新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法

本发明涉及一种新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法，具体地讲，涉及一种由培养新的芽孢杆菌Bacillus    sectorramus所得到的α-1，6-葡萄糖苷酶，该菌能在最适pH5.0至5.5、最适温度55℃条件下经培养产生α-1，6-葡萄糖苷酶，另外还涉及一种生产上述新的α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，该方法包括培养上述菌种并收集α-1，6-葡萄糖苷酶。

α-1，6-葡萄糖苷酶具有对淀粉类中的α-1，6-葡萄糖苷键发生作用以产生直链淀粉的能力，并且广泛用于糖化工业，生产麦芽糖、葡萄糖和高果糖玉米糖浆（HFCS）。

α-1，6-葡萄糖苷酶长期以来发现于高等植物和微生物酵母中，但近期有报道许多细菌可以产生这种酶，例如：产气杆菌（Aerobactor    aerogenes），中间埃希氏菌（Escherichia    intermedia），Pseudomonas    amyloderamosa，缓症链球菌，（Sterptococcus    mites），噬纤维菌（Cytop    hage），链霉菌属（Streptomyces）和α-叶红呋喃菌属（Flavochromogenes）等。

另外，在产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌种中，已知的种类有蜡状芽孢杆菌（Bacillus    cereus）（IFO    300），坚强芽孢杆菌（Bacillus    firmus） （IFO    300），Bacillus    acidopullulyticus等。

大多数已知的α-1，6-葡萄糖苷酶具有中性或弱碱性的最适pH值，不适于在糖化工业中使用，工业上的糖化作用一般在酸性条件下进行。

已知由Pseudomonus    amyloderamora，Bacillus    acidopullulyticus等产生的α-1，6-葡萄糖苷酶具有酸性最适pH值，但是由于抗温性差，前者是不能实际使用的;而后者菌体培养时间需长达60-73小时，所以是不经济的。

因此，本发明人试图寻找具备抗温性、酸性的最适pH值和高的α-1，6-葡萄糖苷酶产量的微生物。

本发明人最近在土壤微生物中发现了一种新的芽孢杆菌菌株，它经过10-15小时短时间的培养再收集其产物能够得到大量的α-1，6-葡萄糖苷酶，在此基础上，本发明人完成了本发明。

根据本发明的一个方面，提供了一种生产α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，该方法包括培养能产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌Bacillus    sectorramus使其在培养条件下产生α-1，6-葡萄糖苷酶，然后收集所述的α-1，6-葡萄糖苷酶，它具有如下酶化学性质：

（1）反应：该酶作用于α-1，6-葡萄糖苷键产生线性淀粉;

（2）底物专一性：该酶对多糖具有下列相对活性：

多糖    相对活性（%）

支链淀粉    100

可溶性玉米淀粉    13.5

可溶性淀粉    6.7

牡蛎糖原    1.7

野兔糖原    2.6

玉米淀粉    3.8

马铃薯淀粉    4.0

（3）米氏常数值（Km）和对支链淀粉的Vmax：该酶的Km值为0.14mg/ml，Vmax值为70.0μmol/分钟/mg蛋白质;

（4）最适pH：5.0-5.5;

（5）pH稳定性：该酶在pH范围4.5-6.5、温度40℃条件下可稳定30分钟;在pH值5.0-6.0，温度50℃也可稳定30分钟;

（6）最适温度：约55℃;

（7）热稳定性：该酶在pH值为4.5条件下，分别以不同温度处理30分钟所得结果表明在40℃时，该酶仍保留其初始活性的80%，60℃时活性则为10%;

（8）抑制剂的影响作用：对氯汞苯甲酸或十二烷基硫酸钠至少可抑制该酶活性的70%，但该酶不受邻-菲咯啉或氰铁酸钾的抑制;

（9）金属盐类的影响作用：该酶几乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+或Mn2+的影响，受Fe3+的抑制，并且Hg2+和Ag2+可使其失活;

（10）分子量：约95，500（用SDS电泳法测得）。

图1至5显示本发明的α-1，6-葡萄糖苷酶的酶化学性质，图1中的曲线图显示最适pH值，图2中的曲线图显示在40℃（○）和50℃（●）时的稳定pH范围，图3中的曲线图显示最适温度值，图4中的曲线图显示热稳定性，图5中的曲线图显示在55℃（○）、60℃（□）和65℃（●）及在不同pH条件下酶的稳定性。

用于本发明的α-1，6-葡萄糖苷酶生产菌是一个新的菌种，被本发明人命名为Bacillus    sectorramus。该菌种于1987年9月4日贮存于日本工业科学技术署发酵研究所（1-3，Higashi    1-chome，Yatabemachi，Tsukuba-gun，Ibaraki    305，Japan），保存号为FERM    BP-1471（原始保存号码：FERM    P-8973，于1986年9月22日贮存），于1987年9月23日贮存于中国典型培养物保藏中心，保存号为CCTCC№.M87085，贮存条件符合“以专利程序为目的的微生物贮存国际认可布达佩斯公约”，该菌种在下文中将命名为“主题菌种”（Subject    strain）。

主题菌种具有下列细菌学特性：

A.形态

（1）细胞形状    杆状

（2）细胞大小：    1.0～1.3×1.5～5.2μ

（3）迁移率：    无

（4）孢子：    存在

（5）革兰氏染色：    阳性

（6）耐酸反应：    阳性

B.在不同培养基上生长

（1）标准琼脂平板培养基

菌落为环形并具整齐外缘。表面平滑为半透明灰白色。

（2）标准琼脂斜面培养基

沿培养基直着生长并具平滑的表面、奶黄色具光泽，生长适中。

（3）标准液体培养基

轻微混浊并具粉状沉淀物。无色素形成。

（4）标准明胶穿刺培养基

直的并无液化作用。

（5）石蕊牛乳

无变化。

C.生理学特性

（1）硝酸盐还原作用    阳性

（2）脱氮作用    阳性

（3）甲基红试验    阳性

（4）乙酰甲基甲醇的形成    阴性

（5）吲哚的形成    阴性

（6）硫化氢的形成    阴性

（7）淀粉的水解    阳性

（8）柠檬酸的同化    阳性

（9）无机氮源（硝酸盐和铵盐）的同化    阳性

（10）色素的形成    阴性

（11）脲酶活性    阴性

（12）氧化酶活性    阴性

（13）过氧化氢酶活性    阳性

（14）生长范围：

pH值    4.0-7.1

温度    45.5-15.0℃

（15）对氧的行为    厌气性

（16）二氧化丙酮的形成    阴性

（17）马尿酸的分解    阴性

（18）精氨酸的分解    阴性

（19）苯丙氨酸的脱氨基作用    阴性

（20）温度抗性（85℃，10分钟）    阳性

（21）氯化钠抗性    7%    阴性

3.5%    阳性

（22）在Sabouraud氏琼脂培养基中生长    阳性

（23）在0.001%溶菌酶培养基中生长    阳性

（24）酪氨酸的分解    阳性

（25）在柠檬酸-铵琼脂培养基中的

碱性生成作用    阳性

（26）酪蛋白的分解    阴性

（27）明胶的分解    阴性

（28）在厌气性培养基中生长    阳性

（29）在Mc    Conkey氏培养基中生长    阴性

（30）卵磷脂酶反应    阴性

（31）在VP培养基中产碱能力    阴性

（32）糖的同化作用和产酸能力

（a）L-阿拉伯糖    阳性

（b）D-木糖    阳性

（c）D-葡萄糖    阳性

（d）D-甘露糖    阳性

（e）D-果糖    阳性

（f）D-半乳糖    阳性

（g）麦芽糖    阳性

（h）蔗糖    阳性

（i）乳糖    阴性

（k）D-山梨（糖）醇    阴性

（l）D-甘露（糖）醇    阴性

（m）肌醇    阴性

（n）甘油    阳性

（o）淀粉    阳性

（p）蜜二糖    阳性

（q）水扬苷    阴性

（r）乙醇    阳性

参考Bergey氏细菌学鉴定手册，Willams    &    Wilkins公司，第8版（1974）和国际系统细菌学杂志，1974-1986年，以及该菌所具有的革兰氏阳性，存在有孢子和厌气性生长等特性，由上述特性检索表可揭示该细菌是芽孢杆菌属中的一种。

主题菌种不同于芽孢杆菌属中的任何一种，但与蜡状芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌有些相似，由于其细胞相对较厚，为1.0-1.3μ。

然而这些菌种与本发明之菌种可依如下几点区分开来。

蜡状芽孢杆菌生长于7%的食盐中，并在卵黄反应、酪蛋白分解和明胶分解作用中呈阳性，但主题菌种不能在7%的食盐中生长并且在卵黄反应、酪蛋白分解和明胶分解中呈阴性。

另外巨大芽孢杆菌也生长于7%的食盐中，并且酪蛋白分解和明胶分解呈阳性结果，但主题菌种不能在7%食盐中生长而且酪蛋白分解和明胶分解呈阴性结果。

进一步讲，主题菌种还可与芽孢杆菌属中一个新的菌种Bacillus    acidopullulyticus（于日本专利公开号№. 43994/1986中有描述）区分开来，列于表1：

表1

主题菌种    Bacillus

acidopullulyticus

氧气要求    厌气性    厌气性

对食盐抗性    可在3.5%食盐    不能在3.5%

中生长    食盐中生长

酪氨酸的分解    阳性    阴性

柠檬酸盐的同化    阳性    阴性

通过甘露（糖）醇

的产酸作用    阴性    阳性

VP反应    阴性    可变的

酪蛋白的分解    阴性    可变的

通过阿拉伯糖和木糖

的产酸作用    阳性    可变的

营养细胞的厚度    1.0-1.3μ    0.6-1.0μ

因此，如上所述，主题菌种作为一种新菌种而区别于芽孢杆菌 属中任何已知的和从前经过命名的菌种。

以下将对通过培养主题菌种来生产和收集α-1，6-葡萄糖苷酶的条件作出说明。

首先，一种能提供高活性支链淀粉酶的合适的培养基含有适宜的无机盐;碳源如：淀粉-可溶性淀粉，蜡质淀粉、土豆淀粉和水解过的淀粉，像麦芽糖和糊精，氮源如：水解后的蛋白质，像多肽胨、肉汤、酵母浸出液、玉米浆、磷酸氢二铵、酪蛋白、大豆蛋白质等。

将主题菌种接种在如上所述的培养基中，调pH至4.0-7.0，在20-45℃条件下以静止或有气条件下摇动、或通气搅拌的方法对菌种进行培养1-2天（若10-20小时效果最佳）。

经过培养，将细胞移出液体培养基，得到的上清部分经浓缩得到支链淀粉酶粗品。该制备物用硫酸铵分馏，然后经过γ-环状糊精-Sepharose6B亲和层析，再利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化为单带。其中γ-环状糊精同Sepharose6B（商品名，Pharmacia精密化学公司）偶联生成亲和层析的基物。如下所述为经纯化后的α-1，6-葡萄糖苷酶的酶化学特性。

1.反应：该酶作用于α-1，6-葡萄糖苷键产生直链淀粉。

2.米氏常数Km和对底物的Vmax：本发明之酶对底物支链淀粉、马铃薯支链淀粉和玉米支链淀粉的Km值（mg/ml）和Vmax值（μmol/分钟/mg蛋白质）列于表2之中：

表2

底物    Km    Vmax

支链淀粉    0.14    70.0

马铃薯支链淀粉    3.3    10.65

玉米支链淀粉    3.4    10.97

3.对多糖类的相对活性：表3显示该酶对可溶性玉米支链淀粉，可溶性淀粉、牡蛎糖原、野兔糖原、玉米支链淀粉和马铃薯支链淀粉所具有的相对活性（相对于支链淀粉的活性）。

表3

多糖类    相对活性（%）

支链淀粉    100

可溶性玉米支链淀粉    13.5

可溶性淀粉    6.7

牡蛎糖原    1.7

野兔糖原    2.6

玉米支链淀粉    3.8

马铃薯支链淀粉    4.0

4.最适pH：在25毫摩尔柠檬酸和50毫摩尔的磷酸氢二钠缓冲溶液中，其最适pH为5.0-5.5（见图1）。

5.pH稳定性：在25毫摩尔柠檬酸-50毫摩尔磷酸氢二钠缓冲溶液中，当pH范围在4.5-6.5时，该酶可在40℃条件下稳定存在30分钟;当pH范围在5.0-6.0时，该酶可在温度50℃下稳定存在30分钟（参见图2）。

6.最适温度：在50毫摩尔乙酸缓冲液中（pH4.5），该酶的最适温度约55℃（参见图3）。

7.热稳定性：在不同温度下于50毫摩尔乙酸缓冲液（pH4.5）中分别处理30分钟，结果该酶在40℃时保持其原始活性的80%;但在60℃时则为10%（参见图4）。

8.活性试验：将4毫升0.5%支链淀粉溶液（pH4.5）加入到1毫升酶溶液中，反应在40℃下进行30分钟。然后加2毫升Somogyi溶液，将混合物加热20分钟后冷却。冷却后，加入1毫升钼砷酸铵，加水至总体积为25毫升。以厚度为1厘米测该溶液在500纳米时的吸光率。在上述条件下，以每分钟产生相当于1微摩尔葡萄糖的还原糖定义为一个活性单位。

9.抑制剂的影响作用：对氯汞苯甲酸（PCMB）或SDS可抑制该酶活性的70%甚至更多，但其活性不受邻菲咯啉或氰铁酸钾的抑制，各种不同抑制剂的影响作用见表4，其中显示了当温度40℃，在50毫摩尔乙酸缓冲液（pH4.5）中用终浓度1毫摩尔抑制剂处理30分钟后，该酶所保留的活性。

表4

抑制剂    保留的活性（%）

无    100

EDTA    93.1

邻菲咯啉    109.0

PCMB（对氯汞苯甲酸）    27.1

N-乙基顺丁烯二酰亚胺    65.5

氰铁酸钾    102.0

SDS    1.5

一碘乙酸    66.5

10.金属盐的影响作用：该酸几乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+和Mn2+等的影响，受Fe3+的抑制，Hg2+和Ag2+可使其失活。各种不同金属盐的影响作用见于表5，其中显示当40℃时，在50毫摩尔乙酸缓冲液中用终浓度5毫摩尔的金属盐处理30分钟后，该酶所保留的活性。

表5

金属盐    保留的活性（%）

无    100

Mg Cl2·6 H2O 91.3

Mg Cl2·4 H2O 85.9

Co Cl287.7

Ca Cl279.1

Sr Cl274.5

Ni Cl2·6 H2O 102.7

Ba Cl298.9

Fe Cl2·n H2O 82.1

Cu Cl2·2 H2O 73.4

Zn Cl297.3

Hg Cl20

Ag Cl22.7

Sn Cl2·2 H2O 82.1

Cd Cl2·21/2 H2O 92.4

Fe Cl357.8

11.分子量：大约95，500（用SDS电泳法）。

如下所示，本发明所得酶明显区别于日本专利公开号 174，089/1982所公开的那种酶（下文称之为酶A）。

1.本发明的生产菌种是Bacillus    sectorramus，它是芽孢杆菌属中一种新的菌种，而酶A的生产菌是Bacillus    acidopullulyticus。

2.根据本发明，该酶的最适温度为55℃，而酶A的最适温度则是60℃。

3.考查在不同pH值和温度时的酶活性，如图5所示该主题酶在不同温度时活性表现出很大的差异。另外在酶活性对pH值依赖性方面，其活性在pH值为5.0时出现峰值，并随pH值的增加或减少活性迅速下降。酶A在这方面与该酶的行为则完全不同。

4.在最适pH值方面，同pH范围为3.5-5.5的酶A相比较，本发明的酶具有很窄的最适pH范围5.0-5.5并具有很高的专一性。

因此可以断定由本发明所得α-1，6-葡萄糖苷酶是不同于酶A的一种新酶。

可在以葡糖淀粉酶作用淀粉制备葡萄糖的过程中，加入本发明所得α-1，6-葡萄糖苷酶，达到提高产率的目的;或与β-淀粉酶一起用于以高产率从淀粉生产麦芽糖。

现以如下实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

将Bacillus    sectorramus（CCTCC    №.M87085） 接种在含下列成分的培养基上：

可溶性淀粉    1.5%

肉汤    0.5%

（NH4）2HPO40.3%

K2HPO40.1%

Mg SO4·7H2O 0.1%

初始pH值    5.5

然后在37℃，于Sakaguchi氏瓶中摇荡培养20小时，从培养液中得到一种活性为8.1u/ml;的支链淀粉酶。经离心去除固体物质和细胞，所得上清液用超滤膜浓缩。接着加入冷乙醇达到浓度为80%使该酶沉淀，离心分离沉淀并且冷冻干燥得到粉状的支链淀粉酶。

实施例2

将Bacillus    sectorramus（CCTCC    №.M87085）接种在含下列成分的培养基上：

麦芽糖    2%

酵母浸出液    0.5%

K2HPO40.2%

MgSO4·7H2O 0.1%

初始pH值    4.5

装入一个30升的发酵罐中，在37℃下，充气搅拌培养16小时，从培养液中获得一种活性为13.6u/ml的支链淀粉酶。经离心去除液体中的固体物质和细胞，用超滤膜将所得上清液浓缩约20倍得到200u/ml（pH4.5）的支链淀粉酶液体粗品。将该粗品用硫酸铵分馏再经过γ-环状糊精-Sepharose    6B亲和层析制得76.7u/mg蛋白质的纯化酶制品。

实施例3

将Bacillus    sectorramus（CCTCC    №.M87085）接种在含下列成分的培养基上：

蜡状淀粉    2%

多肽胨    1%

K2HPO40.2%

Mg SO4·7H2O 0.1%

初始pH值    5.0

装入一个1000升的罐中，在37℃下，充气搅拌培养15小时，从培养液中得到一种活性为18.2u/ml的支链淀粉酶。将该液体按与实施例2相似的方法处理制得大约26升约300u/ml支链淀粉酶的液体粗品。

试验实施例1

用于糖化作用的底物：玉米淀粉（33克/分升，消光度8.0）。

用于糖化作用的酶：Gluczyme（Amano    Pharmaceutical    co.，Ltd）（2.5u/g    D.S.）。

主题酶：由实施例3所得支链淀粉酶液体（0.1u/克D.S.）。

糖化作用温度    62℃

糖化作用在上述条件下进行，并于不同时间以高效液相色谱法（HPLC）检测其中单糖（G1）、双糖（G2）、三糖（G3）和多糖（Gn）的含量。对照反应不使用主题酶，在相同的糖化条件下进行检测，所得结果汇总于表6。

表6

反应时间    糖类    加入酶    对照

24小时    G1（单糖）    92.6%    90.9%

G2（双糖）    2.4%    2.3%

G3（三糖）    0.6%    0.6%

Gn（多糖）    4.4%    6.4%

48小时    G1（单糖）    95.3%    94.2%

G2（双糖）    2.7%    0.3%

G3（三糖）    0.6%    0.3%

Gn（多糖）    1.4%    2.9%

72小时    G1（单糖）    95.3%    94.7%

G2（双糖）    3.2%    3.1%

G3（三糖）    0.6%    0.4%

Gn（多糖）    0.9%    1.8%

通过对新菌种Bacillus    sectorramus（CCTCC    №.M87085）短时间的培养，本发明可以生产出一种新的α-1，6-葡萄糖苷酶，并因此使得大量经济地生产热稳定的α-1，6-葡萄糖苷酶成为现实，同时为淀粉糖化工业作出贡献。