[0001] 本发明属于利用微生物及其代谢产物提高原油采收率的三次采油技术领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种及其固态细菌制剂的制备与应用。

[0002] 石油是工业经济的血液，石油储量及产量关系到国家经济、社会可持续发展与国防安全。目前，通过一次及二次采油，原油采收率约为地质储量的30％左右，尚有大量的残留原油有待通过新技术进行开采。利用物理化学技术提高原油采收率已有大量研究及应用，但现有技术对大量存在的低渗、稠油等特殊油藏效果不佳。

[0003] 限制原油采收率提高的主要因素为：一是原油中的沥青、胶质、蜡质等高分子烃粘度大、流动性差；二是原油紧密附着在储油层的多孔载体上，不易流动；三是原油中含有大量石蜡，随着原油的开采，石蜡从地层深处向表层流动时，随着温度的降低，其凝结沉积在井壁及油管壁上，形成堵塞，影响原油开采的产量及管道运输。因此可通过降解原油中高分子组分、降低原油粘度、减轻石蜡沉积堵塞来提高原油流动性来提高原油采收率。

[0004] 微生物采油技术是包括微生物生长、运移及新陈代谢等复杂过程在内的生物学和物理化学综合技术，具有多重作用及综合效果，主要包括微生物地面发酵和微生物地下发酵两大类，其地下发酵是把油层作为巨大的生物反应器，将配伍性较好的外源微生物注入其中，利用微生物在地下油层中生长繁殖及其代谢产物的综合作用提高采收率。地下发酵需要向油藏地层注入大量微生物菌剂，所用的外源微生物为细菌，其产品为液体发酵生产的液态细菌制剂，需要的细菌菌剂数量极大。然而液态细菌制剂不能长期贮存，体积大，运输不便，严重制约了驱油细菌在生产上的广泛应用。

[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种及其固态菌剂的制备与应用，可用于对原油或石蜡的降解，进而提升原油的采收率。

[0006] 为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

[0007] (一)一株芽孢杆菌，分离自安塞油田、志丹油田的原油及油污土壤中，于2015年12月11日保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015740，命名为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Amyloliquefaciens6-2c)。

[0008] 解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的16S rDNA序列分析：通过PCR反应，从解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的16S rDNA序列中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产物纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列进行对比分析，发现该芽孢杆菌6-2c与Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens FN597644的16S rDNA序列同源性达到99.78％，确认该芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefaciens 
subsp.amyloliquefaciens)。

[0009] 解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的形态特征：菌落直径较大，白色，圆形，边缘不整齐，表面光滑湿润，不透明，稍向上隆起，电镜下细胞呈长杆状，宽0.5～1.0μm，长2.0～3.0μm。

[0010] (二)一种芽孢细菌制剂，其特征在于，以解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c为活性成分。

[0011] 所述芽孢细菌制剂为固态细菌制剂。

[0012] (三)一种以解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c为活性成分的芽孢细菌制剂的制备方法，其特征在于，采用液态-固态两步发酵法，具体包括以下步骤：

[0013] 步骤(1)，液体发酵培养基的制备：液体发酵培养基包括质量百分比为0.3％的牛肉膏、1％的蛋白胨、0.5％的NaCl、1％的红糖、其余为自来水，pH值自然，混合，备用；

[0014] 步骤(2)，液态种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌斜面接入到装有液体发酵培养基的组培瓶中，在30℃、120r/min条件下，摇床培养3d，获得液态种子液，备用；

[0015] 步骤(3)，固态发酵培养基的制备：固态发酵培养基包括麸皮、原油及无机盐溶液；按照无机盐溶液∶麸皮∶原油为50～80mL∶90～110g∶1.5～2.5g的比例，先将麸皮与原油搅拌均匀，再加无机盐溶液，继续混合均匀，121℃条件下灭菌30min，备用；

[0016] 步骤(4)，固态细菌制剂的制备：取步骤(2)的液态种子液转接到步骤(3)的固态发酵培养基中，其中，液态种子液与固态发酵培养基的比例为3mL∶5g，再在28～30℃条件下恒温静置培养5～6d；培养结束后，将培养物取出，40℃烘干，粉碎，过0.10mm筛， 即得固态芽孢细菌制剂。

[0017] 其中，所述步骤(2)中，解淀粉芽孢杆菌斜面的培养方法为：将解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c接种到牛肉膏蛋白胨琼脂(成分公知)斜面培养基中，28～30℃培养48h，即得。

[0018] 其中，所述步骤(3)中，所述无机盐溶液包括以下质量分数的成分：0.2％NaNO3，0.1％(NH4)2SO4，0.03％MgSO4·7H2O，0.5％KH2PO4，1％K2HPO4·3H2O，0.5％NaCl，其余为自来水，pH值自然。

[0019] 利用该方法制备的芽孢细菌制剂的活菌数为1.77×1010CFU/g。

[0020] (四)本发明还提供了上述芽孢细菌制剂在原油或固体石蜡降解中的应用。

[0021] 上述芽孢细菌制剂在原油或固体石蜡降解中的应用，其特征在于，使用方法如下：按质量比1∶30的比例将固态芽孢细菌制剂加入到30～35℃的自来水中，振荡0.5h，玻璃棉过滤，所得滤液即为固态细菌菌剂稀释菌悬液；将该稀释菌悬液与原油或固态石蜡按15∶1混合均匀，40℃反应96h。

[0022] 上述芽孢细菌制剂在原油或固体石蜡降解中的应用，其特征在于，使用方法如下：按质量比1∶30的比例将固态芽孢细菌制剂加入到30～35℃的自来水中，混合、搅拌、过滤，所得滤液即为供试固态细菌菌剂稀释菌悬液；将该稀释菌悬液与水按1∶100～200混合均匀注入油井，以降解井壁凝结的固态石蜡；或将该稀释菌悬液与水按1∶200～500混合均匀注入油层，以降解原油。

[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0024] (1)在现有的利用微生物提高原油采收率的技术中，均使用的是液态培养物，然而液态细菌制剂不能长期贮存，体积大，运输不便，严重制约了驱油细菌在生产上的广泛应用。本发明采用液态-固态两步发酵法制备固态细菌制剂，制得的细菌制剂体积小，易保藏，运输成本低，使用时加水稀释过滤即可，从根本上解决了上述问题。

[0025] (2)本发明固态细菌制剂的制备方法，采用的主要原料为农副产品，原料来源广泛，价格低廉，为微生物提高原油采收率技术的实际应用提供了可行的方案。

[0026] (3)现已发现解淀粉芽孢杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)具有防治植物病害、促进植物生长功能，但未发现其具有降解原油及石蜡的功能。本发明提出解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c在原油或固体石蜡降解中的应用，其同时具有产酸产气及产表面活性物质的能力，能大幅度降低原油的附着性，是一株具有多种功能的驱油细菌。
附图说明

[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

[0028] 图1为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的菌落形态及细胞显微形态图。

[0029] 图2为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的系统进化树图。

[0030] 图3为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c固态细菌制剂处理固态石蜡在正己烷中的溶解效果对比图。其中，图左为空白组蒸馏水对固态石蜡溶解性的效果，图右为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c固态细菌制剂稀释菌液对固态石蜡溶解性的效果。

[0031] 图4为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c固态细菌制剂菌剂稀释菌液对滤纸吸附原油的脱附效果对比图。其中，图左为空白组效果，图右稀释菌液脱附试验组效果。

[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但是以下实施例并不作为限制本发明的保护范围。

[0033] 实施例1菌种的鉴定

[0034] (1)形态特征

[0035] 菌落直径较大，白色，圆形，边缘不整齐，表面光滑湿润，不透明，稍向上隆起，电镜下细胞呈长杆状，宽0.5～1.0μm，长2.0～3.0μm，具体形态如图1。

[0036] (2)16S rDNA序列分析

[0037] 通过PCR反应，从解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的16S rDNA序列中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产物纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列进行对比分析，发现该芽孢杆菌6-2c与Bacillus amyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens FN597644的16S rDNA序列同源性达到
99.78％，确认该芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c的系统进化树如图2。

[0038] 16S rDNA扩增测序结果如SEQ ID No.1所示，如下：

[0039]CGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCG TAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCC

[0040] 实施例2固态芽孢细菌制剂的制备

[0041] 采用液态-固态两步发酵法培养，具体包括以下步骤：

[0042] 步骤(1)，液体发酵培养基的制备：牛肉膏3.00g，蛋白胨10.00g，NaCl 5.00g，红糖10.00g，自来水1000mL，pH值自然，混合，备用；

[0043] 步骤(2)，液态种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c斜面接入到装有100mL液体发酵培养基的600mL组培瓶中，在30℃、120r/min条件下，摇床培养3d，获得液态种子液，备用；

[0044] 其中，解淀粉芽孢杆菌斜面的培养方法为：将解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c接种 到斜面培养基中，30℃培养48h，即得。

[0045] 步骤(3)，固态发酵培养基的制备：包括麸皮、原油及无机盐溶液，先将100g麸皮与2g原油搅拌均匀，再加60mL无机盐溶液，继续混合均匀，121℃条件下灭菌30min，备用；其中，无机盐溶液包括NaNO32.00g、(NH4)2SO41.00g、MgSO4·7H2O 0.30g、KH2PO45.00g、K2HPO4·3H2O 10.00g、NaCl 5.00g以及自来水1000mL，pH值自然。

[0046] 步骤(4)，固态细菌制剂的制备：取30mL步骤(2)的液态种子液转接到50.00g步骤(3)的固态发酵培养基中，其中，液态种子液与固态发酵培养基的比例为3mL∶5g，再在0℃条件下恒温静置培养5d；培养结束后，将培养物取出，40℃烘干，粉碎，过0.10mm筛，即得固态芽孢细菌制剂，其菌数为1.77×1010CFU/g。

[0047] 实施例3固态芽孢细菌制剂的应用

[0048] A固态芽孢细菌制剂用量及用法

[0049] (1)固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液的制备：称取1.500g固态芽孢细菌制剂，按1∶30的比例加入45mL蒸馏水，于30℃、120r/min的摇床中振荡0.5h，再用0.500g玻璃棉过滤，即得。

[0050] (2)原油或固体石蜡降解：向100mL细口玻璃瓶中加入2.000g原油，再加入30mL固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液，加橡胶瓶塞密封并用胶带加固，以防瓶内压力增大冲开瓶塞。40℃条件下静置反应96h，每4小时摇动1次。

[0051] 本试验以向100mL细口玻璃瓶中加30mL蒸馏水为对照组。

[0052] 上述试验反应结束后，测定固态芽孢细菌制剂降解后原油中饱和烃、芳香烃、胶质以及沥青质含量变化；固态芽孢细菌制剂对原油粘度影响；降解原油过程中产酸、产气定性与定量分析。

[0053] 用固体石蜡代替原油重复以上培养过程，待反应结束后测定固体石蜡在正己烷中的溶解性及产酸产气量与成分，其溶解效果如图3所示。

[0054] B固态芽孢细菌制剂的应用结果

[0055] (1)固态芽孢细菌制剂对原油的降解

[0056] ①对原油中饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质的降解：降解结果如表1所示，从表1可以看出，固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液对原油中饱和烃、芳香烃、胶质及沥青质的降解率分别为15.1％、23.7％、24.2％及56.2％，固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液降解处理与对照原油中4种组分的差异均达到显著水平(P＜0.05)。

[0057] 表1固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液对原油中4种组分的降解率

[0058]

[0059] ②对原油黏度和石蜡的溶解性：结果如表2，从表2可以看出，30℃时，固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液降解原油后，原油粘度较对照原油粘度降低29.4％；40℃时，较对照降低26.5％。固体石蜡经固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液降解后，在正己烷中的溶解性发生显著变化，可溶解石蜡量已达到石蜡总量的77.2％，结晶石蜡量为石蜡总量的20.7％，结果见图
3，结果表明，该固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液能减小原油粘度，并能大幅度提高石蜡在正己烷中的溶解能力，增加正己烷可溶的小分子石蜡量。

[0060] 表2固态细菌菌剂稀释菌悬液对原油黏度及石蜡溶解性影响

[0061]

[0062] ③对原油与固体石蜡降解的产气量及气体成分：固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液降解原油与固体石蜡过程中有气体产生，经气相色谱分析所产气体主要为CO2和H2。从表3看出，降解过程中总产气量达到69.0～70.0mL/瓶，CO2的产量为24.0～24.3mL/瓶，H2为45.0～45.7mL/瓶，产气率为230.0％～233.3％。

[0063] 表3固态细菌菌剂菌稀释菌悬液降解过程中产气种类及产气量

[0064]

[0065]

[0066] ④对原油与固体石蜡降解的产酸量及酸成分：从表4看出，经固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液降解后，反应液pH较对照下降36.0％～36.8％，总酸量为25.8～26.0mmol/L，酸值达到1548～1560mg/L。经有机酸色谱分析，产生的短链有机酸主要是草酸和丙酸。

[0067] 表4固态细菌菌剂稀释菌悬液降解原油与固体石蜡时的培养液pH及产酸量[0068]

[0069] ⑤固态细菌制剂稀释菌悬液的排油活性及脱附性：从表5看出，该固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液具有一定的排油活性，排油圈直径为18.9cm，为对照的63.0倍；该固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液对滤纸上附着的原油具有良好的脱附作用，在以滤纸为吸附介质的脱附试验处理中，94.20％的原油从滤纸上脱落下来，脱落量为对照的8.37倍，回收固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液液仍对原油具有92.47％的脱附率，与新制备固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液差异不大，结果见图4，表明固态芽孢细菌制剂稀释菌悬液具有良好脱附作用及回收再利用价值。

[0070] 表5固态细菌制剂稀释菌悬液排油圈直径及原油脱附率

[0071]

[0072] 以上实施例结果表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种6-2c是1株新的多功能驱油细菌，具有以下4种功能：①降解作用：可降解原油中的烷烃、芳香烃、石蜡、胶质及沥青，使原油中的重质组分分解为轻质组分，降低原油黏度，减少可沉积的大分子组分，有效改善原油的流动性，防止石蜡沉积堵塞管道及井壁。②产气：菌剂在降解原油及石蜡过程中产生大量CO2和H2，这些气体能够增加油层内部压力，气体溶入原油会降低原油黏 度，改善原油流动性。③产酸：菌剂在降解原油及石蜡过程中产生大量草酸、丙酸等有机酸，可有效溶解储油岩层孔隙中的碳酸盐，增加油层的孔隙度和渗透率，同时还能降低油水之间的界面张力，形成油水乳浊液，从而提高原油采收率。④产生表面活性物质，有助于原油脱附，同时对原油中的石蜡组分产生一定的乳化、分散作用，使蜡晶颗粒变细变小而随采出液流出油井，减轻或消除蜡沉积堵塞，进而改善原油采收率及管道运输效果。

[0073] 虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。