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一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15‑07及其应用
申请号	CN201710290370.7	申请日	2017-04-28	公开(公告)号	CN107164257A	公开(公告)日	2017-09-15
申请人	南京农业大学;			发明人	高学文; 朱碧春; 顾丽; 伍辉军; 顾沁; 吴黎明;
摘要	本发明公开了一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15‑07及其应用。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）EZ15‑07，于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 13494。该菌株能在10℃生长，是一种低温适生菌。EZ15‑07对玉米细菌性褐腐病有较好的防治效果，其生防效果可达59.3%，具有很好的应用前景。
权利要求	1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) EZ15-07，于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 13494。 2.一种由权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07制备的生防菌剂。 3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于通过以下方法制备得到:将EZ15-07菌株接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间35-40小时至菌量达到2.06×109CFU/mL；其中Landy培养基组成为：20g 葡萄糖，5g L-谷氨酸，0.5g MgSO4，0.5g KCl，1g KH2PO4， 0.15mg Fe2SO4·6H2O，5.0mg MnSO4·H2O，0.16mg CuSO4·5H2O，pH7.0，1000mL蒸馏水。 4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在抑制玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌中的应用。 5.根据权利4所述的应用，其特征在于应用方法是发酵培养获得发酵液，对发酵液进行稀释后叶面喷施。 6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在制备防治玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌的生防菌剂中的应用。
说明书全文	一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15-07及其应用技术领域 [0001] 本发明属于生物技术和农业病害防治技术领域，涉及一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15-07及其应用。背景技术 [0002] 近年来在河北等地区大规模爆发了一种由菠萝泛菌(Pantoea ananatis)引起的玉米细菌性褐腐病，症状表现为叶梢枯死卷曲，叶脉产生黄色病斑，茎秆处黄褐色干腐。长期以来人们对玉米细菌性病害关注较少，由于缺乏有效的防控手段，玉米细菌性病害给农业生产带来的损失往往十分严重。 [0003] 我国是玉米生产和消费大国，玉米播种面积以及产量都位居世界第二。近年来，由于玉米播种面积扩大、气候条件变化、新品种的推广以及耕作制度的改变，玉米病害的发生呈上升趋势，给农业生产以及食品安全带来了严重危害。河北是玉米种植大省，无论种植面积还是产量均居华北地区首位，玉米病害是影响河北地区玉米产量与品质的主要原因。 [0004] 以往多采用化学农药防治田间病害的发生，但该种防治方式的弊端日渐突出：一方面容易使病原菌产生抗药性，另一方面更与国家大力倡导的“两减”政策相违背。目前，很多人开始从生防的角度来寻找答案，并且已经有很多生物农药应用于生产实践中，已经取得了很好的经济效益和生态效益。 [0005] 根际微生物种类繁多，其中，有很多细菌能够促进植物生长、防治植物病害、增加作物产量等，这类微生物一般被称为根围促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,简称PGPR)。他们与植物之间有很好的互利共生关系，不仅能使植物产生诱导抗病性，而且可以提高作物的产量和品质。所以，根围促生菌在植物病害防治中有很重要的应用价值。发明内容 [0006] 本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，有针对性地解决当前植物病害防治中存在的问题。该菌为低温适生菌，对玉米细菌性褐腐病菌等病原菌有抑菌效果，有潜在的生防价值。 [0007] 本发明的另一目的是提供该解淀粉芽孢杆菌的应用。 [0008] 本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07，于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.13494。 [0009] 所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494，是一种从南极企鹅聚集地土壤中分离得到的生防芽孢杆菌。经80℃水浴后稀释涂平板获得。 [0010] 所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494为革兰氏阳性细菌，杆状。 [0011] 所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494的16S rRNA的部分核苷酸具有如序列表SEQ ID NO.1所示序列。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494的gyrB的部分核苷酸具有如序列表SEQ ID NO.2所示序列。本发明涉及的菌株，参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译.农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，对其在生理生化上进行鉴定，以及16S rRNA和gyrB基因序列结果，经多相分类鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为EZ15-07。 [0012] 所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494能在10℃生长，是一种低温适生菌。 [0013] 一种由所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07制备的生防菌剂。 [0014] 所述的生防菌剂优选通过以下方法制备得到:将EZ15-07菌株接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇9 床转速为200rpm，发酵时间35-40小时至菌量达到2.06×10CFU/mL；其中Landy培养基组成为：20g 葡萄糖，5g L-谷氨酸，0.5g MgSO4，0.5g KCl，1g KH2PO4，0.15mg Fe2SO4·6H2O， 5.0mg MnSO4·H2O，0.16mg CuSO4·5H2O，pH7.0，1000mL蒸馏水。 [0015] 所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在抑制玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌中的应用。 [0016] 应用方法是发酵培养EZ15-07获得发酵液，对发酵液进行稀释后叶面喷施。 [0017] 所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在制备防治玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌的生防菌剂中的应用。 [0018] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株，是一种对玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌有良好防效的芽孢杆菌，是一种低温适生菌，对环境无污染，具有潜在的应用价值。附图说明 [0019] 图1EZ15-07生长情况 [0020] A为EZ15-07，B为对照菌株FZB42，C为EZ10-01 [0021] 图2EZ15-07对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌效果 [0022] 图3EZ15-07对玉米细菌性褐腐病的田间防效 [0023] A为CK，B为EZ15-07 [0024] 图4EZ15-07菌株对水稻白叶枯病菌的抑菌效果 [0025] 图5EZ15-07菌株对水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果 [0026] 图6EZ15-07对小麦赤霉病菌的抑菌效果 [0027] 图7EZ15-07对玉米轮枝镰孢菌的抑菌效果 [0028] 生物材料保藏信息 [0029] EZ15-07，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年12月26日，保藏地位为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13494。具体实施方式 [0030] 下面结合实施例进一步说明本发明。 [0031] 实施例1： [0032] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的筛选。 [0033] 用于分离的土壤样品均来自南极企鹅聚居地，土样采集于距地面10-15cm处。称取5g土样于45mL生理盐水中，摇床上震荡30分钟，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度，80℃水浴10min。吸取200μL涂LB平板，37℃过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划线纯化后编号保存。 [0034] 实施例2： [0035] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的抗低温筛选过程。 [0036] 具体实施步骤： [0037] 培养基： [0038] 1C培养基 [0039]成分浓度 1×1C 5×1C 蛋白胨 0.7 4.2g 21g 氯化钠 0.5 3g 15g 大豆粉 0.3 1.8g 9g 总体积加水至600mL 加水至600mL [0040] 土壤浸出液 [0041] [0042] 终培养基 [0043]成分终浓度体积(mL) 5×1C 1× 50 20％葡萄糖 0.1％ 1.25 土壤浸出液 10％ 25 水 173.75 [0044] 将菌株接种到上述液体培养基中，37℃培养过夜，取10μL菌液点到距离固体培养基平板中心2.5cm的十字交叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培养箱中培养，每天记录菌株生长情况，记录15天。该菌株能在温度≤10℃的环境中生长，我们将在此温度下，能在一周内显现菌落的菌株记为低温生长菌株。进一步测试该菌株可以在10℃的条件下生长，且平板培养7d后，将平板上显示出菌落的区域连同培养基一并从平板上剥离，置于离心管中并加入1mL无菌水震荡10min。震荡后取上清稀释涂平板计数。此时，菌量增长为5.85×107CFU/mL，是初始菌量的2.9倍。菌量的增长率是对照菌株FZB42的2.72倍。生长情况如附图1所示。 [0045] 实施例3： [0046] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。 [0047] 将该菌株接种于液体LB培养基，180rpm，37℃震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA，用正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，对16S rRNA基因进行PCR扩增，将其进行PCR产物回收以后送测序进行测序。PCR条件为：95℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。16S rRNA基因序列长度约为1400bp，在GenBank中与Bacillus amyloliquefaciens Rx-34相似性为99％。其结果如SEQ ID NO.1所示。 [0048] 实施例4： [0049] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的gyrB基因的PCR扩增和序列测定。 [0050] 将该菌株接种于液体LB培养基，180rpm，37℃震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA，用正向引物UP1f(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和反向引物UP2r(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)，对gyrB基因进行PCR扩增，将其进行PCR产物回收以后送测序进行测序。PCR条件为：95℃，4min；94℃，1min；62℃，1min；72℃， 2min；34cycle；72℃，10min，4℃保存。gyrB基因序列长度约为1200bp，在GenBank中与Bacillus amyloliquefaciens CC178相似性为100％。其结果如SEQ ID NO.2所示。 [0051] 参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译.农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，对其在生理生化上进行鉴定，以及16S rRNA和gyrB基因序列结果，经多相分类将细菌EZ15-07鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。 [0052] 实施例5： [0053] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的发酵培养。 [0054] 将EZ15-07菌株接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为38小时。其中Landy发酵培养基组成为：20g glucose，5g L-glutamic acid，0.5g MgSO4，0.5g KCl，1g KH2PO4，0.15mg Fe2SO4·6H2O，5.0mg MnSO4·H2O，0.16mg CuSO4·5H2O，pH7.0，1000mL distilled water。摇瓶发酵38h后菌量达到2.06×109CFU/mL。 [0055] 实施例6： [0056] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌作用。 [0057] 采用平板抑菌法，吸取5mL液体培养18h的玉米细菌性褐腐病病原菌菌液于放凉至50℃左右的LB培养基中摇匀后倒平板吹干。在上述平板中放入无菌滤纸片，吸取液体培养 18h的芽孢杆菌菌液5μL滴加于滤纸片之上，37℃恒温培养20h。观测EZ15-07对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直径为12.3mm，如附图2所示。 [0058] 实施例7： [0059] 通过发酵液能够抑制玉米细菌性褐腐病，具体过程为：对菌株EZ15-07进行发酵，发酵液稀释100倍后进行叶面喷施处理。在玉米的灌浆期进行叶面喷施，其生防效果可达59.3％。发酵培养条件为：将EZ15-07菌株接种在LB培养基上，过夜培养，然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30℃，摇床转速为200rpm,发酵时间为38小时。田间防效如附图3所示。 [0060] 实施例8： [0061] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对水稻白叶枯病菌的抑菌作用。 [0062] 采用平板抑菌法，在150mL的NA培养基中加入培养好水稻白叶枯病菌5mL，倒NA平板，每个平板放四个灭菌的滤纸片，然后吸取5μL的芽孢杆菌菌悬液滴在滤纸片上，28℃培养3天后观察结果。重复3次，观测菌株EZ15-07对水稻白叶枯病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直径为25.3mm，如附图4所示。 [0063] 实施例9： [0064] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对水稻细菌性条斑病菌的抑菌作用。 [0065] 采用平板抑菌法，在150mL的NA培养基中加入培养好水稻细菌性条斑病菌5mL，倒NA平板，每个平板放四个灭菌的滤纸片，然后吸取5μL的芽孢杆菌菌悬液滴在滤纸片上，28℃培养3天后观察结果。重复3次，观测菌株EZ15-07对水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直径为15.1mm，如附图5所示。 [0066] 实施例10： [0067] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对小麦赤霉病菌的抑菌作用。 [0068] 采用平板对峙法，倒好PDA平板，在平板中央放置直径1cm的小麦赤霉病菌菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上滴加5μL的芽孢杆菌发酵液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养3天，观测EZ15-07对小麦赤霉病菌的抑菌效果，抑菌圈平均直径为31mm，如附图6所示。 [0069] 实施例11： [0070] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对玉米轮枝镰孢菌的抑菌作用。 [0071] 采用平板对峙法，倒好PDA平板，在平板中央放置直径1cm的玉米轮枝镰孢菌菌块，在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上滴加5μL的芽孢杆菌发酵液，重复三次，在25℃光照培养箱中培养3天，观测EZ15-07对玉米轮枝镰孢菌的抑菌效果，抑菌圈平均直径为22mm，如附图7所示。

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