[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及一株短小芽孢杆菌及其在解磷解钾产酸中的应用。

[0002] 我国大多数土壤中磷含量较低，因为土壤中的磷主要以磷酸盐的形式存在而不利于植物的吸收利用。虽然施加磷肥，可以保证作物对磷的吸收，但却易造成土壤板结与环境的污染，不利于可持续农业的发展。在自然界中存在着一类溶磷微生物，它们能将土壤中难溶态的磷转化为可供植物吸收利用的有效态磷。溶磷菌之所以能提高土壤中有效磷的含量是因为溶磷菌在自身的代谢过程中能分泌一些酸性物质，这些酸性物质与土壤中的磷酸钙等难溶态磷作用之后产生了可供植物吸收利用的有效磷。钾也是植物生长所必需的三大营养元素之一，它可促进植物茎秆健壮及改善果实的品质。钾一般以云母、钾长石等难溶态钾的形式存在于土壤中而不利于植物的吸收利用。解钾微生物能将土壤中难溶态的钾转化为可供植物吸收利用的速效钾从而促进植物的生长。许多研究表明解钾菌通过分泌有机酸的能力促进植物对磷及钾的吸收从而促进作物的生长。

[0003] 芽孢杆菌广泛地存在于自然界，具有繁殖快速、代谢快的特点。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。尤其是该属的许多菌能水解淀粉，分解蛋白质、果胶、藻酸盐等，工业上用于提取淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。它们也存在于土壤、植物组织内、水和空气中，与自然界物质转化、土壤肥力、环境卫生均密切相关。同时它们对有机质分解力强，增殖的同时，会释放出高活性的分解酵素，合成多种有机酸、酶、生理活性等物质，及其它多种容易被利用的养分，促进作物生长。随着土壤的生物多样性退化及土壤碱化，芽孢杆菌能够在逆境中存活和生长，为土壤提供各种酶类和增加土壤微生物多样性。筛选能够产酸的芽孢杆菌应用在碱性土壤，促进作物生长具有重要的意义。

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YJ04。所述菌株为具有解磷、解钾能力、同时具有产酸能力、生长势良好、对环境适应性强等特征的短小芽孢杆菌菌株。

[0005] 本发明的另一目的在于提供所述菌株在解磷、解钾、产酸中的应用。所述短小芽孢杆菌产酸菌株的应用能够释放土壤中难溶磷、钾为可溶性磷、钾，大大提高土壤中磷、钾的利用率，改善农产品品质，有效提高农作物的产量。

[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

[0007] 一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YJ04，所述菌株于2016年3月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：60019，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)；保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

[0008] 现有已公开的解磷解钾芽孢杆菌主要是巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，短小芽孢杆菌很少见，而本发明公布的短小芽孢杆菌解磷、解钾量分别为21.56mg.L-1和20.62mg.L-1，溶液pH值降为3.0～3.2之间，经查找已有公开的短小芽孢杆菌基本没有能降低溶液pH值的试验结果。因此，本发明相较于现有技术具有意想不到的技术效果。

[0009] 所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YJ04菌株具有如下形态和生理、生化特性：

[0010] a、菌体形态特性：短小芽孢杆菌YJ04为革兰氏阳性菌，细胞呈短杆状，圆末端，单个或呈短链排列。能够产生椭圆形芽孢，中生或次端生。

[0011] b、菌落形态特性：菌落在LB培养基(胰蛋白胨(Tryptone)10g.L-1，酵母提取物(Yeast extract)5g.L-1，氯化钠(NaCl)10g.L-1，pH自然，固体培养基加琼脂18g.L-1)平板上生长速度较快，菌落圆形，半透明。30℃，生长48小时，菌落直径5-7毫米。生长温度范围10℃-45℃及pH生长范围为3.0-8.0，最佳pH值生长范围5.0-7.0。细胞短杆状，形成芽孢，细胞大小0.7-0.8μm x1.9-2.8μm，中生或次端生芽孢。

[0012] c、生理生化特性：革兰氏阳性，菌株在改良PDA液体培养基上生长产酸，使培养液的pH值由6.7降低到pH3.0左右。淀粉水解、甲基红试验、产氨试验、吲哚试验、过氧化氢酶，脲酶试验均为阳性，VP(voges proskauer)试验、明胶液化阴性。能以淀粉、糊精、N–乙酰基–D–葡萄糖胺、侧金盏花醇、L–阿拉伯糖、D–海藻糖、D–阿拉伯糖、赤藻糖醇、D–纤维二糖、D–果糖、龙胆二糖、L–果糖、α–D–葡萄糖、m–肌醇、α–D–乳糖、麦芽糖、D–甘露醇、D–蜜二糖、D，L–乳酸、β–甲基–D–葡萄糖苷、阿洛酮糖、D–棉子糖、蔗糖、D–山梨醇、松三糖、顺–乌头酸(丙烯三羧酸)、柠檬酸、D–半乳糖醛酸、L–组氨酸、D–葡萄糖酸、β–羟基丁酸、α–酮戊二酸、丙二酸、奎尼酸、D–丙氨酸、溴丁二酸、琥珀酸、癸二酸、D–葡萄二酸、L–丙氨酸、L–天门冬氨酸、L–丙氨酰甘氨酸、L–天冬酰胺酸、羟基–L–脯氨酸、6–磷酸葡萄糖、L–谷氨酸、甘氨酰–L–天门冬氨酸、L–丝氨酸、己六醇、L–焦谷氨酸、L–脯氨酸、L–苏氨酸、尿苷、丙三醇、γ–氨基丁酸、苯丙氨酸、1–磷酸葡萄糖为碳源的培养基上生长。pH生长范围pH3.0-pH8.0；对NaCl较敏感，在低于3.5％NaCl浓度下可生长；菌株对卡拉霉素、庆大霉素敏感，低浓度(5μg.mL-1)的这两种抗生素就能抑制其生长；对链霉素、新霉素和四环素的耐受性差、较低浓度(50μg.mL-1)的这几种抗生素就能抑制其生长。可在低于100μg.mL-1的氨苄青霉素、5μg.mL-1红霉素和氯霉素培养基上生长。

[0013] 进一步地，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

[0014] 一种具有解磷、解钾及产酸效果的接种剂，含有短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YJ04菌株。

[0015] 优选地，所述菌株的发酵液浓度为3×109～5×109CFU.mL-1，按1L发酵液与2kg蛭石的比例混合，制备成菌数达1.5～2.5×109CFU.g-1的接种剂。

[0016] 一种促进农作物生长的方法，将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YJ04菌株制成液体或固体菌剂或菌肥，将所述菌剂或菌肥用于种植农作物。

[0017] 优选地，所述农作物为水稻或油麦菜。

[0018] 与现有技术相比，本发明有益效果在于：

[0019] 本发明提供了一株来源于药用野生稻植物组织内生的短小芽孢杆菌YJ04，所述菌株在含Ca3(PO4)2和钾长石的培养基上具有明显解磷解钾效果，在含淀粉碳源培养基上能够显著降低pH值，具有产酸能力。所述的短小芽孢杆菌能够显著地促进水稻、油麦菜等作物的生长和提高产量，可应用于各种农作物种植应用。在经本发明的短小芽孢杆菌处理后，显著促进水稻、油麦菜等作物的生长。附图说明

[0020] 图1为短小芽孢杆菌YJ04的芽孢染色结果图；标尺1μm。

[0021] 图2为短小芽孢杆菌YJ04的解磷(A)、解钾(B)效果。

[0022] 图3为短小芽孢杆菌YJ04促油麦菜生长效果(A)；(B)为未施用短小芽孢杆菌对照。

[0023] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0024] 实施例1菌株的分离

[0025] 本发明菌株的分离纯化方法如下：将采集的新鲜药用野生稻样本用蒸馏水洗净，然后剪下根置于已灭菌的培养皿中，用3％的双氧水(H2O2)浸泡4min(以除去根表面的腐烂物质)，无菌水洗涤一次，再用0.1％的升汞(HgCl2)浸泡5min，无菌水中振动洗涤5～7次，每次5～10min，并将最后一次洗涤液涂布于LB固体培养基上，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的根用已灭菌手术刀切碎，接种到装有5ml LB液体培养基的试管中，胶塞密封后，置于30℃的人工培养箱内进行培养，整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，将含有菌液试管置于80℃处理20分钟，杀死非芽孢菌，取50μL、100μL和200μL分别涂布于含酚红指示剂的LB平板上(酚红在培养基中用作pH值的指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色)。30℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落(并记录产酸、产碱性状)分别再涂平板，直至菌落的形状、颜色、质地、透明度一致。最后通过简单染色和镜检，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。

[0026] 保存：将分离纯化后的菌株在分离培养基平板及斜面上培养2～3d后，收集平板上的菌体。部分保存于15％灭菌甘油中(-20℃)和(-80℃)。

[0027] 实施例2鉴定及保藏

[0028] 实施例1分离得到的一株短小芽孢杆菌具有如下形态和生理、生化特性：

[0029] a、菌体形态特性：短小芽孢杆菌的细胞为革兰氏阳性菌，细胞短杆状，形成芽孢，大小0.7～0.8μm x 1.9～2.8μm，中生或次端生芽孢(见图1)。

[0030] b、菌落形态特性；菌落在LB培养基平板上生长速度较快，菌落圆形，乳白色，半透明。30℃，生长48小时，菌落直径5～7mm。

[0031] c、生理生化特性：兼性厌氧，革兰氏阳性，菌株在改良PDA液体培养基上生长产酸，使培养液的pH值由6.7降低到pH3.0左右。淀粉水解、甲基红试验、产氨试验、吲哚试验、过氧化氢酶，脲酶试验均为阳性，VP(voges proskauer)试验、明胶液化阴性。能以淀粉、糊精、N–乙酰基–D–葡萄糖胺、侧金盏花醇、L–阿拉伯糖、D–海藻糖、D–阿拉伯糖、赤藻糖醇、D–纤维二糖、D–果糖、龙胆二糖、L–果糖、α–D–葡萄糖、m–肌醇、α–D–乳糖、麦芽糖、D–甘露醇、D–蜜二糖、D，L–乳酸、β–甲基–D–葡萄糖苷、阿洛酮糖、D–棉子糖、蔗糖、D–山梨醇、松三糖、顺–乌头酸(丙烯三羧酸)、柠檬酸、D–半乳糖醛酸、L–组氨酸、D–葡萄糖酸、β–羟基丁酸、α–酮戊二酸、丙二酸、奎尼酸、D–丙氨酸、溴丁二酸、琥珀酸、癸二酸、D–葡萄二酸、L–丙氨酸、L–天门冬氨酸、L–丙氨酰甘氨酸、L–天冬酰胺酸、羟基–L–脯氨酸、6–磷酸葡萄糖、L–谷氨酸、甘氨酰–L–天门冬氨酸、L–丝氨酸、己六醇、L–焦谷氨酸、L–脯氨酸、L–苏氨酸、尿苷、丙三醇、γ–氨基丁酸、苯丙氨酸、1–磷酸葡萄糖为碳源的培养基上生长。pH生长范围pH3.0-pH8.0；对NaCl较敏感，在低于3.5％NaCl浓度下可生长；菌株对卡拉霉素、庆大霉素敏感，低浓度(5μg.mL-1)的这两种抗生素就能抑制其生长；对链霉素、新霉素和四环素的耐受性差、较低浓度(50μg.mL-1)的这几种抗生素就能抑制其生长。可在低于100μg.mL-1的氨苄青霉素、5μg.mL-1红霉素和氯霉素培养基上生长。

[0032] 该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

[0033] 所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)分子分类地位的确定：采用细菌16S rRNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定。将获得的DNA序列输入GenBank进行Blast比对，初步确定本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的短小芽孢杆菌属于芽孢杆菌属(Bacillus)，与T
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)模式菌株DSM 27同源性为99.8％，但二者的序列不完
全一致，有0.2％的差异，表明二者是同种内不同的菌株。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析及文献查阅，本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)应归属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

[0034] 本发明所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus YJ04)已于2016年3月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：60019，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)；保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

[0035] 本发明的菌种可作为解磷、解钾及产酸效果的接种剂以促进水稻、油麦菜等作物生长。如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于30℃培养48小时，菌数达3×109～5×109CFU.mL-1，用蛭石作载体。按1L短小芽孢杆菌发酵液与蛭石发酵液与2kg蛭石的比例混合，制备成菌数达1.5～2.5×109CFU.g-1的菌剂。

[0036] 实施例3解磷、解钾效果

[0037] 将分离纯化到的短小芽孢杆菌进行活化后，用无菌水制成浓度为108细胞.mL-1的菌悬液，吸取10μL菌悬液分别点植于解磷筛选PKO平板及解钾细菌筛选平板，于30℃细菌培养箱中培养48h，观察有无透明圈生成，测定透明圈直径(L)、菌落直径(D)。试验的短小芽孢杆菌在解磷筛选PKO平板及解钾细菌筛选平板中得L/D比值分别为1.29和1.15(见图2)，相对应的解磷、解钾量分别为21.56mg.L-1和20.62mg.L-1。

[0038] 解磷筛选PKO培养基(1L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.03g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.003g，Yeast extract 0.5g，Agar 15-20g，Ca3(PO4)2 5g，pH 6.8-7.0。

[0039] 解钾细菌筛选培养基(1L)：钾长石2.5g，Na2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO3 5g，Glucose 10g，CaSO4·7H2O 0.1g，Agar 15-20g，pH 6.8-7.0。

[0040] 实施例4发酵产酸试验

[0041] 在1L如下发酵液中，含有葡萄糖5g，淀粉5g，土豆汁液500mL(200g土豆切薄片于500mL水中煮沸腾，过滤)，KH2PO4 0.02g，氯化钠0.5g，K2HPO40.02g，溶液初始pH值为6.6，室温下发酵3～7天，溶液pH值降为3.0～3.2之间。

[0042] 实施例5促水稻生长效果

[0043] 采用盆栽法试验解磷、解钾、产酸的短小芽孢杆菌YJ04菌株接菌水稻品种中嘉早17号的效果。

[0044] 将菌株活化后，在对数生长期内，制成菌悬液108细胞.mL-1浓度浸泡有12d苗龄的水稻苗根部36h，对照用无菌水浸泡。然后转接到装有540g水稻土的塑料大杯中，每个塑料大杯中再加入50mL植物少氮营养液，3个重复，放室温下进行培养。每天及时观察、添加水。培养观察至20d后，试验组加入相应的浓度为108细胞.mL-1的菌液30mL及50mL植物少氮营养液，对照组加入等量无菌水及50mL植物无氮营养液。继续培养观察至15d后拍照记录，并测定水稻的叶长、根长、分蘖数、鲜重、干重及根重。

[0045] 植物少氮培养液成分：硝酸钙0.003％，硫酸钙0.046％，磷酸氢二钾0.0136％，氯化钾0.0075％，硫酸镁0.0046％，柠檬酸铁0.0075％，微量元素液1ml；微量元素液组成：H3BO3 2.86g，MnSO4 1.81g，ZnSO4 0.22g，CuSO4 0.8g，H2MoO4 0.02g，H2O 1000mL。

[0046] 短小芽孢杆菌YJ04接种水稻经盆栽培养35d后，拍照并测量水稻的叶长、根长、分蘖数、鲜重、干重及根重。结果见表1。由表1可以看出，短小芽孢杆菌YJ04接种水稻之后，与没有接种菌株的对照相比水稻的叶长、根长、鲜重、根重都达到了显著差异，对水稻有明显的促生作用。其中叶长增加了35.3％，根增长了42.7％，鲜重增加了81.9％，干重增加了83.6％，根重增加了80％。

[0047] 表1短小芽孢杆菌YJ04接种水稻后的促生效果

[0048]菌株 叶长(cm) 根长(cm) 鲜重(g) 干重(g) 根重(g)
CK 36.07±1.09e 9.56±0.77c 1.38±0.09d 0.55±0.02c 0.1±0.01d
YJ04 48.82±0.85abc 13.65±0.45a 3.89±0.27bc 1.01±0.06ab 0.18±0.03abc

[0049] 注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)

[0050] 实施例6促进油麦菜生长试验

[0051] 将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于30℃培养48小时，菌数达5×109CFU.mL-1，用蛭石作载体。将短小芽孢杆菌发酵液与蛭石(1：2)混合(如1升培养液混合2公斤蛭石)，制备成菌数达1.5～2.0×109CFU.g-1的菌剂。将短小芽孢杆菌-蛭石接种剂2kg施用45棵田间移栽5天后的油麦菜，不接种的45棵田间移栽5天后的油麦菜为对照。25天后与未接种的油麦菜对照相比(见图3)，油麦菜干重平均增加20％，植株叶绿素平均增加14％，根长平均增长15％。