一种饲料黄曲霉生物拮抗剂及其培养分离方法

申请号 CN201510978164.6 申请日 2015-12-23 公开(公告)号 CN105462889A 公开(公告)日 2016-04-06
申请人 内蒙古自治区农牧业科学院; 呼和浩特市亿羊达生物科技有限责任公司; 发明人 侯勇跃; 李锋; 裴乐;
摘要 本 发明 公开了一种 饲料 黄曲霉 生物 拮抗剂及其培养分离方法。芽孢杆菌是自然界广泛存在的一种菌,因其抗性强、无致病性、耐受不良环境等,广泛应用于医疗、工业、农业与卫生等领域,本发明对芽孢杆菌对黄曲霉的抑制与拮抗作用展开研究。首先从羊粪、 牛 粪等各种动物 粪便 与 土壤 进行取样分离芽孢杆菌;对分离菌株进行形态与生化鉴定;随后对各种芽孢杆菌对黄曲霉的抑制与拮抗作用进行比较;将拮抗效果好的芽孢杆菌添加到饲料里,进行饲喂效果比较;最后确定饲料黄曲霉生物拮抗剂——萎缩芽孢杆菌的制备方法。本发明的物质来源广泛,制备工艺简单,更适合用于饲料里的黄曲霉的拮抗与产生毒素的 预防 。
权利要求

1.一种用于饲料黄曲霉的拮抗剂萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
2.如权利要求1中所述的饲料黄曲霉拮抗剂萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的分离培养方法,其特征在于,将土壤、羊粪、粪等各种动物粪便取样以粉末状在培养基上划线涂布,培养基成分为:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂17g,蒸馏l000mL,pH7.2,
121℃高压20min后使用。
3.如权利要求2所述的芽孢杆菌的培养方法,其特征在于,所述培养条件为:于27℃-37℃下培养2-4天。
4.如权利要求1所述的芽孢杆菌在拮抗黄曲霉从而抑制毒素产生方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用为拮抗饲料中的黄曲霉毒产生。
6.一种饲料黄曲霉拮抗剂萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的培养分离方法,其特征在于:
A.将土壤、羊粪、牛粪等各种动物粪便取样以粉末状在NA培养基上划线涂布;
B.取三代以后的菌株培养,用接种环蘸取待使用菌株菌悬液,在TSA培养基平板划线,适温培养18h-48h,待出现单菌落,观察形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色
C.挑取纯菌落进行革兰氏染色实验以及芽孢染色实验;
D.经过耐盐性测定、耐酸测定、生长温度范围测定、需性测定试验、生化实验(细菌微量生化鉴定管法),结果显示菌落表面光滑,不透明,不规则;体紫色,单生或双生,杆状;
好氧生长;生长温度可在5-55℃之间生长;耐盐性强,可在10%NaCl下生长;最低生长pH为
5.5,最高pH为9。
E.对黄曲霉菌丝生长抑制的实验
将杆菌培养液各加入培养基中,冷凝后接种在平板上培养的黄曲霉菌碟,以无菌水为对照,于恒温培养后测量菌落直径。
F.对黄曲霉菌丝形态的影响实验
将黄曲霉袍子分别与杆菌培养液混合培养于液体培养基中,以无菌水为对照,摇床培养,后显微镜观察黄曲霉菌丝体的形态变化,结果显示杆菌对黄曲霉具有明显抑制作用。
7.一种包含芽孢杆菌拮抗剂的饲料的制备方法,其特征在于:
A.将权利要求1-6中所述的芽孢杆菌用灭菌的生理盐水制成1*105CFU/ml的菌悬液,以
4-8%接种量接种于TSB液体培养基中,27-35℃振荡培养18-24小时;
TSB培养基:胰蛋白胨1.5%(g/100ml),大豆蛋白胨0.5%(g/100ml),氯化钠0.5%(g/
100ml),用蒸馏水配制而成,调节pH为7.2±0.2,经121℃压蒸汽灭菌后使用;
B.在以上培养基中加入膨润土5-10g/100ml,静置20-30分钟后,离心过滤,将沉淀物在
27-55℃环境中干燥后添加到动物饲料中。

说明书全文

一种饲料黄曲霉生物拮抗剂及其培养分离方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制品领域,具体而言,属于兽用饲料微生物制剂的生产。

背景技术

[0002] 黄曲霉是很多作物的腐生菌或致坏死病原菌,依靠产生的分生孢子和毒素在作物中交叉感染,侵染粮食、油料作物的种子、饲料以及各种食品等,导致农作物减产,威胁人、畜和禽类健康。黄曲霉最大的危害是产生黄曲霉毒素,黄曲霉毒素具有很强的毒性,被认为有致癌性、致突变、致畸性、抑制免疫,并可引起肝部损伤等危害,其中毒性最大的黄曲霉毒素,其毒性为氰化的10倍,砒霜的68倍。因此如何有效的防治黄曲霉及其毒素的产生具有十分重要的理论和现实意义。
[0003] 由于黄曲霉污染所带来的巨大经济损失和健康危害,人们一直在寻求对其进行有效防治的策略和技术,并提出了一些初步措施,各种物理化学去毒方法、以及生物防治。大量研究表明,很多拮抗微生物及其活性物质对黄曲霉的生长和毒素的产生均有明显的抑制作用。
[0004] 萎缩芽孢杆菌来源广泛,好行菌,适应温度范围大,耐盐耐也耐酸,同时萎缩芽孢杆菌现已被作为消毒灭菌工艺的指标菌,因此展开对萎缩芽孢杆菌的更进一步研究与应用都很有现实意义。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于从动物粪便土壤培养分离优异芽孢杆菌,而后进行表观与生理生化鉴定后,制作成添加剂形式添加到饲料里进行饲喂效果比较,进而对效果最佳的菌进行的分子学上的鉴定,确定该有益菌的名称,将其应用于饲料领域。
[0006] 本方案采用的制备工艺如下:
[0007] 1.将土壤、羊粪、粪等各种动物粪便取样以粉末状在培养基上划线涂布,培养基成分为:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂17g,蒸馏l000mL,pH7.2,121℃高压20min后使用;
[0008] 2.27℃-37℃下培养2-4天,逐步分离培养,当菌落单一,肉眼观测颜色形状一致时,继续培养三代;
[0009] 3.取三代以后的菌株培养,用接种环蘸取待使用菌株菌悬液,在TSA培养基(酪蛋白胰酶消化物15.0,大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0,氯化钠5.0,琼脂15.0,pH值7.3±0.225℃)平板划线,适温培养18h-48h,待出现单菌落,观察形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色。表观形态观察参考《常见细菌系统鉴定手册》,菌落表面圆形,边缘整齐,形状凸起,不透明,白色或者淡黄色时初步确定为芽孢杆菌;
[0010] 4.挑取纯菌落进行革兰氏染色实验以及芽孢染色实验,结果细胞长宽分别为0.5-1.0um,2.0-4.0um,营养细胞杆状,有的呈链状排列,革兰氏染色菌体呈紫色为阳性;芽孢染色后呈绿色,芽孢椭圆形,不膨大,中生,进一步确定为芽孢杆菌;
[0011] 5.生化实验(细菌微量生化鉴定管法),用甘油,接触酶反应阳性,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能液化明胶,可利用甘露糖发酵,不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵,能在含胰胨水中生长,能水解淀粉者可鉴定为芽孢杆菌。
[0012] 6.经过耐盐性测定:10%NaCL培养基中生长;耐酸碱测定:培养基在pH5.5-9菌落都可以正常生长;温度范围测定:在5-55℃仍可以生长,在无氧条件下不能生长。
[0013] 7.对黄曲霉菌丝生长抑制的实验
[0014] 将杆菌培养液各加入培养基中,冷凝后接种在平板上培养的黄曲霉菌碟,以无菌水为对照,于恒温培养后测量菌落直径。
[0015] 8.对菌丝形态的影响实验
[0016] 将黄曲霉孢子分别与杆菌培养液混合培养于液体培养基中,以无菌水为对照,摇床培养,后显微镜观察黄曲霉菌丝体的形态变化。结果显示杆菌对黄曲霉具有明显抗生作用。
[0017] 本发明还提供一种芽孢杆菌拮抗剂添加到饲料里的制备方法:
[0018] A.将以上单一的几种杆菌用灭菌的生理盐水制成1*105CFU/ml的菌悬液,以4-8%接种量接种于TSB液体培养基中,27-35℃振荡培养18-24小时;
[0019] B.TSB选择:胰蛋白胨1.5%(g/100ml)大豆蛋白胨0.5%(g/100ml)氯化钠0.5%(g/100ml)用蒸馏水配制而成,调节pH为7.2±0.2,经121℃压力蒸汽灭菌后使用;
[0020] C.在以上培养基中加入膨润土5-10g/100ml,静置20-30分钟后,离心过滤,将沉淀物在27-55℃环境中干燥后添加到动物饲料中。
[0021] 抑制黄曲霉最强或者说添加芽孢杆菌的饲料效果最佳的菌采用recA引物、ITS引物进行PCR扩增,电泳条带清晰,送到送上海立菲生物技术有限公司测序鉴定,经过GenBank的Blast对比分析,发育树的建立确定该菌为萎缩芽孢杆菌。
[0022] 与现有技术相比,本发明的有益效果是:
[0023] 1、原料为天然的微生物,来源广泛,无刺激、无残留;
[0024] 2、效果更明显而且其抗性强、无致病性、耐受不良环境等;
[0025] 3、不残留不易引起其它病变,有益菌有益于动物肠道消化。附图说明
[0026] 图1:分离菌的序列与GenBank中收录的登录号为CP010778.1、CP007640.1、CP002207.1、CP011802.1的萎缩芽孢杆菌相似性比较
[0027] 图2:构建基于recA区序列的系统发育树

具体实施方式

[0028] 实施例1.芽孢杆菌的培养与分离
[0029] 将土壤、羊粪、牛粪等各种动物粪便取样以粉末状在培养基上划线涂布,培养基成分为:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂17g,蒸馏水l000mL,pH7.2,121℃高压20min后使用;
[0030] 27℃-37℃下培养2-4天,逐步分离培养,当菌落单一,肉眼观测颜色形状一致时,继续培养三代;
[0031] 取三代以后的菌株培养,用接种环蘸取待使用菌株菌悬液,在TSA培养基(酪蛋白胰酶消化物15.0,大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0,氯化钠5.0,琼脂15.0,pH值7.3±0.225℃)平板划线,适温培养18h-48h,待出现单菌落,观察形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色。表观形态观察参考《常见细菌系统鉴定手册》,菌落表面圆形,边缘整齐,形状凸起,不透明,白色或者淡黄色时初步确定为芽孢杆菌;
[0032] 挑取纯菌落进行革兰氏染色实验以及芽孢染色实验,结果细胞长宽分别为0.5-1.0um,2.0-4.0um,营养细胞杆状,有的呈链状排列,革兰氏染色菌体呈紫色为阳性;芽孢染色后呈绿色,芽孢椭圆形,不膨大,中生,进一步确定为芽孢杆菌;
[0033] 生化实验(细菌微量生化鉴定管法),用甘油,接触酶反应阳性,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能液化明胶,可利用甘露糖发酵,不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵,能在含胰胨水中生长,能水解淀粉者可鉴定为芽孢杆菌。
[0034] 经过耐盐性测定:10%NaCL培养基中生长;耐酸碱测定:培养基在pH5.5-9菌落都可以正常生长;温度范围测定:在5-55℃仍可以生长,在无氧条件下不能生长。
[0035] 实施例2.芽孢杆菌的功能试验
[0036] 将初步确定为芽孢杆菌的抑制黄曲霉生长进行实验观测,取1mL各处理芽孢杆菌培养液于无菌平板中,倾注入10-15mL PDA培养基,摇匀,待培养基凝固后,用直径6mm无菌打孔器在平板中央打孔,向孔中注入l0uL黄曲霉孢子悬浮液(l*105CFU/mL),以未做任何处理的无菌PDA培养基为对照,每个处理重复3个PDA平板,在32℃恒温培养箱中培养3-5d,观察黄曲霉的生长情况,并测定黄曲霉直径,计算抑菌率。计算公式如下:
[0037] 抑菌率%=100*(对照组直径-实验组直径/对照直径),抑菌率最高的5个菌留作黄曲霉拮抗剂,芽孢杆菌培养液对黄曲霉的抑菌率的数据如表1所示:
[0038] 表1:芽孢杆菌培养液各处理组对黄曲霉的抑菌率
[0039]
[0040] 将上述分离的几株芽孢杆菌用灭菌的生理盐水制成1*105CFU/ml的菌悬液,以4-8%接种量接种于TSB液体培养基中,27-35℃振荡培养18-24小时;
[0041] TSB培养基:胰蛋白胨1.5%(g/100ml),大豆蛋白胨0.5%(g/100ml),氯化钠0.5%(g/100ml),用蒸馏水配制而成,调节pH为7.2±0.2,经121℃压力蒸汽灭菌后使用;
[0042] 在以上培养基中加入膨润土5-10g/100ml,静置20-30分钟后,离心过滤,将沉淀物在27-55℃环境中干燥后添加到动物饲料中。
[0043] 采用该饲料中饲喂1个月,2个月,3个月8组(每组6只羔羊)羊,对羊体重进行对比分析(如表2所示):
[0044] 表2:添加拮抗剂体重变化数据表(单位:kg)
[0045]
[0046] 通过上述试验可以证明抑制黄曲霉最强或者说添加芽孢杆菌的饲料效果最佳的菌为第4种菌。
[0047] 实施例3.芽孢杆菌菌种的鉴定
[0048] 对菌株4进行PCR扩增,recA序列的种间相似性程度更低可以替代或补充16SrRNA基因,该序列用于细菌菌种的鉴定或用于区分紧密相关的,广泛用于研究细菌的进化关系,因此选择recA引物。
[0049] recA—F:ACCAGACAATGCTCGACGT
[0050] recA—R:CCCTCTTGAAATTCCCGAAT
[0051] 8F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
[0052] 1392R:ACGGGCGGTGTGTAC
[0053] 59.0-63.0℃退火温度下,94℃预变性1min,94℃变性30s,58.8℃退火30s,72℃延伸30s,34个循环,72℃终延伸7min。
[0054] 测序结果为:
[0055] TACCAGACAATGCTCGACGTTCTGACTGAACAGCTGATCGAGACAGCTGC
[0056] AAAGGTTGTCGTAAAACGCCTGCAATTTACAGCGCAGCTTGAAAAATGGGCGC
[0057] AGCCGATCCATTCGGGAATTTCAAGAGGGA
[0058] 由测序结果可知,分离菌的ITS区序列大小为131bp。将测序结果提呈至GenBank数据库,进行BLAST比对。经比对后发现,分离菌的序列与GenBank中收录的登录号为CP010778.1、CP007640.1、CP002207.1、CP011802.1的萎缩芽孢杆菌相似性在98%以上(图1),利用DNASTAR.Lasergene.v7.1生物医学软件,构建基于recA区序列的系统发育树(图
2),进而进一步确定该菌落为萎缩芽孢杆菌的一个种。
[0059] 以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上和实质上的限制,凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用以上所揭示的技术内容,而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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