[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其用途。

[0002] 在生物圈中，微生物的生存范围是最广、最立体化的，微生物是生物界中一支数量无比庞大的队伍。无数事实生动地证明，自从人类认识微生物并逐步掌握其活动规律后，就可能做到使原来无利的微生物变为有利，小利者变大利，有害者变小害、无害甚至有利，从而大大地推动人类的进步。我国土地广袤，地形复杂，地跨寒、温、热三带，生态环境多样，是一个难得的微生物资源大国，由于历史等的原因，目前我国对土壤微生物的研究与应用离国际先进水平还有很大的差距。作为中华民族的子孙，有义务去努力挖掘我国的微生物种群资源，加强微生物资源的菌株保护与应用研究，为使我国科技水平赶超国际水平而努力。

[0003] 恶臭是指一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损害生活环境的气体物质，它是大气污染的一种形式。恶臭已成为当今世界七种典型公害中的一种并且已引起世界各国和人们的广泛关注。恶臭气体的种类主要有H2S、SO2、硫醇、氨、胺类、卤代烃等。恶臭气体主要来源有生活源与工业源。生活源是指日常生活中产生的恶臭，如家用卫生间、公厕、污水处理厂、垃圾转运站等；工业源是指工业生产中产生的恶臭，如造纸厂、化工厂、制药厂、农药厂、养殖厂、屠宰场、畜牧场污水处理厂等。不同的恶臭气体对周边环境造成极大的危害，严重影响了周边居民的身体健康因此，迫切需要加强对恶臭气体的治理。

[0004] 目前除臭研究工作主要集中在物理除臭、化学除臭和生物除臭三方面，生物除臭以除臭效率高、无二次污染、操作简单、成本低廉，成为目前治理恶臭环境的一个重要研究方向。

[0005] 申请号为201310442504.4的发明专利公开了一种生产除臭微生物制剂的方法，该方法通过将嗜热链球菌、恶臭假单胞菌、沼泽红假单胞菌、短小芽抱杆菌和屎肠球菌进行发酵，然后冷冻干燥，按比例混合后制成除臭剂，可消除不同环境中的恶臭气体。但是由于该生物除臭剂需要将五种不同微生物单独分别发酵后再混合制备而成，因此生产过程复杂，增加了生物除臭剂的生产成本。申请号为01129774.3的发明专利公开了一种微生物除臭剂及其制备方法与应用，该生物除臭剂仅由酵母菌属中的产朊酵母和小椭圆酵母两种酵母混合发酵制备而成，因此限制了该生物除臭剂的应用范围。

[0006] 本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷和不足，利用从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中分离选育而得到的一株解淀粉芽孢杆菌，进行菌株保藏的保护和菌株应用的研究，并提供解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001在复合微生物除臭剂生产中的应用，该复合微生物除臭剂除臭效果好、应用范围广、生产成本低。

[0007] 本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。

[0008] 一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中分离选育而得，菌株号为SQ-001，拉丁名称为Bacillus amyloliquefaciens，菌株SQ-001已于2016年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号楼，邮编100101，菌株保藏编号为CGMCC No.12917。

[0009] 所述的解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001，菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成芽孢，不膨大；常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，氧化酶，VP试验呈阳性，在7％的NaCl中生长，PH5.7生长，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐。

[0010] 所述的解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001是通过下列具体步骤而获得的：

[0011] A标本采集：从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中，采集土壤标本，保存备用；

[0012] B菌株分离：称取采集的土壤标本进行研磨，称取研磨后的土样1g，加入无菌水9mL经溶解震荡成1：10的土壤溶液，从上述土壤溶液中取出1mL加入9mL无菌水震荡成10-2的土-3 -4 -5壤稀释液，依此类推至10 、10 、10 的土壤稀释液后备用，采用涂抹法或混菌法进行平板接种成分离平皿；所述的涂抹法优选为：分别吸取上述5个浓度的土壤稀释液0.05mL，分别加入已制好的含有NA培养基的无菌平板上，用灭菌和玻璃刮刀将稀释液均匀涂布开，设三个重复；所述的混菌法优选为：分别吸取上述5个浓度的土壤稀释液各1mL，分别加入无菌空白培养皿中，将已熔化的45-50℃的NA培养基倒入，轻轻摇转使样品和培养基混合均匀，待培养基凝固，设三个重复。

[0013] C纯化培养：将上述分离平皿，恒温培养至单菌落长出，将具有解淀粉芽孢杆菌菌落形态特征进行标记，并及时挑取单菌落至含有NA培养基的平板上，采用划线分离法进行纯化并恒温培养，将纯化培养后的单菌落再转接至含有NA培养基的斜面管内，继续恒温培养，得到单菌落斜面管；所述的恒温培养优选为：28-37℃培养箱中恒温培养3-7天。

[0014] D液体培养：从单菌落斜面管内逐一挑取解淀粉芽孢杆菌，接种于液体培养基中，在旋转式摇床120-200rpm转速下，28-37℃培养12-48h，活菌孢子数达到107-109，得到适于保存的种子；

[0015] E菌株保存：将上述经液体培养后的解淀粉芽孢杆菌种子加入经过高温灭菌的甘油，使甘油在种子液中的浓度为25-50％(V/V)，制成解淀粉芽孢杆菌甘油冻存管，放在-80℃冰箱保存，或放在-196℃液氮罐中进行超低温保存。

[0016] 步骤B、C所述的NA培养基，其配方为：蛋白胨1g/100mL，牛肉膏0.3g/100mL，NaCl 0.5g/100mL，琼脂1.5g/100mL，PH值7.3。

[0017] 步骤D所述的液体培养基，其配方为：葡萄糖2.0g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母浸膏1.0g/100mL。

[0018] 本发明还同时提供了解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001在制备微生物除臭剂中的应用,所述的微生物除臭剂为复合微生物除臭剂，其采用所述的解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001与胶红酵母CGMCC No.2.4008、粪肠球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋杆菌CGMCC No.1.2830一起，通过纯种扩大培养、混菌发酵工艺而制得。

[0019] 所述的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，来源并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，胶红酵母菌的菌株保藏编号为CGMCC No.2.4008。

[0020] 所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，来源并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，粪肠球菌的菌株保藏编号为CGMCC No.1.2024。

[0021] 所述巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，来源并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，巴氏醋杆菌的菌株保藏编号为CGMCC No.1.2830。

[0022] 所述的复合微生物除臭剂，其混合菌活菌总数不少于3.0×1010cfu/mL。

[0023] 本发明中解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001经中国科学院微生物研究所检测鉴定，其16S rRNA基因序列和atpA基因序列如下：

[0024] 16S rRNA基因序列:

[0025] TCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCA

[0026] atpA基因序列:

[0027] GGCGACGCTTCAGTTCACGGTATGAAGCCAGGTCAAGACGCAATGTTCCA GCTACCTTTTTCATCGCTTTGATTTGGGCTGATCCGCCGACACGGGATACGGATAATCCGGCATTGATCGCAGGACGCACGCCTGAGAAGAATAGGTCGGATTGAAGGAAAATCTGTCCGTCAGTAATGGAAATGACGTTTGTCGGGATATAAGCGGAGATATCTCCTGCTTGTGTTTCGACGAACGGCAGCGCCGTAATTGATCCTGCGCCTTTTGCGTCACTCAGCTTGGCTGCGCGCTCAAGCAGACGGGAGTGAAGATAGAATACATCCCCAGGGAATGCTTCACGGCCCGGCGGACGGCGAAGAAGCAATGACAGCTCACGGTAAGCGGCCGCTTGTTTGGATAAATCATCATATACGACGAGAACGTGCTTGCCGTTGTACATGAATTCTTCACCCATTGTCACCCCTGCATACGGTGCAAGGTAAAGAAGCGGAGCCGGCTGTGAAGCGGACGCCGTCACGACAATCGTGTAATCAAGCGCGCCATGCTTACGAAGTGTTTCCACCACGCCGCGCACTGTAGATTCTTTTTGACCGATCGCTACGTACACACAGATCATGTCTTGATCTTTTTGGTTTAAGATTGTATCAATCGCAACAGATGTTTTACCTGTCTGACGGTCACCGATAATCAGCTCACGCTGTCCGCGGCCGATCGGAATTAACGCGTCAATCGCTTTGATACCCGTTTGCAGCGGCTCATGTACCGATTTACGGTCCATTACGCCTGGAGCCTGGCTTTCGATCGGACGTGTTTTGCTTGTCAGAATCGGACCCAGTCCGTCTACCGGCTGTCCTAACGGGTTGACGATACGTCCGATTAATTCTTCACCTACAGGAACTTCCATGATGCGGCCCGTTCTTTTGACCTCATCACCTTCACGGATATCTCTGTAAGGTCCTAAGATAACGATACCTACGTTGGATTCTTCAAGGTTTTGAGCCATACC。

[0028] 有益效果：

[0029] 本发明所得到的解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001，是从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中分离选育而得的，并于2016年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为CGMCC No.12917，为中国微生物菌种保藏中心增添了一株解淀粉芽孢杆菌菌株，丰富了国家微生物菌种保藏中心的解淀粉芽孢杆菌的种群库，为国家进一步开发利用好解淀粉芽孢杆菌的微生物种群资源提供了方便。

[0030] 本发明对所得到的解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001，成功地进行了菌株的应用研究。通过纯种扩大培养、混菌发酵工艺而制得了一种液体复合微生物除臭剂。该液体复合微生物除臭剂可以有效分解产生臭味的生物有机质，协同吸收利用各种恶臭气体，除臭效果好，应用范围广，生产工艺简单，生产成本低，活菌总量高，保藏方便，有利于大规模推广应用。

[0031] 解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001，菌株保藏编号为CGMCC No.12917，保藏日期2016年8月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0032] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0033] 实施例1

[0034] 解淀粉芽孢杆菌的菌株来源、菌株分离、基因序列测定

[0035] 菌株来源：从江西抚州市生活垃圾卫生填埋场的土壤中分离选育而得，菌株号为SQ-001，经中国微生物菌种保藏中心鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amgloliquefaciens)，并于2016年8月30日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该株解淀粉芽孢杆菌的菌株保藏编号为CGMCC No.12917。所述的菌株SQ-001，菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成芽孢，不膨大；常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，氧化酶，VP试验呈阳性，在7％的NaCl中生长，PH5.7生长，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐。

[0036] 所述的菌株SQ-001是通过下列具体分离步骤而获得的：

[0037] A标本采集：从江西抚州市生活垃圾卫生填埋场的土壤中，采集土壤标本，保存备用；

[0038] B菌株分离：称取采集的土壤标本约10g放在已灭菌的研钵内，在无菌操作台上研磨至土壤颗粒较均一为止；称取1g研磨好的土样置于无菌试管中，加入9mL无菌水充分震荡30分钟制成1：10的土壤稀释液，从上述溶液中取出1mL加入9mL无菌水充分震荡成10-2的土壤稀释液，依此类推至10-3、10-4、10-5的土壤稀释液后备用，采用涂抹法或混菌法进行平板接种；所述的涂抹法为：分别吸取上述5个浓度的土壤稀释液0.05mL，分别加入已制好的含有NA培养基的无菌平板上，用灭菌和玻璃刮刀将稀释液均匀涂布开，设三个重复；所述的混菌法为：分别吸取上述5个浓度的土壤稀释液各1mL，分别加入无菌空白培养皿中，将已熔化的45-50℃的NA培养基倒入，轻轻摇转使样品和培养基混合均匀，待培养基凝固，设三个重复。

[0039] C纯化培养：将上述分离平皿，放入30℃培养箱中恒温培养3-7天至单菌落长出，将具有解淀粉芽孢杆菌菌落形态特征进行标记并及时挑取单菌落至NA培养基平板上，采用划线分离的方法进行纯化并入30℃培养箱中恒温培养，将纯化培养后的单菌落再转接至含有NA培养基的斜面管内，继续于30℃培养箱中恒温培养3-7天，得到单菌落斜面管；

[0040] D液体培养：从单菌落斜面管内逐一挑取解淀粉芽孢杆菌，接种于液体培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养24h，活菌孢子数达到6×108左右，得到适于保存的种子；

[0041] E菌株保存：将上述经液体培养后的解淀粉芽孢杆菌种子加入经过高温灭菌的甘油，使甘油在种子液中的浓度为35％(V/V)，制成解淀粉芽孢杆菌甘油冻存管，放在-80℃冰箱保存，或放在-196℃液氮罐中进行超低温保存。

[0042] 基因序列测定：将解淀粉芽孢杆菌甘油冻存管送外进行基因序列测定，经中国科学院微生物研究所检测鉴定，其16S rRNA基因序列和atpA基因序列，具体见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

[0043] 实施例2

[0044] 复合微生物除臭剂的制备

[0045] (1)种子制备

[0046] 种子培养基：葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米浆2.5g/100mL，水，调pH为6.5。将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12917、胶红酵母CGMCC No.2.4008、粪肠球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋杆菌CGMCC No.1.2830菌接种于上述种子培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养24h，即得适于接种的种子。

[0047] (2)混菌液体发酵培养

[0048] 发酵培养基：葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.3g/100mL，玉米浆,4g/100mL，磷酸二氢钾0.03g/100mL，硫酸镁0.03g/100mL。将(1)中获得的醋酸菌种子按照发酵液体积的6％接种于发酵培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养12h后，再分别按照发酵液体积2％接入(1)中获得的解淀粉芽孢杆菌、胶红酵母和粪肠球菌种子，继续发酵培养30h即可获得混合微生物组合物。

[0049] (3)发酵结束后调整发酵液的pH值至3.0，然后将发酵液在0.06MPa真空度下保持15min以去除发酵液中的空气，得到含有处于休眠状态活菌的微生物除臭剂。

[0050] 实施例3

[0051] 复合微生物除臭剂的制备

[0052] (1)种子制备

[0053] 种子培养基：葡萄糖5g/100mL，酵母膏1g/100mL，玉米浆3g/100mL，水，调pH为6.0。将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12917、胶红酵母CGMCC  No.2.4008、粪肠球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋杆菌CGMCC No.1.2830菌接种于上述种子培养基中，在旋转式摇床
180rpm转速下，30℃培养24h，即得适于接种的种子。

[0054] (2)混菌液体发酵培养

[0055] 发酵培养基：葡萄糖3g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，黄豆粉4g/100mL，磷酸二氢钾0.05g/100mL，硫酸镁0.04g/100mL。将(1)中获得的巴氏醋杆菌种子按照发酵液体积的5％接种于发酵培养基中，在旋转式摇床170rpm转速下，30℃培养24h后，再分别按照发酵液体积6％接入(1)中获得的解淀粉芽孢杆菌、胶红酵母和粪肠球菌种子，继续发酵培养30h即可获得混合微生物组合物。

[0056] (3)发酵结束后调整发酵液的pH值至3.5，然后将发酵液在0.07MPa真空度下保持20min以去除发酵液中的空气，得到含有处于休眠状态活菌的微生物除臭剂。

[0057] 实施例4

[0058] 复合微生物除臭剂的应用

[0059] 在1L烧杯中加入200g新鲜牛粪，加入10mL本发明的复合微生物除臭剂，和粪便混匀后，用保鲜膜密封烧杯，同时以不加菌剂做对照，每组实验设置三个重复，5天后测定氨气、硫化氢和、吲哚等恶臭强度浓度。测定结果表明，加入复合微生物除臭剂组的恶臭去除率达到95％以上，而对照组对恶臭的去除率仅为10％左右。说明本发明的微生物制剂对牛粪具有很好的除臭效果，能有效的改善空气质量。

[0060] 实施例5

[0061] 复合微生物除臭剂的应用

[0062] 取100g新鲜垃圾平摊于5个培养皿中后，加入20mL本发明的复合微生物除臭剂，放于塑料袋中，充气50L后扎紧密封。分别设置投本发明的复合微生物除臭剂和自来水作为对照。每个处理设3个重复。7天后测定氨气、硫化氢和、吲哚等恶臭强度浓度。测定结果表明，加入复合微生物除臭剂组的恶臭去除率达到90％以上，而对照组对恶臭的去除率仅为15％左右。说明本发明的微生物制剂对垃圾具有很好的除臭效果，能有效的改善空气质量。

[0063] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。

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