芽孢杆菌PB6在预防或治疗胃肠道疾病及免疫相关疾病中的用途

本发明一般性涉及给予细菌以治疗胃肠道疾病，更特别涉及给予 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株治疗抗生素相关性 腹泻(AAD)和艰难梭菌(Clostridium difficile)相关性疾病(CDAD)。

术语“抗生素相关性腹泻”是指在使用抗菌剂之后的良性、自限 性腹泻。典型地，这种腹泻未鉴别出病原体，腹泻是由于肠道菌群的 组成和功能改变所致。大多数患者响应于支持措施和停用抗生素。

长期应用多种抗生素、特别是应用肠道吸收较差或高度胆汁分泌 的广谱抗生素，导致肠道菌群的组成和功能发生变化，因此导致AAD 高发1，2。肠道菌群的组成及功能变化的程度受正常菌群抵抗建群的能 力及所用抗生素类型的影响。结肠厌氧性菌群的减少干扰碳水化合物 和胆汁酸的代谢，可以发生渗透性或分泌性腹泻。由于微生物和代谢 的改变而导致机会病原体过度生长。

艰难梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，占所有AAD的15％ -20％。特别地，这种生物体在具有肠炎的AAD病例及在所有具有伪 膜的那些病例中可以大量分离到。其在自然环境中广泛存在，可以存 活相当长的时间，经粪-口途径传播至易感人群。据信其是婴幼儿正 常菌群的一部分，且可以在大约5％健康成人及直至1/3的无症状或 群居的住院患者中分离。

AAD的临床表现可以是从轻度腹泻至暴发性肠炎3。艰难梭菌 肠炎的严重性看来受许多因素影响，包括年龄、并存疾病、宿主免疫 应答及降低肠蠕动剂的应用。令人感兴趣地，细菌基因型和毒素产生 看来起很小作用4。所述疾病的主要症状是腹泻，通常在治疗期间发 生，但是在停止应用抗生素之后8周仍可以出现。在大多数AAD病 例中，患者具有稀便、轻度肠炎症状，无全身症状。所述腹泻对支持 措施和停止应用抗生素迅速作出响应。

艰难梭菌在1935年首次阐述5，但是直至二十世纪七十年代后 期才将其与抗生素相关性腹泻联系起来。艰难梭菌是一种形成孢子的 革兰氏阳性厌氧杆菌，产生至少两种外毒素：毒素A(主要是肠毒素) 和毒素B(主要是细胞毒素)。该生物体在人体中导致胃肠道感染，从 无症状建群至严重腹泻、伪膜性肠炎(PMC)、中毒性巨结肠、结肠穿 孔及死亡6，7，8。产生艰难梭菌建群的第一步是结肠的正常菌群破坏， 通常是由于抗生素所致，或者罕见地由于抗肿瘤或免疫抑制剂引起 9，10。建群通过粪-口途径发生；摄食的艰难梭菌孢子幸免于胃酸屏障 并在结肠中萌发11，12。CDAD的症状可以在抗生素治疗的第一天即开 始，或者直至抗生素治疗结束几周后才开始13。最近揭示了如下两种 因素增加在医院获得艰难梭菌建群的患者中症状性疾病发生的可能 性：其它疾病的严重性，毒素A的血清IgG抗体水平降低14。这些结 果提示预先存在的抗毒素A抗体可改善疾病的严重性，且这种免疫 作用可以有效地预防和控制医院CDAD。

为清楚起见，如果患者出现由艰难梭菌导致的症状性疾病，我们 则定义该患者患有艰难梭菌相关性疾病(CDAD)。腹泻患者粪便中艰 难梭菌毒素的存在通过最普遍认可的诊断方法检测。

艰难梭菌是大约25％的抗生素相关性腹泻的致病因素15。大多数 艰难梭菌相关性疾病发生在医院或者长期护理机构(每100,000床日 (occupied bed-days)25-60的比例)，导致在美国每年超过300,000 个病例，在许多欧洲国家估计是类似比例。其可以使住院时间延长2 周，每个病例额外费用$6,000-$10,00016，17，18，19，20，21。

一旦停止使用刺激的抗生素，CDAD患者的腹泻可自然减轻，对 于一些病情轻微的患者不需要进行特别治疗22，23。然而，对于几乎所 有出现症状的患者需要用抗生素万古霉素或甲硝唑进行标准治疗。尽 管甲硝唑目前未被FDA许可用于治疗CDAD，但是由于使用万古霉 素的较高成本及万古霉素抗性细菌的出现，因此甲硝唑被广泛用作一 线治疗药剂。由于甲硝唑有效破坏正常的肠道菌群，因此其也使患者 倾向于甲硝唑抗性肠球菌建群24。口服甲硝唑(250mg，4次/天；或 者500mg，3次/天)10-14天通常是足够的。对于不能耐受口服甲硝唑、 甲硝唑治疗失败、妊娠患者及也许病情严重的那些患者给予口服盐酸 万古霉素(125mg，4次/天)10-14天。艰难梭菌结肠炎的第一次复发/ 再发可以再经10-14天口服甲硝唑或万古霉素疗程进行治疗。

用万古霉素或甲硝唑治疗CDAD通过改变正常的保护性肠道菌 群而导致恶性循环。结果，20％经治疗的首次发病患者通常再停止治 疗两周内复发CDAD25，26，27，28。在CDAD的治疗方案中排除抗生素的 另一个益处是降低了对于细菌抗性的选择压力。已经明确揭示了万古 霉素和甲硝唑选择革兰氏阳性球菌，如VRE。回顾性流行病学调查 已经将肠道VRE建群与广谱抗生素如头孢菌素、氟喹诺酮类抗菌药 物与甲硝唑的应用联系起来29。肠道VRE建群提供了医院内这种病 原体的贮主。许多VRE菌株是多抗性的，很少选择用于治疗危及生 命的全身感染。艰难梭菌患者，也许由于其先前的抗生素治疗，看起 来特别易受VRE建群和感染影响30，31。对VRE建群的治疗是控制医 院感染措施的重要组成部分。因此，非常需要降低VRE在一般患者 群和在艰难梭菌患者中建群的风险的治疗方案。万古霉素和甲硝唑抗 性艰难梭菌的潜在出现呈现了应用抗生素治疗这种疾病的另一风险 因素。目前，抗生素抗性艰难梭菌的出现是偶发的，但是在接近12％ 的临床分离菌中已经报道32。

发明概述

本发明涉及通过给予有效量的产脂肽的芽孢杆菌细菌而预防肠 道病变如抗生素相关性腹泻、艰难梭菌获得性腹泻、炎症性肠病和胃 肠道疾病。所述芽孢杆菌细菌可以作为益生菌给予，且可以组合其他 益生菌如菊糖一起给予。

使用生物化学方法、特别是API 50 CBH/L，一种优选的芽孢杆 菌被推定鉴别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。使用16S rRNA， 该优选的芽孢杆菌也被推定鉴别为枯草芽孢杆菌。使用gyrA，该优 选的芽孢杆菌被推定鉴别为解淀粉芽孢杆菌。进行gyrA分析之前， 该优选的芽孢杆菌保藏在ATCC中，且被鉴别为枯草芽孢杆菌。

本发明还涉及具有SEQ ID NO.1所示16S rRNA序列的分离的细 菌菌株，并涉及与SEQ ID NO.1具有90％、80％、70％、60％及50％ 同源性的分离的细菌菌株。

本发明还涉及具有SEQ ID NO.2所示部分gyrA序列的分离的细 菌菌株，并涉及与SEQ ID NO.2具有90％、80％、70％、60％及50％ 同源性的分离的细菌菌株。

本发明还涉及具有SEQ ID NO.3所示部分gyrA序列的分离的细 菌菌株，并涉及与SEQ ID NO.3具有90％、80％、70％、60％及50％ 同源性的分离的细菌菌株。

本发明进一步涉及被鉴别为ATCC菌株PTA-6737的芽孢杆菌菌 株。

优选的芽孢杆菌PB6由于其多方面独特的特性而可以解决一些 尚未能满足的医学需求。

附图简述

图1是芽孢杆菌PB6(1)对于产气荚膜梭菌(C.perfringens) ATCC13124(2)和艰难梭菌ATCC9689(3)的拮抗作用的图示。

图2是芽孢杆菌PB6对于艰难梭菌N API/027的拮抗作用的图 示。

图3是芽孢杆菌PB6对于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) ATCC55918的拮抗作用的图示。

图4是表面活性素(surfactin)的化学结构图示。

图5是用不同治疗方法治疗的患有CDAD的仓鼠的存活率百分 比图示。

图6是芽孢杆菌PB6的1466-bp 16S rRNA基因序列(第27-1492 位核苷酸)。

图7是芽孢杆菌PB6的1023-bp部分gyrA序列(第43-1065位核 苷酸)。

图8是得自芽孢杆菌PB6的部分gyrA序列测序的801-bp共有序 列。

图9是编码溶血素BL的PCR产物(1650-bp)的检测凝胶图；泳 道1，GeneRulerTM质量梯(3000，2000，1500，1200-bp)；泳道2，芽孢 杆菌PB6；泳道3，大肠杆菌ATCC 25922；泳道4，蜡状芽孢杆菌ATCC 49064；泳道5，蜡状芽孢杆菌ATCC 11778。在除了泳道4和5之外 的任何泳道中均检测到相应于1650-bp PCR产物的未扩增的条带。

图10是编码非溶血性肠毒素(Nhe)的PCR产物(1437-bp)的检测 凝胶图。泳道1，GeneRulerTM质量梯(3000，2000，1500，1200-bp)；泳 道2，芽孢杆菌PB6；泳道3，大肠杆菌ATCC 25922；泳道4，蜡状 芽孢杆菌ATCC 49064；泳道5，蜡状芽孢杆菌ATCC 11778。在任 何泳道中均检测到相应于1437-bp PCR产物的未扩增的条带。

图11是编码肠毒素K(EntK)的PCR产物(1400-bp)的检测凝胶图。 泳道1，芽孢杆菌PB6；泳道3，大肠杆菌ATCC 25922；泳道4，蜡 状芽孢杆菌ATCC 49064；泳道5，蜡状芽孢杆菌ATCC 11778；泳 道6，GeneRulerTM质量梯(3000，2000，1500，1200-bp)；在任何泳道中 均检测到相应于1400-bp PCR产物的未扩增的条带。

图12是示出蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(1)对于产气荚膜梭 菌ATCC13124(2)和艰难梭菌ATCC9689(3)无拮抗作用的照片。

图13是示出芽孢杆菌PB6对于空肠弯曲杆菌ATCC 33291的拮 抗作用的照片。

图14是示出蜡状芽孢杆菌对于空肠弯曲杆菌ATCC 33291无拮 抗作用的照片。

优选的实施方案详述

PB6是分离自自然界且未经遗传修饰的一种专利细菌菌株。使用 核糖体分型(ribotyping)技术，这个细菌被鉴别为枯草芽孢杆菌菌株。 DNA:DNA杂交研究表明芽孢杆菌PB6菌株也许更可能是解淀粉芽 孢杆菌，关于此在下文进一步描述。

如本说明书中所用，术语预防是指一种医学或公共卫生方法，其 目的在于预防而不是治疗或治愈疾病。如本说明书中所用，术语治疗 是指一种医学或公共卫生方法，其目的是治疗或治愈疾病。如本说明 书中所用，术语协同化合物是指增强为了预防或治疗疾病或健康状况 而给予患者的芽孢杆菌细菌的预防或治疗效力的化合物。如本说明书 中所用，脂肽是指既含有脂质也含有蛋白质的分子，包括含有几个氨 基酸及一或多个脂肪酸的表面活性分子。表面活性素、伊枯草菌素 (iturin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、baillomycins、bacillopeptins、 芬枯草菌素(fengycin)和plipastatins是脂肽的几个例子。

实施例1：芽孢杆菌PB6对抗艰难梭菌AAD和CDAD的效力

检测芽孢杆菌PB6对于产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难梭菌 ATCC9689的拮抗作用。

芽孢杆菌PB6对于产气荚膜梭菌ATCC 13124和艰难梭菌 ATCC9689具有拮抗作用。在这两个菌种的平板上的条划线的交叉点 观测到清晰的环带。所述检测平板的例子在图1中示出。

芽孢杆菌PB6对于艰难梭菌N API/027具有拮抗作用。这种艰难 梭菌菌株与一些高度危险的疾病爆发相关联，且示出对于抗生素的抗 性。所述检测平板的例子在图2中示出。

为了确定芽孢杆菌PB6的二级代谢物的抗微生物作用，发酵该 细菌，并通过二乙醚提取发酵产物。分离有机层，在真空中浓缩，再 溶解于DMSO中以进行筛选。

所述提取物对于产气荚膜梭菌的最小抑制浓度(MIC)为 2.5-5μg/ml，对于艰难梭菌的最小抑制浓度为5-10μg/ml(表1)。

表1：芽孢杆菌PB6的粗提物对于产气荚膜梭菌、艰难梭菌和空 肠弯曲杆菌筛选结果

结果证实芽孢杆菌PB6在体外抑制空肠弯曲杆菌的生长。所述 检测平板的例子在图3中示出。芽孢杆菌PB6的发酵产物的醚提取 物对于空肠弯曲杆菌的MIC是25-100μg/ml。

空肠弯曲杆菌与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)极密切相关， 且因此很可能芽孢杆菌PB6对于幽门螺杆菌也具有活性。另外，在 文献中可以发现芽孢杆菌细菌(例如枯草芽孢杆菌)具有对抗幽门螺杆 菌的活性33。

对所述粗提物的进一步研究表明具有对抗梭菌的活性的分子是 环状脂肽表面活性素(图4)。

当确定纯的表面活性素(纯化自本发明发酵产物或者购自Sigma) 对抗梭菌的活性时，发现较高的MIC。对抗产气荚膜梭菌的MIC经 证实为10-25μg/ml。显然，所述纯的活性化合物较所述粗提的发酵产 物的活性低。这可能是由于提取物中存在增强表面活性素活性的辅因 子所致。这个结论已经通过实验表明，其中将表面活性素的MIC与 组合无活性化合物的表面活性素的MIC进行对比。所述无活性的化 合物分离自本发明中用于分离表面活性素的相同提取物。这种组合的 MIC为1-10μg/ml。

实验结果表明当用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理芽孢杆菌PB6的滤 液时，其对抗梭菌的活性显著降低。由于胃蛋白酶和胰蛋白酶是在胃 和胰腺的粘膜层中产生的，因此显然经口服给予表面活性素将导致其 活性明显丧失。其中表面活性素已经在37℃与0.1N HCl一起保温30、 60和90分钟的其他实验中表明酸性条件(如在胃中的条件)导致活性 丧失(表2)。因此，给予芽孢杆菌PB6(最终以孢子形式给予)更有效地 获得表面活性素或其他脂肽的在肠道中的更有效浓度。

表2：酸性保温条件对于表面活性素对抗产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抗菌活性的影响结果

除了产生抗微生物二级代谢物之外，芽孢杆菌PB6孢子还能在 肠道中萌发，并因此可以通过竞争性排除而抑制病原体。

芽孢杆菌、特别是枯草芽孢杆菌，是最有效和有益的促进健康和 免疫刺激细菌之一。根据一些临床研究报道，摄入的芽孢杆菌的细胞 壁成分能激活几乎所有的人免疫防御系统，包括激活至少三种特异性 抗体(IgM、IgG和IgA)，这三种抗体高效对抗经常试图侵犯并感染人 免疫系统的许多有害病毒、真菌和细菌病原体。已经揭示了枯草芽孢 杆菌刺激B和T淋巴细胞及巨噬细胞。另有证据表明枯草芽孢杆菌 孢子可在体内发挥免疫调节作用。已经有关于在暴露于孢子之后噬斑 形成细胞对于T细胞依赖性抗原的应答增加以及不同的吞噬细胞功 能增强的报道34，35，36，37，38，39，40，41。

在一项研究中(表3)，观测到在用不同水平的解淀粉芽孢杆菌 PB6喂食的肉食鸡比用抗生素治疗和阴性对照组中的吞噬作用增强。

由此可以推断解淀粉芽孢杆菌也具有免疫刺激作用。

表3：芽孢杆菌PB6对于雄性肉食鸡中免疫应答的影响

  治疗 吞噬作用 阴性对照组 6.59 阳性对照组(100mg/kg杆菌肽锌) 6.23 PB6(107CFU/T) 11.82 PB6(108CFU/T) 8.85

使用可商购的免疫测定(TECRA和Oxoid)评估芽孢杆菌PB6的滤 液中溶血性、非溶血性肠毒素和肠毒素K的存在。对相同的滤液进 一步进行针对Vero和HEp-2细胞系的细胞毒性测试。最后，使用基 于PCR的方法证实芽孢杆菌PB6中具有可能的产肠毒素能力的基因 的存在。在这两个商业免疫测定中使用HbI或Nhe肠毒素及抗体观 测到无免疫交叉反应性。使用Vero和HEp-2细胞分析也观测到无细 胞毒性。在使得可以检测已知的产毒素蜡状芽孢杆菌菌株的相同条件 下，芽孢杆菌PB6菌株不产生溶血性、非溶血性肠毒素和肠毒素K。

对芽孢杆菌PB6的体内毒性也进行了测试。因此，从发酵产物 中产生含有1010cfu/g芽孢杆菌PB6的喷雾干燥的产物。

喷雾干燥的解淀粉芽孢杆菌在Wistar大鼠中的毒性研究

设计并实施第一项研究以确定喷雾干燥的芽孢杆菌PB6产物 (1010cfu/g)在Wistar大鼠中的急性口服毒性。对共5只雄性和5只雌 性动物经口服给予5000mg/kg所述产物(于双蒸馏水中的悬浮液，使 用剂量体积为10ml/kg)。对照组由5只雄性和5只雌性动物组成，接 受10ml/kg双蒸馏水。在以5000mg/kg剂量治疗的动物中观测到无 死亡。50％接受芽孢杆菌PB6的动物较对照组更具活性。用芽孢杆 菌PB6治疗的动物无一患有腹泻。在尸检之后，在这两组动物的任 何器官中均未见病理学改变。因此，发现口服芽孢杆菌PB6产物在 Wistar大鼠中的最大无致死量(LD0)和LD50高于5000mg/kg。

结论：发现在Wistar大鼠中干燥的芽孢杆菌PB6(1010cfu/g)经口 服途径给予的最大无致死量(LD0)和LD50高于5000mg/kg。

在Wistar大鼠中重复给予28天芽孢杆菌PB6的经口毒性

设计并实施这项研究以确定在Wistar大鼠中重复给予(28天)芽孢 杆菌PB6(1010cfu/g)的口服毒性。在每组中，经口服给予6只雄性和 6只雌性动物250、500或1000mg/kg所述产物，共给予28天。对照 组也由6只雄性和6只雌性动物组成，其接受10ml/kg双蒸馏水，共 28天。在第29天，处死这些动物。

这项研究还包括也分别具有6只雄性和6只雌性动物的对照载体 组和高剂量组的两个可逆组。所述高剂量组接受药物直至第28天， 从第29天至42天不予治疗，在第43天处死。对照载体组接受10ml/kg 蒸馏水直至第28天，从第29天至42天不予治疗，在第43天处死。

结论：发现在大鼠中28天毒性试验中芽孢杆菌PB6(1010cfU/g) 的无观测到不良事件的水平(NOAEL)高于1000mg/kg。

芽孢杆菌PB6在新西兰白兔中局部刺激研究(皮肤和眼睛)

在这个研究中使用共3只新西兰白兔(任意性别)-相同动物进行 皮肤和眼睛刺激研究。在这两项研究中保持最小5天的间隔时间。使 用1g芽孢杆菌PB6(1010cfu/g)作为贴片贴敷于皮肤上进行皮肤刺激， 将100μl的10％芽孢杆菌PB6悬浮液滴入左眼中进行眼睛刺激。

在对3只兔除去毛发后，将测试的PB6贴片贴敷于背外侧部位 皮肤上。将10％ PB6悬浮液滴入3只兔的左眼中。在应用后4小时， 将所述测试贴片从动物皮肤上除去。在将测试悬浮液滴入左眼之后， 使眼睑闭合2-3秒。

在除去测试PB6贴片之后1、24、48和72小时观测动物的皮肤 刺激情况并评分。在滴入PB6悬浮液之后相同的时间点，对眼睛刺 激情况进行评分。

结论：皮肤：当应用1g芽孢杆菌PB6(1010cfu/g)作为贴片时，观 测到无刺激性。

眼睛：当滴入100μl的10％芽孢杆菌PB6(1010cfu/g)悬浮液时， 观测到无刺激性。

解淀粉芽孢杆菌PB6在小鼠中的红细胞微核试验

设计并实施这项研究以检测测试物质诱导的Swiss albino小鼠染 色体或有丝分裂器的损害。经口服给予共5只雄性和5只雌性动物 2500和5000mg/kg测试物质，对照载体组由5只雄性和5只雌性小 鼠组成，其经口服接受10ml/kg双蒸馏水。阳性对照组(5只雄性+5 只雌性小鼠)经口服接受40mg/kg环磷酰胺。

在各自的时间点(对照组，2500mg/kg PB6环磷酰胺在24小时， 5000mg/kg PB6在24和48小时)通过过量的CO2处死所述动物，切 下股骨，制作骨髓涂片，用Giemsa和May-Greunwald染色，在显微 镜下通过计数2000个不成熟的红细胞观察微核发生率。

通过计数至少200个红细胞，确定每只动物的全部(不成熟+成熟) 红细胞中不成熟红细胞的百分比。

结论：2500 & 5000mg/kg剂量的芽孢杆菌PB6(1010cfu/g)在小鼠 中不显著诱导微核化的多色红细胞。

经口服给予芽孢杆菌PB6在治疗患有CDAD的叙利亚金黄仓鼠 (Golden Syrian hamster)的体内效力的确定 研究设计

42只雄性叙利亚金黄仓鼠得自National Centre for Laboratory Animal Sciences，NDST(Hyderabad，India)。在治疗开始时，所述动物 为12-14周龄。在其到达实验室时，在兽医监督下对动物进行全面临 床测试，以保证其处于良好状态。使动物适应研究条件至少7天。在 试验开始时分配动物组成研究组之前再次记录体重。将动物单独圈养 在聚碳酸酯笼子中(290×22×140mm，L×W×H)。动物的房间及测 试房间的条件如下：温度，22±4℃；相对湿度，50±20％；光/暗周 期，12小时/12小时(光亮时间07:00-19:00)；通风，大约7次/小时过 滤的非再循环空气。所有动物均随意摄食Hamster Pellet Feed(NIN， Hyderabad)和Aquaguard纯净水。

将动物分为7组(A-G)。在A-E组中，通过在第0天经口服给予 10000 CFU′s的艰难梭菌ATCC 9689而诱导艰难梭菌相关性腹泻，随 后在第1天在耳后躯干部位皮下注射100mg/kg氯林肯霉素。A组动 物不再进行治疗。

B组从第2天至第6天每天经口管饲法给予动物50mg/kg万古 霉素治疗。C、D和E组从第1天只第6天分别经口管饲法给予动物 1.5×108、1.5×107和1.5×106CFU/Kg剂量的PB6治疗，每天3次， 每次间隔4小时(第一次于9.30am给予)。在第1天，在注射氯林肯 霉素之后1小时给予第一剂PB6。在F和G组，从第1天至第6天 经口管饲法给予动物的1.5×109CFU/Kg的PB6治疗，每天3次，每 次间隔4小时(第一次于9.30am给予)。第6天是进行治疗的最后一 天。每天观测两次临床症状和死亡率，直至第15天。腹泻症状评分 为轻度、中度和重度标准。在第0、7和14天记录动物体重。在第1、 2和7天使用Immunocards(Meridian life sciences)测试A-E组动物的 粪便中梭菌毒素A和B的存在情况。在第1天，在给予氯林肯霉素 之前取粪便样本。在第2和7天，在第二次与第三次给予治疗剂之间 取粪便样本。

测试制备物

根据厂商指导接种含有艰难梭菌ATCC 9689的Culti-loop (Oxoid，Basingstoke，England)，用盐水稀释肉汤以获得10000CFU/ml 溶液。将盐酸氯林肯霉素(Pharmacia，Puurs-Belgium)和万古霉素 (Neon Laboratories，Bombay，India)悬浮于双蒸馏水中，浓度分别为10 和50mg/ml。氯林肯霉素和万古霉素的剂量体积分别为10和1ml/Kg 体重。将干燥的PB6(Kemin Consumer Care，Des Moines，USA)-一种在 麦芽糖和环糊精载体中干燥的芽孢杆菌PB6发酵肉汤-悬浮于双蒸馏 水中，浓度为1.5E8、1.5E6和1.5E5 CFU/ml。剂量体积为10ml/Kg 体重。在每次给予之前制备新鲜制品。基于最后的个体体重给予氯林 肯霉素、万古霉素和PB6。在每次给予之前用力搅拌所述制品。

结果与讨论

在给予氯林肯霉素之后大约6小时，在未治疗组的3只动物及在 万古霉素治疗组的1只动物中观测到轻度腹泻。在C、D、E组，在 给予氯林肯霉素之后大约1小时接受第一剂PB6的动物中，在相同 日期无一动物示出任何腹泻迹象。在随后的两天，治疗组之间患有腹 泻的动物数目及腹泻的严重性呈现不同程度发展趋势(表4)。其中诱 导艰难梭菌相关性腹泻的所有组均示出腹泻迹象。在用万古霉素和高 剂量PB6治疗组中腹泻强度较低。在未治疗组以及在低和中等剂量 PB6治疗组，大便呈水样，且整个腹部区域均呈潮湿状态。

表4：诱导CDAD的组中第1-3天腹泻动物数目及其评分

+：轻度；++中度；+++：重度

在第3天结束时，其中诱导CDAD组的所有动物均仍存活，但 是其中一些示出严重腹泻症状。在第4天，即给予氯林肯霉素之后3 天，第一次出现动物死亡。在治疗时期结束时，即第6天，未治疗组 所有动物均死亡。万古霉素和高剂量PB6治疗组中动物存活率最高， 其中4/6的动物存活(图5)。

在第7天，在其中诱导CDAD的所有组中均观测到平均体重降 低。关于这种体重降低显然存在PB6的反向(inverse)剂量应答关联(表 5)。接受低剂量PB6的动物与接受高剂量PB6的动物相比体重丧失 平均多3倍。万古霉素治疗组体重丧失最少。其中未诱导CDAD的 两个组中平均体重随着时间的推移而略有增加。

表5：平均体重(g)和体重增长百分比(％)

*无资料，所有动物均死亡

a，b，c，d，e：在同一栏内具有不同上标的值之间具有显著性 差异(P<0.05，最小显著差异)。

在第1、2和7天检测诱导CDAD的动物的粪便样本中梭菌属毒 素A和B的存在。正如所期望的，显示高死亡率和平均体重显著降 低的实验组动物也具有高百分比的这些毒素，再次呈现与PB6的反 向剂量应答关系。

表6：其粪便中存在艰难梭菌毒素A或B的动物数目

*无数据，所有动物均死亡。

结论

设计并实施这项研究以评估芽孢杆菌PB6在氯林肯霉素诱导的 CDAD仓鼠模型中治疗CDAD的效力，所述模型是这种感染的经充 分确定及高度敏感的模型。在诱导CDAD之后未经治疗的仓鼠均发 生腹泻、体重丧失及5天内死亡。用PB6治疗产生剂量相关的应答。 应用最高剂量PB6的实验组中腹泻、体重减轻和死亡率最低。在停 止治疗时，最高剂量PB6治疗组示出在帮助仓鼠从氯林肯霉素诱导 的CDAD中存活的效力与万古霉素相同。

经口服给予芽孢杆菌PB6的有效成分评估

关于益生菌(例如菊糖)的新饮食观念在营养学家、医生、食品加 工业和消费者中逐步普及。关于益生菌食品最规范认可的解释是：益 生菌是一种选择性发酵成分，其可以特异性改变胃肠道菌群的组成成 分和活性，对宿主的健康有益。如果被分类作为食品中的益生菌成分， 则该成分必须：1)抵抗胃和小肠中食物酶的消化(水解)；2)以化学完 整形式进入结肠，随后经历部分或完全发酵；3)刺激促进健康的肠 道细菌的活性生长和/或活性。益生菌刺激的细菌生长的健康益处是 广泛的，包括对结肠癌和病原体具有积极作用、降低甘油三酯、增加 Ca和Mg的吸收、及增加排便频率和粪便重量。菊糖是一种多分散 性β(2→1)果聚糖，链长度为2-60单位。菊糖与低聚果糖的果糖分子 之间独特的连接将其与典型的碳水化合物区分开来。它们抵抗人体食 物酶的消化及在小肠中吸收，但是由结肠菌群水解与发酵，并因此分 类为益生菌膳食纤维42，43，44，45，46。

益生菌刺激促进健康的肠道细菌的活性生长和/或活性的事实使 得非常感兴趣地将其与益生菌如芽孢杆菌PB6一起给予人体。

另外，解淀粉芽孢杆菌PB6不抑制肠道菌群中的“有益健康” 的细菌如乳杆菌(LactoBacillus spp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)的生长。

材料与方法

分离的PB6菌株的鉴别

分离的PB6菌株是革兰氏阳性杆菌，且具有过氧化氢酶。 Malachite Green染色证实这种微生物具有内生孢子，且是孢子形成 菌。这种微生物也是“游动孢子(swamer)”，在长期保温的基础上趋 于传播至整个琼脂表面。在与已知芽孢杆菌(Bacillus spp.)的相关性 方面，所述分离的芽孢杆菌菌株具有92.0％ ID。基于API生物化学 指标，推定芽孢杆菌PB6菌株为枯草芽孢杆菌。因此所述芽孢杆菌 PB6菌株以保藏号ATCC-PTA 6737保藏，在此命名为枯草芽孢杆菌。 于2002年11月27日申请的美国专利申请系列No.10/306,365在此 并入作参考。

16rRNA基因测序

完善并排列对比几乎完整的芽孢杆菌PB6菌株的16rRNA序列 (SEQ ID NO.1，图6)。

GyrA测序

通过两个不同组获得的PB6的部分gyrA序列示于图7(SEQ ID No.2)和图8(SEQ ID NO.3)。

DNA：DNA杂交

根据Ezaki等所述方法47加以修改的方法，在严格条件(在40℃) 下进行杂交。DNA同源百分比是最少4次杂交的平均值。括号中的 数字是倒数值之间的差异。使用这种技术，平均标准误差为14单位 48。结果示于表7。

表7：DNA同源百分比％

发现芽孢杆菌PB6、LMG 9814T与LMG 22478T之间的DNA同 源百分比高于70％，这是通常公认物种划分(species delineation)的界 限49。

从这些结果中看出B.velezensis和解淀粉芽孢杆菌属于相同基因 种，因此是主观异名，由此根据命名法则42，最老的法定名称应加 以保留，即解淀粉芽孢杆菌；芽孢杆菌PB6(ATCC-PTA 6737)可以 被更准确地分类为解淀粉芽孢杆菌菌种。

诵讨划线测定(streak-line assay)检测解淀粉芽孢杆菌的拮抗性质

将解淀粉芽孢杆菌PB6直线接种于胰蛋白胨大豆血平板(Oxoid， Belgium)上，在有氧条件下在37℃保温24小时后，将不同的指示菌 株垂直接种于所述芽孢杆菌PB6培养物。使用Anaerogen Pak(Oxoid， Belgium)于厌氧条件下保温接种梭菌种的平板。在37℃保温过夜后， 通过划线交叉处周围透明带的出现而评估拮抗作用，表示一种生物体 对另一种生物体的抑制作用。

芽孢杆菌PB6的二级代谢物的提取与抗微生物筛选

将芽孢杆菌PB6在补加了5％绵羊血液(Oxoid，Belgium)的胰蛋白 胨大豆琼脂平板上在37℃生长24小时。这个培养物用于接种补加了 0.6％酵母提取物(Oxoid，Belgium)的100ml胰蛋白酶大豆肉汤中。在 摇床(100rpm)中在37℃保温24小时之后，将该肉汤与等量的二乙醚 (Acros，Belgium)混合(3次)。在提取代谢物之后，将两层分离，收集 乙醚部分并在4000rpm离心5分钟。

之后，使用旋转蒸发器真空除去所述溶剂。称重剩余物并将其溶 解于二甲亚砜(Acros，Belgium)中，获得终浓度为10000μg/ml粗提物。 在1/11比率的DMSO/水混合物中制成进一步的稀释液(500、250、100、 50、25和10μg/ml)。最后，将25μl每种稀释液用移液管移至微滴定 平板(Labsystems，Finland)的孔中。

细菌菌株产气荚膜梭菌ATCC13124(C 1600L，Oxoid，Belgium)和 艰难梭菌ATCC9689(C1610L，Oxoid，Belgium)以冻干的culti-loops 形式购买，根据厂商指导进行培养。从这两个菌株培养物中，在厌氧 基础肉汤(Oxoid，Belgium)中制备McFarland标准(A625nm＝0.100)。将 250μl这种标准加入10ml新鲜厌氧基础肉汤中，将225μl这种培养物 经移液管移至所述孔中。在每个孔中获得最终细胞密度为5×105 cfu/ml。使用在密封塑料袋中的Anaerogen Compact(Oxoid，Belgium) 将该微滴定平板在厌氧条件下保温18小时(产气荚膜梭菌)和48小时 (艰难梭菌)。在保温之前和之后，使用Bioscreen C分析仪(Labsystems， Finland)测量每个孔的光密度(OD)。白光(Wide Band)用于测量OD。 一式两份进行检测，培养基对照，培养基加接种体(阴性对照组)和阳 性对照组也同样；测试混合物组中包括三种浓度(0.1、0.5和1.0μg/ml) 的万古霉素(Fluka，Belgium)。最小抑制浓度(MIC)是其中无生长出现 或检测到OD不增加的最低浓度。

辅因子对于表面活性素的增强作用的确定

通过制备TLC(Kieselgel 60，20×20cm，2mm层厚)分离解淀粉芽 孢杆菌PB6发酵产物的乙醚提取物。使用的洗脱液是己烷/丙酮 (30/70)。在Rf 0-0.33带中分离表面活性素。分离自这个带的表面活 性素对抗产气荚膜梭菌的MIC为10-25μg/ml。在另一个带(Rf 0.33-0.76)中，发现对抗产气荚膜梭菌无活性的一或多种产物(MIC> 100μg/ml)。当检测这两个带的产物组合时(每种提取物的最终浓度为 10μg/ml)，产气荚膜梭菌无生长。当组合这些对自身无反应性的产物 时，表面活性素的MIC降低至低于10μg/ml。

酸性处理对于表面活性素的抗微生物活性的作用的确定

制备750μg/ml表面活性素(Sigma)于乙腈/0.1N HCl(1/1；v/v)中 的溶液。将0.5ml这种溶液在37℃保温30、60或90分钟，之后加 入0.25ml的0.1N NaHCO3溶液，使用旋转振荡混合器混合该混合物。 对所有溶液筛选其对抗产气荚膜梭菌的活性。

芽孢杆菌PB6产生肠毒素的确定

细菌菌株与培养条件：将芽孢杆菌PB6在补加了0.6％酵母提取 物(Oxoid Limited，England)的100ml胰蛋白酶大豆肉汤(Becton Dickenson and Company，Cockeysville，MD)(TSBYE)中生长，并在37 ℃在摇床(100rpm)中保温。将一种产生毒素的菌株蜡状芽孢杆菌 ATCC 11778也在摇床中在37℃于TSBYE中生长。相似地，将不产 生毒素的菌株蜡状芽孢杆菌ATCC 49064和大肠杆菌ATCC 25922也 在有氧条件下在37℃于TSBYE中生长。这项研究中使用的所有细菌 菌株均每周一次移至新鲜TSBYE中，然后在冰箱中保持在4℃培养。 将新鲜生长的菌株再悬浮于40％甘油中，在-80℃冰箱中长期贮存。

肠毒素产生：将1-ml过夜测试培养物接种于补加了1％葡萄糖的 50ml脑心浸液(BHI)(BHIG)中，在32℃于摇床(100rpm)中保温6小 时31。在5000×离心10分钟以沉淀细菌细胞，收集上清进行Vero细 胞的细胞毒性研究31。然后使用直至80％饱和的硫酸铵溶液(561g/L) 使上清中的蛋白质浓缩10倍33。在10000×g离心20分钟之后，轻 轻倒出上清，将蛋白质沉淀再悬浮于2.5ml磷酸盐缓冲液(20mM； pH 6.8)中。剩余的硫酸铵通过用相同缓冲液在4℃透析6小时而除去。 使用磷酸盐缓冲液(20mM；pH 6.8)将透析的蛋白质溶液的终体积调 节为初始体积(5ml)的十分之一31。

催吐毒素产生：将1ml过夜测试培养物接种于补加1％葡萄糖的 50ml脑心浸液(BHI)(BHIG)中，在摇床(250rpm)中在32℃保温6小 时。在4℃在2000×g离心10分钟以沉淀细菌细胞31。收集上清，然 后在121℃高温灭菌15分钟以除去不耐热的肠毒素20。收集可能具有 热稳定性催吐毒素的热处理滤液，进行HEp-2细胞空泡形成测定20。

Vero和HEp-2细胞的制备：将非洲绿猴肾细胞(Vero)或HEp-2(人 喉癌细胞)作为单层培养物维持在具有Earle′s修改的盐(MEM)的30 ml培养基199中，其含有2mM L-谷氨酰胺、10mM碳酸氢钠、1％ 非必需氨基酸、100UI/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和3ml胎牛血 清(10％)。基于极限必需培养基(Gibco)制备无亮氨酸培养基(MEM)， 其还含有1.8mM CaCl2、0.4mM MgCl2、5.0mM KCl、0.12M NaCl、 3.2mM NaH2PO4及20mM Hepes(pH7.7)。将Vero或HEp-2细胞在 MEM中在5％ CO2及37℃条件下保温。Vero或HEp-2细胞的汇合的 单层培养物通过弃去培养基之后用5ml PBS(pH7.7)洗涤进行传代培 养。然后通过加入2ml胰蛋白酶溶液(0.25％胰蛋白酶；0.025％ EDTA) 而将Vero或HEp-2细胞从培养瓶中分离出。释放出的Vero或HEp-2 细胞的水平经显微镜确定，之后加入MEM培养基(8ml)以防止胰蛋 白酶的进一步作用。然后将5-ml等份新鲜经胰蛋白酶消化的Vero或 HEp-2细胞移至含有15ml MEM的新培养瓶中，在5％ CO2及37℃ 条件下保温。

芽孢杆菌腹泻肠毒素(BDE)可视免疫测定

在检测样本BDE之前，将检测试剂盒(TECRA International Pte Ltd，Chatswood，NSW，Australia)的所有成分均保持在20-25℃。根据厂 商指导，将含有特异于BDE的高亲和性抗体的微滴定平板的孔用试 剂盒中提供的洗涤溶液预浸，在20-25℃静置10分钟。将所述孔倒空， 之后加入含有200μl检测样本和对照样本(阳性和阴性对照)的等份溶 液移至各个孔中。将所述孔在37℃保温2小时。将所述孔洗涤4次， 之后向每个孔中加入200μl结合物等份，在25℃保温1小时。将每个 孔洗涤5次，之后向每个孔中加入200μl底物并在25℃保温30分钟。 30分钟后，将每个孔的生色情况与检测试剂盒中提供的TECRA色卡 进行对比。

Oxoid蜡状芽孢杆菌肠毒素反向被动乳胶凝集法(BCET-RPLA)：

该测试是通过反向被动乳胶凝集法(RPLA)(Unipath，Basingstoke， UK)检测蜡状芽孢杆菌的腹泻肠毒素。将聚苯乙烯乳胶颗粒用经蜡状 芽孢杆菌腹泻肠毒素免疫的兔的纯化的抗血清敏化。试剂盒还提供了 阳性(肠毒素)和阴性(无特异性蜡状芽孢杆菌抗肠毒素的乳胶颗粒)对 照。将含有25μl稀释液和检测或对照(阳性和阴性)样本的等份连续分 配进2个不同系列的V形孔微滴定平板中。然后将含有25μl敏化的 乳胶颗粒和乳胶对照物的溶液分别分配进第一个和第二个系列V形 孔微滴定平板中。在25℃保温20-24小时后，检测每个孔的凝集情况。

细胞毒性测量：将新鲜胰蛋白酶消化的Vero细胞再悬浮于30ml 无亮氨酸的培养基(MEM)中。将1ml Vero细胞悬浮液移至24孔平板 的每个孔中(～5×104个细胞/孔)。细胞用1ml无亮氨酸的MEM洗涤 一次，并在37℃在5％ CO2下保温2小时。2小时后，除去生长培养 基，每个孔用1ml无亮氨酸的MEM洗涤一次。向每个孔中加入1-ml 预热(37℃)的无亮氨酸MEM，随后立即加入50μl解淀粉芽孢杆菌 PB6、蜡状芽孢杆菌ATCC 11778、蜡状芽孢杆菌ATCC 49064和大 肠杆菌ATCC 25922的上清或滤液。将接种的孔在37℃在5％ CO2下 保温2小时。保温2小时后，将经上清或滤液处理的Vero细胞用1ml 预热(37℃)的无亮氨酸MEM洗涤一次。向每个孔中加入300μl含有 放射性标记的同位素的溶液(16μl 14C-亮氨酸于8ml无亮氨酸MEM 中)(Perkin Elmer Asia，Singapore)。将14C-亮氨酸标记的Vero细胞在 37℃且无CO2的条件下保温1小时，之后弃去生长培养基。随后，向 含有14C-亮氨酸标记的Vero细胞的每个孔中加入1ml含有5％三氯乙 酸的等份溶液，之后在25℃保温10分钟。在保温10分钟后，每个 孔中的内容物用1ml的5％三氯乙酸溶液洗涤两次。然后向每个孔中 加入300μl的0.1M KOH，在25℃再保温10分钟。在保温10分钟后， 向每个孔中加入2ml闪烁液。最后，将每个孔中的所有内容物均移至 闪烁试管中。将所有闪烁试管振荡1分钟，之后进行放射性计数。使 用如下公式计算Vero细胞吸收的14C亮氨酸的抑制百分比。

14C亮氨酸吸收的抑制百分比＝[(未加入毒素的Vero细胞的cpm- 检测样本的cpm)]/[未加入毒素的Vero细胞的cpm]×100％。用于计 算Vero细胞吸收14C亮氨酸的抑制百分比的cpm需要从背景计数值 (～30-60cpm)中减去。如果在浓缩10倍之后，14C亮氨酸吸收的抑制 百分比低于20％，则认为无毒素存在。每个试验均一式两份进行。结 果示于表8和9。

表8：细菌滤液对Vero和HEp-2细胞系的作用

a“-”表示无细胞毒性作用或者未观测到空泡存在

b“+”表示已经发生Vero细胞破坏或者在HEp-2细胞中空泡形 成。

表9：14C-亮氨酸同位素吸收的抑制百分比％

a如果在10倍浓缩之后，14C亮氨酸吸收的抑制百分比小于20％， 则认为检测菌株的毒素是阴性的(SCAN报道)。

b检测微生物

c阴性和阳性对照物

d不产生毒素的菌株。

HEp-2细胞空泡形成测定：将25μl含有来自测试培养物和对照 培养物的溶液在0.15M NaCl溶液中连续稀释(2倍)，交叉分配于96 孔组织培养平板(Gibco Ltd，Uxbridge，UK)的孔中。向每个孔中加入 100μl新鲜的经胰蛋白酶消化的HEp-2细胞，在37℃保温24小时。 一式两份进行所有空泡形成测定。在第6小时和第24小时间隔经显 微镜检测HEp-2细胞中空泡的形成。

基于PCR的方法：确定非溶血性肠毒素(NheB-nheC)25，26、溶血 素BL(HblD-hblA)10，11及肠毒素K(EntK)27，28的PCR引物。NheB-nheC 引物的序列是5′-CGGTTCATC-TGTTGCGACAGC-3′和 3′-GTCCTCGTGTTCGTCTTC-AGC-5′。HblD-hblA的引物序列是 5′CGCT-CAAGAACAAAAAGTAGG3′和3′TCCCTAATGT- CTAAATGTTCCTC 5′。EntK的正向和反向引物的序列分别是 5′GAATTACGTTGGCGAATC3′和3′CGGG-CGGATGGGA5′。将含有 解淀粉芽孢杆菌PB6和产毒素的菌株蜡状芽孢杆菌ATCC 11778和 蜡状芽孢杆菌ATCC 49064的DNA的样本PCR管和阳性对照管置于 Perkin-Elmer热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)中，起始温度设定点为90℃。热循环的条件为1 次94℃、2分钟循环，随后是38次94℃、15秒和70℃、3分钟的循 环。在扩增后，最后在72℃、7分钟进行延伸。需要3小时完成PCR 扩增步骤。然后将等份(15μl)的每种反应产物和15μl DNA标准梯 (500、1031、2000和3000碱基对)在含有0.1μg/ml溴化乙啶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的2％琼脂糖凝胶(Life Technologies Inc.， Gaithersburg，MD)上在180伏电泳1小时。在电泳之后，使用紫外 线透射仪(波长-302nm)(UVP Model White/2 UV；UVP Inc.，Upland， CA)观测所有凝胶，然后使用Polaroid MP-4照相机(Polaroid Corp.， Cambridge，MA)拍照(见图9、图10和图11)。

实施例2：通讨微量肉汤稀释法确定不同益生菌和解淀粉芽孢杆菌 PB6的代谢物对抗产气荚膜梭菌和艰难梭菌的抗微生物性质

在这项研究中，我们研究了芽孢杆菌PB6及如下4种可商购的 益生菌的代谢物的抗梭菌性质：(Sanofi-synthelabo)、 (Biodiphar)、Bioplus 2B(Miavit GmbH)和Biosporinum (Dniprofarm)。利用分离自不同益生菌的菌种设置小规模发酵。使用 微量肉汤稀释法针对产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难梭菌 ATCC9689筛选含有所述代谢物的发酵肉汤的乙醚提取物。芽孢杆菌 PB6的代谢物示出显著的抗梭菌性质。最小抑制浓度介于2.5与 5.0μg/ml之间(对于产气荚膜梭菌)及5.0与10.0μg/ml之间(对于艰难 梭菌)。Bioplus 2B和Biosporinum发酵肉 汤的乙醚提取物对于这两种梭菌菌种不具有任何显著的抗菌活性。

尽管梭菌属菌种在自然界普遍存在，但其原则上的生境是土壤及 许多动物和人体的肠道。土壤样本中产气荚膜梭菌、包括其孢子的广 泛存在几乎保证了这种生物体在暴露于灰尘污染、包括许多食品的表 面上的频繁存在50。产气荚膜梭菌也是最常分离自除了粪便之外的人 临床样本的菌种。在许多临床状况中遭遇这种菌种，包括简单的伤口 污染至创伤性肌坏死、腹内败血症、血管内溶血、吸入性肺炎、坏死 性肺炎等51。

艰难梭菌是导致抗生素相关性腹泻(AAD)的主要原因，也是最常 鉴别的导致医院获得性腹泻的原因。在艰难梭菌相关性疾病(CDAD) 中，最初的起始事件包括抗生素治疗期间保护性肠道菌群的破坏。由 于抗生素的水平下降低于抑制浓度，医院病原体如艰难梭菌能生长。 通过粪-口途径发生建群，摄入的孢子幸免于胃酸屏障而存活，开始 在结肠中萌发52，53。产毒素的以及不产毒素的分离株能形成孢子，并 存在于医院环境中。结果，任一类型孢子均可感染结肠，并且由于缺 乏正常菌群的竞争而可利用可获得的营养物。所述生物体是否附着于 结肠壁还不清楚，但是很可能所述生物体遍及肠腔而生长。随着细胞 生长和溶解，产毒素的菌株产生并释放毒素A和/或B。这种活性与 炎症应答一起产生导致艰难梭菌相关性腹泻和结肠炎的组织病理学 事件54，55，56。

“益生菌”通常被公认解释为“活的微生物”饲料或食品补剂， 其通过改善其肠道微生物平衡而有益地影响宿主。但是益生菌怎样工 作？益生菌对肠道生态系统的作用以一些有益的方式影响消费者。已 经提出了由益生菌引起的肠道环境改变带来的许多潜在益处，包括： 增加对感染性疾病、特别是肠道感染性疾病的抗性，减少腹泻的持续 时间、降低血压、减低血清胆固醇浓度、降低变态反应等57。

建立了本文中描述的对比研究，以对比不同益生菌发酵提取物对 于梭菌属菌种的抗微生物性质。

方法和材料

将芽孢杆菌PB6与分离自(Sanofi-synthelabo)的蜡状 芽孢杆菌菌株在补加了5％绵羊血(Oxoid，Belgium)的胰蛋白胨大豆琼 脂平板上在37℃生长24小时。供给的益生菌Bioplus 2B含有两种 不同的菌种：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DSM5749和枯 草芽孢杆菌DSM5750。将这两个菌种也在补加了5％绵羊血(Oxoid， Belgium)的胰蛋白胨大豆琼脂平板上在37℃生长24小时。将这些培 养物的混合物用于接种补加了0.6％酵母提取物(Oxoid，Belgium)的 100ml胰蛋白酶大豆肉汤。Biosporinum也含有两个菌种，即地衣芽 孢杆菌和枯草芽孢杆菌。这个产物作为于玻璃瓶中的冻干培养物销 售。将一个瓶中的内容物再悬浮于肉汤中，将此混合物用于接种具有 0.6％酵母提取物(Oxoid，Belgium)的100ml胰蛋白酶大豆肉汤。在所 有益生菌均在摇床(100rpm)中在37℃保温24小时后，将所述肉汤与 等量的二乙醚(Acros，Belgium)混合(3次)。在提取代谢物之后，分离 这两层，并收集乙醚部分，在4000rpm离心5分钟。

此后，使用旋转式蒸发器真空除去溶剂。称重剩余物，并将其溶 解于二甲亚砜(Acros，Belgium)中，获得终浓度为10000μg/ml的粗提 物。在1/12的DMSO/水混合物中进一步稀释(500、250、100、50、 25和10μg/ml)。最后，将25μl每种稀释液经移液管移至微滴定平板 (Labsystems，Finland)的孔中。将(Biodiphar)中使用的 Saccharomyces boulardii在Sabouraud葡萄糖琼脂(Oxoid，Belgium)上 在37℃生长48小时。这个培养物用于接种100ml Sabouraud液体培 养基(Oxoid，Belgium)。在摇床(100rpm)中在37℃保温2天后，进行 相同程序提取代谢物。

细菌菌株产气荚膜梭菌ATCC13124(C 1600L，Oxoid，Belgium) 和艰难梭菌ATCC9689(C161OL，Oxoid，Belgium)以冻干的形式购 买，根据厂商指导进行培养。从这两个培养物中，在厌氧性基础肉汤 (Oxoid，Belgium)中制备McFarland标准物(A625nm＝0.100)。将250μl 这种标准加入10ml新鲜厌氧性基础肉汤中，将225μl这种中间物经 移液管移至平板孔中。每个孔中最终细胞密度为5×105cfu/ml。使用 于密封的塑料袋中的Anaerogen Compact(Oxoid，Belgium)，将此微滴 定平板在厌氧条件下保温18小时(产气荚膜梭菌)和48小时(艰难梭 菌)。在保温之前和之后，使用Bioscreen C分析仪(Labsystems，Finland) 测量每个孔的光密度(OD)。白光(Wide Band)用于测量OD。一式两份 进行检测，培养基对照，培养基加接种体(阴性对照组)和阳性对照组 也同样；测试组中包括三种浓度(0.1、0.5和1.0μg/ml)的万古霉素 (Fluka，Belgium)。最小抑制浓度(MIC)是其中无生长出现或检测到OD 不增加的最低浓度。

结果和讨论

在阴性对照孔中针对这两个菌种均观测到OD显著增加。在含有 1.0和0.5μg/ml万古霉素的孔中未出现生长，0.1μg/ml万古霉素不抑 制产气荚膜梭菌生长。在含有1和2.5μg/ml PB6提取物的孔中，出现 产气荚膜梭菌正常生长。从5μg/ml开始，可以观测到产气荚膜梭菌 不生长。PB6发酵粗提物对于产气荚膜梭菌的MIC介于2.5与 5.0μg/ml之间。对于艰难梭菌，在阴性对照孔中也观测到OB显著增 加。在含有1.0和0.5μg/ml万古霉素的孔中未出现生长，0.1μg/ml万 古霉素不抑制生长，在含有1、2.5和5μg/ml PB6粗提物的孔中，出 现艰难梭菌正常生长。从10μg/ml开始，可以检测到无生长。PB6代 谢物的乙醚提取物对于艰难梭菌的MIC介于5.0与10μg/ml之间。 (蜡状芽孢杆菌)、(S.boulardii)、Bioplus 2B(地 衣芽孢杆菌DSM5749和枯草芽孢杆菌DSM5750)及Biosporinum(地 衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的乙醚提取物在所有测试浓度均不具有 任何显著的抗菌活性。对于测试的两种梭菌菌种，MIC均高于 50μg/ml。这些结果示于表10。

表10：针对产气荚膜梭菌和艰难梭菌筛选所述粗提物的结果

结论

我们研究了B.PB6、(蜡状芽孢杆菌)、(S. boulardii)、Bioplus 2B(地衣芽孢杆菌DSM5749和枯草芽孢杆菌 DSM5750)及Biosporinum(地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的乙醚提取 物的抗梭菌性质。使用这些菌种进行实验室规模发酵，使用微量肉汤 稀释法技术针对产气荚膜梭菌ATCC 13124和艰难梭菌ATCC9689 筛选乙醚提取物。芽孢杆菌PB6的代谢物具有强抗梭菌性质，MIC 介于2.5至5.0μg/ml之间(产气荚膜梭菌)及5.0至10.0μg/ml之间(艰 难梭菌)。发酵的Bioplus 2B和Biosporinum 的乙醚提取物不具有任何显著对抗产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难 梭菌ATCC9689的作用。

实施例3：芽孢杆菌PB6对抗IBD的效力

已知表面活性素抑制胞浆型PLA2的活性，这是主要参与许多炎 症进程的一种酶58。炎症进程的抑制使得产生表面活性素的益生菌非 常感兴趣用于治疗炎症疾病，如炎症性肠病(IBD)。

炎症性肠病是指导致肠道炎症的两种慢性疾病：溃疡性结肠炎 (UC)和Crohn′s病(CD)。尽管所述疾病具有一些共同的特点，但是其 具有一些重要的差异。

CD是一种肠壁的慢性炎症，典型影响肠壁的整个厚度。其最常 见发生在小肠的最低部分(回肠)和大肠，但是其也可以发生在从口腔 至肛门的消化道的任何部分及肛门周围的皮肤。

在近十年中，CD在西方和发展中国家已经成为更普遍的疾病。 其在男性和女性中几乎相同发生，在犹太人中更多见。大多数病例在 30岁之前发生；大多数在14-24岁之间开始。在每个人中，该疾病影 响肠道的特定部位，有时在受影响区域之间存在正常的区域(跳跃区 域)。在大约35％的CD患者中，仅回肠受侵袭。在大约20％的患者 中，仅大肠受侵袭。在大约45％的患者中，回肠和大肠均受侵袭。

CD的病因尚未知。已经针对三种主要的可能性进行研究：免疫 系统功能障碍、感染和饮食。

CD的最常见的早期症状是慢性腹泻、腹痛、发热、食欲下降及 体重降低。CD患者的症状有所不同，但是具有如下四种共有模式：

·伴有右下腹部疼痛和压痛的炎症；

·复发急性肠梗阻，导致肠壁的严重疼痛痉挛、腹部肿胀、便秘 和呕吐；

·炎症和慢性部分肠梗阻，导致营养不良和长期虚弱；

·异常瘘管和脓肿，通常导致发热、腹部疼痛性肿块和严重体重 降低。

UC是大肠发炎及溃疡的一种慢性疾病，导致血便、腹部绞痛和 发热。该疾病可以在任何年龄发生，但是通常在15-30岁之间发生。

与CD不同，UC通常不影响肠壁的全层，且不影响小肠。该疾 病通常在直肠或乙状结肠发生，最后传播至部分或全部大肠。在一些 患者中，大多数大肠在早期即被侵袭。

大约10％看起来具有UC的患者仅发作一次。然而，一部分这种 患者实际上患有未检测到的感染而不是真正的UC。对于大多数患者， UC是一种慢性疾病，其随着时间的推移而变大和变小。UC的病因 仍未知。认为遗传和肠道中过度活性的免疫应答是主要的致病因素。

经口服给予芽孢杆菌PB6在治疗大鼠TNBS诱导的结肠炎(人结 肠炎模型)中的体内效力的确定

在这个实验中，研究了PB6在治疗经直肠给予2，4，5-三硝基苯磺 酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎中的效力。

研究设计

进行两个连续试验。雄性Wistar大鼠得自National Centre for Laboratory Animal Sciences(Hyderabad，India)(试验1)或者得自 Department of Animal Medicine，TANUVAS(Chennai，India)(试验2)。 在开始治疗时，实验动物为10-12周龄。在到达实验室时，在兽医的 监督下对动物进行完整临床测试，以保证这些动物处于良好状态。使 这些动物适应研究条件至少7天。每个试验随机选取动物分组。将每 组动物圈养在聚碳酸酯笼子(421×290×190mm，L×W×H)中。动 物的房间和试验室条件如下：温度，22±3℃；相对湿度，50±20％； 光/暗周期，12小时/12小时(光亮时间07.00-19.00)；通风，大约7次 /小时过滤的非再循环空气。AU动物自由摄食(除了在给予TNBS之 前空腹过夜之外)来自National Institute of Nutrition(NIN，Hyderabad， India)的大鼠颗粒状饲料，随意饮用Aquaguard纯净水。在这两个试 验中，诱导结肠炎这一天设为第1天。在过夜空腹之后，在距离肛门 8cm处经直肠内给予一次100mg/Kg体重的TNBS诱导结肠炎。结肠 炎阴性对照组在第1天经直肠内给予盐水(每个动物给予一次0.5ml)。 在第1天开始经口服给予结肠炎阴性和结肠炎阳性对照组10ml/kg 蒸馏水，3次/天，间隔4小时给予，直至并包括第7天。在第一个试 验中，在第1天开始对TNBS诱导的结肠炎组用PB6(分别用1.5 108 CFU/Kg或者1.5109CFU/Kg)治疗，3次/天，间隔4小时给予，直至 并包括第7天；在第1天开始用美沙拉嗪(mesalazine)(250mg/Kg/ 天)治疗，直至并包括第7天；或者在第1天用infliximab(3mg/Kg) 治疗一次。第二个试验部分重复第一个试验的PB6(1.5 108CFU/Kg)、 美沙拉嗪和infliximab治疗，且包括另外在第1天开始用S.boulardii (1.5 108CFU/Kg)治疗，3次/天，间隔4小时给予，直至并包括第7 天。第一次或唯一的一次治疗(在infliximab情况中)在给予TNBS之 后2(蒸馏水、PB6、S.boulardii和美沙拉嗪)小时或3(infliximab)小时 内给予。除了经静脉内注射的infliximab59之外，所有治疗均管饲给 予。每天观测两次临床迹象和死亡率。在第1、4和7天记录动物的 体重。在第8天，处死动物，切下长度为5cm的结肠节段(距离肛门 10-5cm)。将这些节段纵向剖开。用盐水洗涤以除去内容物，使用如 下分值对大体形态评分：0，无溃疡或炎症；1，无溃疡，仅局部充血； 2，溃疡，无充血；3，仅一个部位溃疡和炎症；4，两或多个部位溃 疡和炎症；5，大于2cm的溃疡。记录每个5cm结肠节段的重量以评 定炎症诱导的水肿。

测试制备物

将于水中的5％(w/v)TNBS(Sigma-aldrich，St Louis，USA)用50％ 乙醇稀释为2.5％溶液。给予体积为4ml/Kg体重。将干燥的PB6 (Kemin Health，Des Moines，USA)-在麦芽糖-和环糊精载体上干燥的 芽孢杆菌PB6发酵肉汤-悬浮于蒸馏水中，浓度为1.5X107和1.5X108 CFU/ml。剂量体积为10ml/Kg体重。将Saccharomyces boulardii Biodiphar，Brussel，Belgium)悬浮于蒸馏水中，浓度为1.5 107 CFU/ml。剂量体积为10ml/Kg体重。将Mesalazine(Sun Pharmaceutical Ind.Ltd，Mumbai，India)片剂使用研钵和研杵研成粉 末，于蒸馏水中制备含有25mg/ml的5-氨基水杨酸的溶液。给予体 积为10ml/Kg体重。首先将(Infliximab)(Centocor B.V.， Leiden，The Netherlands)用10ml注射用水重建，用盐水进一步稀释为 2mg/ml浓度。给予体积为1.5ml/Kg体重。基于最后的个体体重给予 所有体重依赖性剂量。在每次给予之前制备新鲜的制品。在每次给予 之前用力搅拌所述制品。

结果与讨论

在第一个试验中，一只用Infliximab治疗的大鼠在第2天死亡。， 因为第一次注射的药物溶液渗出，这只动物在第1天给予二次注射。 在用TNBS诱导结肠炎之后，一些动物示出轻度腹泻症状。从第1天 开始直至并包括第7天在不同的治疗组中记录的腹泻次数(及受侵袭 的动物数目)如下：在第一个试验中，对于结肠炎阴性对照组、结肠 炎阳性对照组、PB6 3×1.5 108CFU/Kg/天、PB6 3×1.5 109CFU/Kg/ 天、美沙拉嗪250mg/Kg/天及一次infliximab 3mg/Kg分别为0、22(2)、 4(1)、0、0和8(1)；在第二个试验中，对于结肠炎阴性对照组、结 肠炎阳性对照组、PB6 3×1.5 108CFU/Kg/天、S.boulardii 3×1.5 108 CFU/Kg/天、美沙拉嗪250mg/Kg/天及一次infliximab 3mg/Kg分别 为0、42(4)、10(1)、34(3)、12(1)和24(2)。结肠炎阳性对照组示出 伴随结肠炎的体重明显降低。在试验1中，这种体重降低高于在试验 2中体重降低，这也许与在诱导结肠炎时年龄和生长速度的差异相关。 在试验1中结肠炎阴性对照组通常在开始时体重较低，在整个试验期 间体重增长百分比较高，可能提示这些动物较试验2中的那些动物略 年幼。虽然在试验1中的常规治疗均显著抑制结肠炎对体重增加的负 作用，但是在试验2中这种结果仅在用PB6治疗组中出现(表11)。

表11：平均体重(g)及平均体重增长百分比(％)及其标准差

*与阳性对照组显著不同(Dunnett，P<0.05)。

在试验1中对动物结肠炎的更大的影响可能为由任何治疗导致 的改善留出了更多空间。PB6和美沙拉嗪总是导致结肠节段的重量和 结肠壁大体形态评分与结肠炎阳性对照组明显不同(表12)。

表12：结肠壁的平均大体形态评分及5cm结肠节段的平均净重

*与阳性对照组显著不同(Dunnett，P<0.05)。

用PB6和Mesacol治疗的TNBS诱导的结肠炎大鼠的结肠壁的 健康状况经肉眼观测与无结肠炎的大鼠相同。在试验2中美沙拉嗪治 疗效力略差(原因未知)，导致一些溃疡出现。对纵向剖开的结肠节段 进行肉眼观察明显示出在阳性对照组、S.boulardii和infliximab治疗 组中存在溃疡和坏死组织区域，在PB6治疗组和试验1的美沙拉嗪 组中则不存在这些状况。在试验1中，用infliximab治疗的一只大鼠 的大体形态学评分为1，结肠节段重量为0.402g。这些数据提示在这 个特定动物中，infliximab治疗是成功的，或者未诱导结肠炎。在治 疗结束时，这两个试验中用infliximab治疗的大鼠的平均体重增长和 结肠节段重量均介于结肠炎阴性对照组和结肠炎阳性对照组之间。这 个结果可能提示尽管在这些试验中无统计学意义，但是仍表示 infliximab的一些作用。在一个相似的试验中，其中在用TNBS诱导 结肠炎之前2天，经静脉内给予大鼠3mg/Kg相同剂量的infliximab， 示出对于结肠的大体形态学具有一些作用，但是对于使水肿水平降低 至低于结肠炎阳性对照组水平无作用19。在用PB6治疗的大鼠的结肠 节段中，无溃疡出现。在大多数这些节段中仅观测到充血。PB6明显 削弱经直肠内给予TNBS诱导的大鼠结肠炎症。在先前的试验中观测 到的在诱导后7天用3×1.5109CFU/Kg/天治疗的效力在试验1中证 实20。虽然在先前试验中在诱导后7天用PB6 3×8 107CFU/Kg/天治 疗经推断是无效的，但是在这两个试验中用增加至3×1.58CFU/Kg/ 天的剂量治疗足以使炎症降低至与结肠炎阴性对照组的结果不再有 统计学差别的程度。

结论

设计并实施这项研究以证实和论证在先前的试验中观测到的芽 孢杆菌PB6对抗2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎的效 力，并将其效力与S.boulardii(益生菌)、美沙拉嗪和infliximab(标准 药物)的效力进行对比。这个大鼠模型是经充分确立的，可靠且广泛 用于测试治疗IBD的药物的效力。在诱导结肠炎之后不经任何治疗， 一些大鼠示出轻度腹泻症状，在剩余的试验期间平均体重降低。其结 肠的肠壁的大体形态学的特征在于炎症、溃疡，甚至坏死。用3×1.5 108CFU/Kg/天或者3×1.5 109CFU/Kg/天PB6治疗7天，使得结肠壁 恢复与阴性对照组及用标准药物美沙拉嗪(一种抗炎药物)治疗组在 统计学上相同的健康状态。

实施例4：PB6的代谢物的抗微生物性质 方法与材料

针对不同的指示菌株例如产气荚膜梭菌ATCCl 3124、艰难梭菌 ATCC9689和空肠弯曲杆菌ATCC 33291测试分离自Bactisubtil (Sanofi-synthelabo)的芽孢杆菌PB6和蜡状芽孢杆菌的拮抗作用。

将蜡状芽孢杆菌和芽孢杆菌PB6均悬浮于5ml无菌盐水中。使 用棉药签将所述益生菌悬浮液在胰蛋白胨大豆琼脂平板(Oxoid， Belgium)上划一条线，并将该平板在37℃在有氧条件下保温24小时。

此后，用药签将不同的指示菌株的悬浮液垂直接种这两个芽孢杆 菌培养物，在有氧条件下保温24小时。使用Anaerogen Pak(Oxoid， Belgium)，将用产气荚膜梭菌接种的平板保温24小时，用艰难梭菌 接种的平板在厌氧条件下保温48小时。48小时的空肠弯曲杆菌 ATCC33291培养悬浮液用于做与所述益生菌培养物垂直的四条划线。 用菌种接种的平板在微有氧(micro-aerobic)条件(CampyGen，Oxoid) 下在37℃保温48小时。所做划线必须彼此不接触。在37℃保温之后， 通过所做划线汇合处周围的透明带的出现评估拮抗作用，所述透明带 的出现表示一种生物体对另一种生物体的抑制作用。

结果与讨论

PB6对于产气荚膜梭菌ATCC 13124和艰难梭菌ATCC9689具有 拮抗作用。在这两个菌种的平板上所做划线的交叉点均可观测到透明 带。因为这个菌种的溶血特性，使得对于产气荚膜梭菌的拮抗作用更 明显。如图1所示。尽管在这个图片中不太清楚，但是在PB6与艰 难梭菌培养物的交叉点处仍注意到明显的透明带。

蜡状芽孢杆菌(Bactisubtil)对于产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难 梭菌ATCC9689无拮抗作用。在这个平板上的划线交叉点处未观测 到透明带。这个检测平板的例子如图12所示。

芽孢杆菌PB6对于空肠弯曲杆菌ATCC 33291具有拮抗作用。 在这个平板的划线交叉点处可观测到透明带。这个检测平板的例子如 图13所示。

蜡状芽孢杆菌(Bactisubtil)对于空肠弯曲杆菌无拮抗作用，如图 14所示。

结论

分离自自然界的芽孢杆菌PB6对于产气荚膜梭菌ATCC13124、 艰难梭菌ATCC9689和空肠弯曲杆菌ATCC 33291显然具有拮抗性 质。相反，对于测试的其它人病原菌观测到无作用。蜡状芽孢杆菌 (Bactisubtil)未示出对于产气荚膜梭菌ATCC 13124、艰难梭菌 ATCC9689及其它测试的微生物的任何拮抗作用。

PB6菌株的活细胞于2005年5月27日保藏在位于美国弗吉尼亚 州马纳萨斯市大学道10801的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，指 定保藏号为PTA-6737。根据37 C.F.R.1.801-1.809保藏。

前文的描述和图表包括例证的本发明实施方案。前述实施方案和 方法基于本领域技术人员的能力、经验和优选性可以变化。以一定顺 序列出的方法步骤并非限制本发明方法步骤的顺序。前文的描述和图 表仅是解释和例证了本发明，除了权利要求书范围内的限制之外，本 发明非限于这种限制。本领域技术人员在不偏离本发明范围的前提下 可以对本发明进行修改和变化。

本申请要求2005年11月29日申请的美国专利申请系列号No. 60/740,518的优先权。

发明背景