[0001] 本发明涉及新型微生态制剂应用领域，具体涉及凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂应用于提高油鸡生产性能。

[0002] 饲用微生态制剂是采用农业部认可的动物肠道有益微生物经发酵、纯化、干燥而精制的复合生物制剂，是一种减少或替代抗生素的绿色生物添加剂。

[0003] 本发明涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1是从传统干酪中分离纯化出来的一株具有产中性蛋白酶的芽孢杆菌。

[0004] 1989年美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单共42种，其中包括凝结芽孢杆菌。我国农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》发布的饲料添加剂包括凝结芽孢杆菌，可饲喂于肉鸡、生长育肥猪和水产养殖动物。凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，在有氧条件下有利于繁殖菌体，在无氧条件下产生大量乳酸。该菌既具有乳酸菌产乳酸的特性，又具有良好的抗逆性。其芽孢对高温及低pH环境具有很强的耐受性，可顺利通过胃肠道逆环境，并发挥良好的益生效果，因此可用于制备微生态制剂。

[0005] 本发明涉及的产中性蛋白酶凝结芽孢杆菌Liu-g1用于发酵生产活菌制剂，可提高北京油鸡对饲料的消化吸收，从而提高油鸡的生产性能。此外，试验研究表明，该菌还能分泌α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类共同发挥作用，从而提高饲料利用率。

[0006] 目前，国内申请凝结芽孢杆菌饲用专利，其发明内容大多是饲用具有育肥作用的凝结芽孢杆菌，如发明专利CN 103255082A公开了“一株用于育肥猪养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用”，报道了饲喂凝结芽孢杆菌可以育肥仔猪；又如发明专利CN 103243043A公开了“一株用于改善次等猪苗养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用”，报道了一株凝结芽孢杆菌可改善猪苗的健康状况，提高次等猪苗养殖的生产性能；又如发明专利CN 103205377A公开了“一株用于肉鸡养殖的优良凝结芽孢杆菌及其应用”，报道了一株凝结芽孢杆菌能够调节肉鸡免疫能力、降低幼禽死亡率；又如发明专利CN 104403972A公开了“一株提高白羽肉鸡生长性能的凝结芽孢杆菌”，报道了从健康家禽的消化道内分离出的一株凝结芽孢杆菌能够提高白羽肉鸡生长性能，在白羽肉鸡的日粮中添加该凝结芽孢杆菌可以降低白羽肉鸡盲肠内的大肠杆菌数目和氨态氮浓度，并提高盲肠食糜的微生物多样性指数，同时降低了白羽肉鸡的死淘率和料肉比，提高了试验组肉鸡的日增重。

[0007] 目前有关凝结芽孢杆菌饲用育肥仔猪与提高白羽肉鸡的生长性能的方法已见专利报道。但是，关于利用产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌活菌制剂饲喂北京油鸡，提高北京油鸡生产性能的方法，尚未见国内外相关文献报道和专利报道。

[0008] 本发明的目的在于提供一种提高北京油鸡生产性能的方法。

[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0010] 本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1，分离筛选自传统干酪中，已于2015年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.10790。在脑心浸液(BHI)培养基上，凝结芽孢杆菌Liu-g1的菌落大小为2～4mm，灰白色、不透明、表面湿润、边缘不整齐，菌落表面初期(45℃，培养6～8h)扁平，后期皱褶凸起；菌体细胞呈大杆状，长短不一，中生芽孢，G+好氧嗜热菌。

[0011] 为了确定凝结芽孢杆菌在提高北京油鸡生产性能的作用，将该菌制成活菌制剂进行动物试验。

[0012] 所述方法中，选择体重相近、健康无病的4周龄的120只北京油鸡，随机分为4组，每组设3个重复，每个重复有北京油鸡10只；空白对照组不添加凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，只饲喂基础日粮；试验组在基础日粮中添加活菌数为7.4×1010CFU/g以上的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，并按低、中、高剂量活菌制剂，每个试验组添加量分别为1g/kg·d、0.1g/kg·d、0.01g/kg·d。饲喂添加菌剂饲料的时间为每天上午8:00～9:00，提前将120只油鸡禁食1h，确保其尽快将含菌饲料摄入，避免菌体在饲料中繁殖，以保证每日菌剂摄入量一致。采用三层阶梯式单鸡笼养鸡舍饲养北京油鸡，高床平养，每日光照16h。控温风机纵向负压通风，饮水器为乳头式，人工喂料，自由采食、自由饮水。正式试验周期为4～14周龄。每两周龄称量油鸡体重，并采集鸡粪便样品，测定其蛋白质含量，同时测定粪便中双歧杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的活菌数量。每两周龄采集血清样品，测定其血清蛋白含量。

[0013] 所述方法中，动物试验结果表明，将活菌数为7.4×1010CFU/g以上产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂添加到油鸡基础日粮中，添加量为0.1g/kg·d，饲喂含菌剂饲料至12～14周龄，可降低油鸡死亡率至3.3％(空白对照组为20％)，显著提高油鸡体重，改善肠道菌群，促进油鸡肠道中双歧杆菌有益菌的生长，而抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌的生长，并利用凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶的特性，达到显著提高饲料蛋白利用率及提高油鸡生产性能之目的。同时操作简单，成本低廉，适合规模化养殖北京油鸡。

[0014] 上述方法，利用高活菌数产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂提高北京油鸡生产性能的方法与专用生产菌株属于本发明保护范围。

[0015] 下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。

[0016] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0017] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。

[0018] 实施例1、产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备

[0019] 1、菌种活化

[0020] 将凝结芽孢杆菌Liu-g1斜面或平板培养物接种于装有灭菌的5mL BHI培养基试管中，于45℃转速为150r/min的摇床培养12h活化培养一代。而后以2％的接种量移种于装有灭菌的5mL基础培养基试管中，于37℃转速为150r/min的摇床培养48h活化培养二代，得到活化菌种。

[0021] 凝结芽孢杆菌Liu-g1基础培养基配方为(质量体积比浓度，W/V)：1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％NaCl，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

[0022] 2、高密度发酵

[0023] 将1L发酵培养基装入5L自动发酵罐中，活化好的Liu-g1菌种以2％的接种量移入发酵罐中进行高密度分批发酵，控制发酵温度45℃，发酵液初始pH7.5，搅拌转速180～220r/min，发酵时间48h，得到活菌数为(9.5～9.8)×109CFU/mL凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵液。

[0024] 凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵培养基配方为(质量体积比浓度，W/V)：1％玉米淀粉，1％大豆粕，0.2％碳酸钙，蒸馏水1000mL，pH7.5。

[0025] 3、活菌制剂的制备

[0026] 取1L凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵液于4℃、5000r/min离心15～20min，弃上清液，收集菌泥；将冻干保护剂分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为100mL；每瓶加入1L发酵液离心所得的菌泥(即冻干保护剂∶离心前发酵液＝1∶10体积)，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂；将浓缩活菌制剂于-36℃低温冰箱中预冻12h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于-55℃、真空度0.18mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂，于-35℃低温保藏待用。

[0027] 以PCA琼脂培养基倾注平板培养法测定冻干菌粉的活菌数量，取10-8、10-9、10-10三个稀释度设3次重复，45℃恒温箱培养12～16hh，计数活菌制剂中Liu-g1菌株的活菌数为7.4×1010CFU/g。

[0028] 3、动物试验

[0029] 选择体重相近、健康无病的4周龄的120只北京油鸡，随机分为4组，每组设3个重复，每个重复有北京油鸡10只；空白对照组不添加凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，只饲喂基础日粮；试验组在基础日粮中添加活菌数为7.4×1010CFU/g以上的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，并按低、中、高剂量活菌制剂，每个试验组添加量分别为1g/kg·d、0.1g/kg·d、0.01g/kg·d。饲喂添加菌剂饲料的时间为每天上午8:00～9:00，提前将120只油鸡禁食1h，确保其尽快将含菌饲料摄入，避免菌体在饲料中繁殖，以保证每日菌剂摄入量一致。

[0030] 试验采用三层阶梯式单鸡笼养鸡舍饲养北京油鸡，高床平养，每日光照16h。控温风机纵向负压通风，饮水器为乳头式，人工喂料，自由采食、自由饮水。正式试验周期为4～14周龄。每两周龄称量油鸡体重，并采集鸡粪便样品，凯氏定氮法测定其蛋白质含量，同时测定粪便中双歧杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的活菌数量。每两周龄采集血清样品，测定其血清蛋白含量。试验结果如下：

[0031] (1)油鸡死亡率

[0032] 表1凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡死亡率的影响

[0033]

[0034] 观察死亡油鸡生病期间排白色黏稠或淡黄、淡绿色稀便，萎靡不振，食量减少，最终死亡。试验期间各剂量组油鸡死亡率见表1。其中，中剂量组油鸡死亡率最低，仅为3.3％，而空白对照组死亡率高达20.0％，远高于试验组，说明基础饲料中添加中剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以抑制肠道致病菌的生长，而促进肠道有益菌的生长。

[0035] (2)油鸡体重

[0036] 表2凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡体重的影响( n＝30)(g)

[0037]

[0038] 注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著。

[0039] 体重是衡量机体对饲料利用的最直接指标之一。由表2可见，基础日粮中添加凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂试验组与空白对照组油鸡体重随着饲喂周期的延长，逐渐显示它们之间的差距。至12～14周龄，高、中剂量组的油鸡体重显著高于空白对照组(P＜0.05)，说明基础日粮中添加高、中剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以显著提高油鸡体重。

[0040] (3)油鸡粪便蛋白质含量

[0041] 表3凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡粪便粗蛋白含量的影响( n＝15)(％)[0042]

[0043] 注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著.

[0044] 粪便中粗蛋白的含量越低说明油鸡对饲料中蛋白质的利用率越高。由表3可知，随着饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的周期时间延长，各试验组油鸡粪便中粗蛋白含量呈下降趋势。至12～14周龄，高、中、低剂量组油鸡的粪便粗蛋白含量显著低于空白对照组(P＜0.05)，说明基础日粮中添加高、中、低剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以显著提高油鸡饲料的蛋白利用率。

[0045] (4)油鸡粪便中双歧杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的活菌数量[0046] 表4凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡肠道双歧杆菌数量的影响( n＝15)(lg CFU/g)

[0047]

[0048] 由表4可知，随着饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的周期时间延长，各试验组油鸡粪便中双歧杆菌的活菌数量呈上升趋势。试验组油鸡粪便中双歧杆菌的活菌数量均高于空白对照组。至8～14周龄，中剂量组双歧杆菌的活菌数量达到106CFU/g以上，说明基础日粮中添加中剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以促进油鸡肠道中双歧杆菌有益菌的生长，从而有利于改善肠道健康。

[0049] 表5凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡肠道大肠杆菌数量的影响( n＝15)(lg CFU/g)

[0050]

[0051] 多数不致病的大肠杆菌是动物肠道中的正常栖居菌，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对机体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。由表5可知，随着饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的周期时间延长，各试验组油鸡粪便中大肠杆菌的活菌数量与空白对照组相比几乎无差异，说明基础日粮中添加高、中、低剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，对油鸡肠道中大肠杆菌几乎没有影响。

[0052] 表6凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡肠道沙门氏菌数量的影响( n＝15)(lg CFU/g)

[0053]

[0054] 由表6可知，随着饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的周期时间延长，各试验组油鸡粪便中沙门氏菌活菌数量均低于空白对照组。其中，高、中剂量组油鸡粪便中沙门氏菌的活菌数量低于空白对照组1～2个数量级，说明基础日粮中添加高、中剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以抑制肠道中沙门氏菌有害菌的生长，因而有利于改善肠道健康。

[0055] 表7凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡肠道金黄色葡萄球菌数量的影响( n＝15)[0056]                                                          (lg CFU/g)[0057]

[0058] 由表7可知，随着饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的周期时间延长，各试验组油鸡粪便中金黄色葡萄球菌的活菌数量均低于空白对照组。至12～14周龄，高、中、低剂量组油鸡粪便中金黄色葡萄球菌的活菌数量低于空白对照组1～2个数量级，说明基础日粮中添加高、中、低剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以抑制肠道金黄色葡萄球菌有害菌的生长，从而有利于改善肠道健康。

[0059] (5)油鸡血清尿素氮含量

[0060] 表8凝结芽孢杆菌Liu-g1对油鸡血清尿素氮含量的影响( n＝10)(mmol/L)[0061]

[0062] 注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著。

[0063] 尿素氮是体内蛋白质分解代谢的主要产物之一，直接反映蛋白质代谢水平和营养情况，其含量越低表明氮的利用率越高，即蛋白质合成代谢加强，分解代谢降低。由表8可见，随着饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的周期时间延长，各试验组油鸡血清中尿素氮含量呈下降趋势，至12～14周龄，中剂量组油鸡血清中尿素氮含量显著低于空白对照组(P＜0.05)，说明基础日粮中添加中剂量的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂，可以显著降低油鸡血清中尿素氮含量，可以促进油鸡对饲料中氮的利用率，加强机体蛋白质合成，提高油鸡的体重，故而提高油鸡的生产性能。

[0064] 综上所述，动物试验结果表明，本发明将活菌数为7.4×1010CFU/g以上产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂添加于北京油鸡基础日粮中，添加量为0.1g/kg·d，饲喂含菌剂饲料至12～14周龄，能够降低油鸡死亡率至3.3％(空白对照组为20％)，显著提高油鸡体重，改善肠道健康，促进油鸡肠道中双歧杆菌有益菌的生长，而抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌的生长，并利用凝结芽孢杆菌Liu-g1产中性蛋白酶的特性，显著提高饲料蛋白利用率，加强机体蛋白质合成，故而提高油鸡的生产性能。显示本发明所述凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂具有良好提高油鸡生产性能的作用，对规模化饲养北京油鸡具有较大的经济效益和社会效益。

[0065] 本专利所属项目1：转基因生物新品种培育重大专项“抗病转基因羊新品种培育”[0066] 项目编号：2014ZX08008-005

[0067] 项目起止时间：2014.01-2015.12

[0068] 项目负责人：刘慧