)中进行重结 晶，得到所需要的酰胺化合物。

以下实施例将进一步说明本发明，但不应被看作是限制本发 明的范围。

实施例1：细菌细胞的分离

在(日本)冈山县某处温泉采集土壤，把所采土样加入到含有 1.0％的甘油、0.5％的多胨、0.3％的酵母膏和0.3％的麦芽汁(以 上均为重量比)的培养基(pH值7.2)中，随后在约55℃条件下往 复振荡培养21天。将部分培养液铺覆在其组分同上所述的琼脂培 养基上，再次进行培养以形成一些菌落。

从这些菌落中分离出细菌细胞，把一菌环分离出的细菌细胞接 种到一液体培养基中，该培养基除合同上组分外，还含0.1％(重 量)的异戊腈，然后在55℃条件下培养24小时，得到的培养物作为 样品。然后，把1ml培养液加入到9ml2.78％(重量)的丙烯腈溶液 (0.05M磷酸盐缓冲液，pH值为7.7)中。在10℃下开始反应。10 分钟后，加入1ml 2N HCl停止反应。取反应混合物的等分试样，用 气相色谱法进行分析检查所产生的丙烯酰胺，以便筛选某些具有 水合腈基团活性的细菌菌株。这样，就得到了史密斯芽孢杆菌SC- J05-1，它作为一种嗜热性微生物，具有把腈化合物转变为其相应 的酰胺化合物的水合作用活性。

气相色谱条件：

柱：填充柱

载体：Porapak型Q(网眼80-100)

长度：1.1m

柱温度：210℃

载体气体的流速：50ml/分钟

样品注入体积：2μl

实施例2：用于检查嗜热特性的细菌细胞的培养

把从实施例1中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1的细菌 细胞和在JP-B62-21519/1987)中描述的嗜温性细菌(芽孢杆 菌种细菌，贮藏于法国Ecole Nationale Superieure des Agriculture的遗传学实验室收藏中心，贮藏号为R332；也贮藏于 日本工业科学技术会社的国立生物科学及人类技术研究所，登记 号为FERM P-2717；下文中被称做芽孢杆菌种细菌R332)的细 菌细胞分别铺覆在一营养琼脂平板培养基上，在不同温度条件下加 以培养以检查其生长能力。结果见表1。

                      表1 每种菌株的培养温     度(℃) 史密斯芽孢杆菌     SC-J05-1     (本发明) 芽孢杆菌种细菌      R332     (对照)     20     30     40     55     60     70     -     +     ++     ++     ++     -     ++     ++     +     -     -     -

标准：(-)不生长

      (+)生长

      (++)大量生长

从表1中可以看出，本发明的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1是 不同于作为对照的芽孢杆菌种细菌R332的一种嗜热性微生物。

实施例3：细菌细胞的培养

在容积500ml的坂口烧瓶中加入100ml灭菌培养基，培养基 pH值为7.2，含有1.0％的蔗糖、0.5％的多胨、0.3％的酵母膏、 0.3％的麦芽汁、0.001％的硫酸亚铁、0.001％的硫酸锰、0.001％的 氯化钴和0.001％的硫酸锌(以上均为重量比)。把0.1ml已在同 上培养基中培养过的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1培养液接种到 该烧瓶中。然后把这个烧瓶在55℃条件下往复振荡培养1天，振荡 速度为135次/分钟，这样就得到了史密斯芽孢杆菌SC-J05-1 细菌细胞的培养液。

参考实施例1：细菌细胞的培养

在容积500ml的坂口烧瓶中加入100ml灭菌培养基，培养基 pH值为7.2，含有1.0％的甘油、0.5％的多胨、0.3％的酵母膏、 0.3％的麦芽汁、0.001％的硫酸亚铁、0.001％的硫酸锰、0.001％的 氯化钴和0.001％的硫酸锌(以上均为重量比)。把0.1ml已在同 上培养基中培养过的芽孢杆菌种细菌R332培养液接种到这个烧 瓶中。然后把该烧瓶在30℃条件下往复振荡培养2天，振荡速度为 135次/分钟，这样就得到了芽孢杆菌种细菌R332细菌细胞的培养 液。

对比实施例1：耐热性

从400ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细 菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用 0.05M磷酸盐缓冲液(pH值7.7)冲洗后，把这些细菌细胞悬浮 在100ml的上述缓中液中。检查这样制备出的细菌细胞悬浮液把 腈化合物转变为其相应的酰胺化合物的水合作用活性。另外，为了 检查其耐热性，把同样的细菌细胞悬浮液在恒温条件下保持一段恒 定时间。

用下述程序来测试其把腈化合物转变为相应的酰胺化合物的 水合作用活性。在9ml2.78％丙烯腈溶液(0.05M磷酸盐缓冲液， pH值为7.7)中加入1ml测试溶液，在10℃下开始反应。10分钟 后，加入1ml2N HCl停止反应。

取反应混合物的等分试样，在与实施例1所述的相同条件下进 行气相色谱分析以确定所生成的丙烯酰胺量。

关于下文中所用的酶活性单位，把每分钟将1μmol丙烯腈转 变为丙烯酰胺的活性定义为一个单位(U)。

然后，从400ml参考实施例1中得到的芽孢杆菌种细菌R332 细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在 用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值7.7)冲洗后，将这些细菌细胞悬浮 在10ml的同上缓冲液中。用上述方法检查这样制备的细菌细胞悬 浮液把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。另 外，为了确定其耐热性，把同样的细菌细胞悬浮液在恒温下保持一 段恒定时间，然后检验其活性。活性的检测方法同上所述。根据检 测结果，计算每一菌株处理前后的相对活性(下文中被称做剩余活 性)，将芽孢杆菌种细菌R332的剩余活性定为100，据此换算出史 密斯芽孢杆菌SC-J05-1的剩余活性。

                            表2  处理温度    (℃)  处理时间    (℃) 史密斯芽孢杆菌    SC-J05-1 芽孢杆菌种细菌      R332     50     40     30     0.5     1.5     47     6542     280     212   (本发明)     100     100     100    (对照)

对比实施例2：反应稳定性

从实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌细胞 培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M 的磷酸盐缓冲液(pH值7.7)中洗后，把这些细菌细胞悬浮在同上 的缓中液中，得到20U/ml的细菌细胞悬浮液。

另外，从芽孢杆菌种细菌R332细菌细胞培养液中，以10,000 ×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH 值7.7)冲洗后，把这些细菌细胞悬浮在100ml的上述缓中液中，得 到20U/ml的细菌细胞悬浮液。

然后，将每种细菌细胞悬浮液1ml和2.78％(重量)丙烯腈溶 液(0.05M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.7)9ml相混合，分别在 30℃、40℃、50℃或60℃条件下进行反应。10分钟后加入1ml2N HCl停止反应。取反应混合物的等分试样，在如实施例1所述的相 同条件下进行气相色谱分析以确定所生成的丙烯酰胺量。根据从芽 孢杆菌种细菌R332得出的数值(定为100)分别换算出在不同温 度下所生成的丙烯酰胺的量。换算的数值如表3所示。

                   表3 反应温度(℃) 史密斯芽孢杆菌   SC-J05-1 芽孢杆菌种细菌     R332     30     40     50     60     275     657     5200     6200   (本发明)     100     100     100     100    (对照)

实施例4：利用细菌细胞培养液的反应

在100ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细 菌细胞培养液中加入2.5g(47.2mmol)的丙烯腈，反应在20℃下 进行并用磁力搅拌器加以搅拌。3小时后，取1.0ml的反应混合 物，在其中加入0.1ml的2N HCl停止反应。在如实施例1所述的 同样条件下对反应混合物的等分试样进行气相色谱分析。结果所有 部分的丙烯腈都完全转变成了丙烯酰胺，并且没有发现诸如丙烯酸 等副产物的形成。

实施例5：利用细菌细胞的反应

从150ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌细菌细胞培养液中， 以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M的磷酸盐 缓冲液(pH值7.7)冲洗后，把这些细菌细胞悬浮在50ml的相同 缓冲液中。在该悬浮液中分三部分加入3.0g(56.6mmol)的丙烯腈 反应在20℃下进行并用磁力搅拌器加以搅拌。4小时后，取1.0ml 的反应混合液，在其中加入0.1ml的2N HCl停止反应。对该反应 混合物的等分试样在如实施例1中所述的相同条件下进行气相色 谱分析。结果所有三部分丙烯腈都完全转变成了丙烯酰胺，并且没 有发现诸如丙烯酸等副产物的形成。

另外，以10,000×g离心10分钟把细菌细胞从剩余的反应混 合物中除去，并在低于50℃的条件下蒸馏浓缩上清液使晶体析出， 然后在甲醇中进行重结晶，得到3.7g(52.1mmol,92％产率)的无 色片状晶体。由熔点测定、元素分析、红外光谱和核磁共振光谱证实 了这些晶体是丙烯酰胺。

实施例6：使用酶溶液的反应

从8ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌 细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。中洗后， 把细菌细胞悬浮于300ml0.05M的HEPES-KOH缓冲液(pH 值7.2)，用法国压榨机以20,000磅/平方英寸破碎两次。将破裂细 胞以10,000×g离心30分钟以除去残留的细菌细胞。使用透析管 (Wako纯化学品有限公司生产)，在4℃、4次更换10mM HEPES -KOH缓中液(pH值7.2)条件下，透析上清液24小时。使透析 液滤过作为阴离子交换树脂的DEAE-Sepharose FF (Pharmacia)柱(50mmφ×200mm)(事先用0.05M的HEPES- KOH缓冲液(pH值7.2)加以平衡)，从而使酶吸附到柱上。

然后，把0.05M的HEPES-KOH缓冲液(pH值7.2)过柱进 行中洗，用0.05M的HEPES-KOH缓中液(pH值7.2，含0-1. 0M的氯化钾)进行梯度洗脱。对表现出把腈化合物转变成其相应 的酰胺化合物之水合作用活性的级分加以回收，在4℃、4次更换 10mM HEPES-KOH缓冲液(pH值7.2)条件下，用透析管 (Wako纯化学品有限公司生产)透析24小时。用阴离子交换色谱 法对透析液进行纯化，操作条件同上，只是用0.05mM的HEPES -KOH缓冲液(H值7.2，含0.2-0.8M的氯化钾)进行梯度洗 脱。用如上所述的方法对洗脱液进行透析，得到一种粗酶溶液。

可据下述方法确定其把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物 的活性：

首先，把1ml粗酶溶液加入到9ml100mM的丙腈水溶液(pH 值7.7)中，在10℃下开始反应。10分钟后，加入1ml2N HCl停止 反应。取反应混合液的等分试样，用气相色谱法加以分析以确定所 生成的丙酰胺量。

关于下文中所用的酶活性单位，把每分钟将1mmol丙腈转变 为丙酰胺的活性定义为一个单位(U)。

把这样得到的粗酶溶液用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH值7. 7)加以稀释。在100ml的这种稀释液中加入2.5g(47.2mmol)的丙 烯腈，反应在20℃下进行并用磁力搅拌器加以搅拌。3小时后，取 1.0ml反应混合物，加入0.1ml2N HCl停止反应。对该反应混合物 的等分试样进行气相色谱分析，操作条件同实施例1所述。结果， 所加入的所有部分的丙烯腈都完全转变成了丙烯酰胺，并且没有发 现诸如丙烯酸等副产物的形成。

实施例7：多种腈化合物的转化

在这个实施例中，检查了史密斯芽孢杆菌SC-J05-1中所含 的腈水合酶把多种腈化合物转化成其相应的酰胺化合物的能力。在 60个单位的实施例5中得到的粗酶溶液中，加入20ml0.05M的磷 酸盐缓冲液(pH值7.7)和1mmol表4中所示的每一种被测试的 腈化合物(作为底物)，在30℃下反应3小时。结果发现由史密斯芽 孢杆菌SC-J05-1制备的粗酶溶液具有把所有被测试的腈化合 物转化成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。用气相色谱法或液 相色谱法对反应混合物进行分析以确定所生成的酰胺化合物的量 或所消耗的腈化合物的量。

          表4     被测试的腈化合物 正丁腈 正戊腈 异丁腈 2-氯丙腈 丙烯腈 丁烯腈 3-氰基吡啶 4-氰基吡啶     丙二腈     丁二腈     己二腈     乙腈     新戊腈     甲基丙烯腈     苯并腈     2-氰基吡啶

根据本发明，即使在高于室温的条件下也能把多种腈化合物 稳定地转化为其相应的酰胺化合物，与通常在低温下进行的常规方 法相比，本发明的方法使得在一个较宽温度范围内高效生产高纯度 酰胺化合物成为可能。