3-羟基丁酮是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种， 主要用作配置奶油、乳品、酸奶和草莓等香型的香料。3-羟基丁酮具有令人愉快的奶 油香味，多用作奶油、干酪、咖啡、坚果等食品的香味增强剂；它还可以改变啤酒的 风味，确定奶酪发酵过程中的香味等。现在人们生活水平日益提高，奶制品消费不断 增长，对其口味也有进一步的要求，利用奶油香味改善食品的口味已成为时尚。现在3 -羟基丁酮食用香料产品的研究开发已经引起国内外生产厂家和科研机构的重视。
目前，国外3-羟基丁酮实验室制备工艺主要有：从含有3-羟基丁酮的植物中萃 取的方法、生物法、在催化剂条件下氧化丁酮法、电化学氧化丁酮法和在硫酸水溶液 中用铊盐水解直链酮类的方法、以丁二酮或2，3-丁二醇为原料合成等方法。
有关3-羟基丁酮生产的研究，早在20世纪初就有报道，其方法是通过锌和酸部 分还原丁二酮；另一种3-羟基丁酮合成方法是通过2，3-丁二醇选择性氧化得到。近 年来，有许多关于用生物法制备3-羟基丁酮的报道，如通过山梨糖菌或生膜菌作用于 2，3-丁二醇，或者通过曲霉菌、青霉菌等真菌作用于甘蔗汁，这些工艺方法目前只是 处在实验室研究中。但由于环保需求以及未来社会绿色化工的需要，这些生物合成法 将是未来的主要研究方向。
国内外3-羟基丁酮工业化生产方法主要是采用以丁二酮为原料的化学合成法。 1989年日本Ehime大学在Zn-ZnCl-EtOH体系中还原丁二酮得到相应的3-羟基丁 酮。该方法是在常压下加热回流进行反应，再经过进一步的分离、纯化即可得到3-羟 基丁酮。回流温度在70～80℃左右，产品收率为71％。1992年我国杭州大学开发了用 NaHSe还原制备3-羟基丁酮的方法。该方法是在硼氢化钠溶液中加入硒粉，抽真空 后反应生成NaHSe，然后再加入乙酸和乙醇的混合液体以及溶解在四氢呋喃中的丁二 酮，室温下搅拌反应。产品得率为57％。
1998年英国Witwatersrand大学的Martin Studer等应用经过10，11-二氢金鸡纳 (HCD)改性的铂作为催化剂选择性地加氢还原丁二酮。他们先将丁二酮、催化剂以 及在甲苯溶剂中的HCD加入到高压反应釜中，反应压力为10.7MPa，温度为0～25℃， 反应进行10min左右停止，产品收率为85％，可以获得具有一定旋光性的产品。这是 一个催化加氢反应，反应条件的控制十分关键，如果继续反应，3-羟基丁酮将进一步 转化为2，3-丁二醇，产品收率只有50％。英国Hull大学的J.A.Slipszenko等也开展 了以铂为催化剂选择性地催化加氢还原丁二酮的研究。但他们所用的溶剂为二氯甲烷， 反应压力为1MPa，反应温度为5～25℃，其产率为85％，在反应中对反应时间以及氢 气分压进行一定的控制，可以使(R)-3-羟基丁酮的对映体过量，产率达70％。
催化加氢反应需要在高压下进行，设备要求高，而且反应所用催化剂是贵金属， 价格昂贵，对于催化剂的制备、改性以及中毒、再生等一系列问题尚未解决，目前尚 处于实验室研究阶段，还不能工业化。
1992年，美国的Hummel等应用微生物菌体中的酶作为生物催化剂进行还原反应。 该方法是培养乳酸杆菌或酵母菌以获得丁二酮还原酶，并在pH值为5、温度为70℃的 条件下，应用该还原酶及辅酶NADPH催化丁二酮还原为3-羟基丁酮，其产率最高达 100％。由于许多酶的催化具有立体专一性，催化反应仅生成某一构型的手性产物，而 不产生对映体或对映体量极少。这种利用还原酶进行还原反应其优势十分明显，可以 获得高选择性、高产率的产品，而且产品应用于食品添加剂也更加安全无毒，容易实 现工业化。但这一方法的关键步骤就是要能够培养出反应所需的丁二酮还原酶，对于 这种生物合成的方法，目前国外报道比较多，在强调绿色化工的今天，这是一个非常 重要的研究方向。
微生物发酵法生产3-羟基丁酮是生物法生产3-羟基丁酮的一个重要分支。以葡 萄糖或其它能够转化生成丙酮酸的化合物为底物发酵生产3-羟基丁酮的代谢途径已经 研究地比较清楚(附图1)，这为微生物发酵法生产3-羟基丁酮提供了理论指导。虽 然有很多国外关于微生物发酵法生产3-羟基丁酮的文献和少量专利报道，但目前基本 上都只处在实验室上游研究阶段；国内也有很少这方面的研究工作，但结果不详。从 自然界中筛选分离高产3-羟基丁酮的微生物菌种是发酵法生产3-羟基丁酮工作中重 要的一环。现在人们已发现的可以产生3-羟基丁酮的菌种有：肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophilia)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜热 链球菌(Streptococcus thermophilus)、肠膜状明串珠菌(Leuconoctoc mesenteroides)、 乳酸明串珠菌(Leuconoctoc lactis)、酒明串珠菌(Leuconoctoc oenos)、假肠膜状明串 珠菌(Leuconoctoc pseudomesenteroides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、季氏有胞汉逊酵母(Hanseniaspora guillieromondii)、卡尔斯伯氏 酿酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、路氏酿酒酵母(Saccharomycodes ludwigii)、 拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailli)、发酵性结合酵母(Zygosaccharomyces fermentati)等。但是上述所有涉及的菌种都存在3-羟基丁酮的发酵浓度较低的问题， 或者3-羟基丁酮只是作为发酵生产2，3-丁二醇的副产物。这些原因导致难以利用上 述微生物菌种工业化发酵生产3-羟基丁酮。
上述从植物中提取3-羟基丁酮的方法的原料来源有限，且原料中3-羟基丁酮的 含量太低，提取成本太高，无法实现工业化；化学合成法普遍存在较严峻的环保问题， 反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不是绿色天然的；生物合成法，包括 微生物发酵法等大多因菌种、酶活、发酵条件优化及过程控制等等问题使得产物浓度 太低，现在只处于实验室研究阶段，还未见工业化报道。

本发明的目的在于针对现有生产3-羟基丁酮方法中的技术难点及存在的问题， 提供一株新分离的以葡萄糖或蔗糖为底物高产3-羟基丁酮的短小芽孢杆菌，可以用此 菌株发酵生产3-羟基丁酮。
本发明涉及的短小芽孢杆菌为Bacillus pumilus XH195，已于2004年1月27日保 藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏号为DSM 16187。
上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm， 直径0.6μm～0.7μm(附图2)，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可 利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80， 可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在50℃条件下生长；该菌 株的生理生化特征如下表：
Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的生理生化特征     特征     结果     棒杆状     直径     长     芽孢     椭圆体     肿胀孢子囊     VP反应     VP反应的pH值     利用糖产酸     葡萄糖     阿拉伯糖     木糖     甘露醇     果糖     利用葡萄糖产气     水解反应     酪蛋白     明胶     淀粉     吐温80     七叶灵     利用柠檬酸盐     +     0.6μm～0.7μm     1.5μm～3.0μm     +     +     -     +     5.0       +     +     +     +     +     -       +     +     -     +     -     +     利用丙酸盐     降解酪氨酸     苯丙氨酸脱氨酶     NO3到NO2     吲哚     pH 5.7时生长     不同NaCl浓度时生长     2％NaCl     5％NaCl     7％NaCl     10％NaCl     不同温度时生长     45℃       50℃       55℃       0.001％溶菌酶时生长     精氨酸脱氢酶     -     -     -     -     -     +       +     +     +     +       +     +     -     +     -
上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂 肪酸图谱。
上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的16S rDNA序列与其它不同种的短 小芽孢杆菌的16S rDNA序列有98.7％～100％的相似性。
上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株可以在高糖LB培养基中生长。
上述高糖LB培养基配方如下：1L蒸馏水中含：200g葡萄糖，10g蛋白胨，5.0g 酵母粉，10g NaCl，121℃条件下灭菌15min。固体高糖LB培养基是在上述配方的 基础上加入20g/L的琼脂粉。
上述短小芽孢杆菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株用于发酵法生产3 -羟基丁酮。
用上述短小芽孢杆菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株以葡萄糖发酵培 养基或蔗糖发酵培养基发酵生产3-羟基丁酮，发酵温度为30℃～40℃，在300ml的 锥形瓶中装50ml发酵液，置于摇床上以160r/min～220r/min的转速培养40h～70h， 可得到成熟的3-羟基丁酮发酵液。
上述葡萄糖发酵培养基配方如下：1L蒸馏水中含：200g葡萄糖，50g NH4Cl，0.50 g KH2PO4，4.0g K2HPO4·3H2O，2.0ml 10g/L的CaCl2水溶液，2.0ml 100g/L的 MgCl2·6H2O水溶液，200μl 10g/L的FeCl3水溶液，200μl 50g/L的NaCl水溶液，5.0ml 10g/L的酵母粉水溶液，5.0ml的金属离子混合液，200μl的维生素混合液，121℃条 件下灭菌15min。其中金属离子混合液组成为：1L蒸馏水中含：ZnCl2 0.50g，FeCl3 0.50 g，MnCl2·4H2O 0.50g，NaMoO4·2H2O 0.10g，CuCl2·2H2O 0.050g，Na2WO4·2H2O 0.050g， HCl 120mmol/L。其中维生素混合液组成为：1L蒸馏水中含：0.40g泛酸钙，0.20g 肌醇，0.40g尼克酸，0.40g VB6，0.20g对氨基苯甲酸，0.5mg VB12。
上述蔗糖发酵培养基配方与上述葡萄糖发酵培养基配方相同，只是将200g葡萄糖 改为180g蔗糖。
上述短小芽孢杆菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，在装有灭菌的50 ml上述葡萄糖发酵培养基的300ml锥形瓶中，于37℃条件下，在摇床上以180r/min 的转速培养60h，可得到浓度为63.0g/L的3-羟基丁酮发酵液。
上述短小芽孢杆菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，在装有灭菌的50 ml上述蔗糖发酵培养基的300ml锥形瓶中，于37℃条件下，在摇床上以180r/min的 转速培养60h，可得到浓度为58.1g/L的3-羟基丁酮发酵液。
得到上述3-羟基丁酮发酵液后，采用常规的萃取方法可获得天然的、具有旋光 性的3-羟基丁酮产品。
本发明提供的高产3-羟基丁酮的短小芽孢杆菌，即Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，解决了微生物发酵法生产3-羟基丁酮中的瓶颈问题。即背景技术中所涉 及的非本发明的菌种都存在3-羟基丁酮的发酵浓度较低，或者3-羟基丁酮只是作为 发酵生产2，3-丁二醇的副产物等原因所导致的难以工业化发酵法生产3-羟基丁酮问 题。
本发明所提供的利用微生物发酵生产3-羟基丁酮的方法具有原料价廉易得、反 应条件温和、3-羟基丁酮产物浓度较高(摇瓶3-羟基丁酮的发酵浓度可达63.0克/ 升)、产品提取方法简单、产品绿色天然且具有旋光性、成本较低、环境友好等优点。

附图1为以葡萄糖为底物生产3-羟基丁酮的代谢途径。
附图2为本发明的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株在德国微生物菌种保 藏中心所作的放大2700倍的电镜照片。
附图3为本发明的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株在葡萄糖发酵培养基中 发酵生产3-羟基丁酮的结果。
附图4为本发明的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株在蔗糖发酵培养基中发 酵生产3-羟基丁酮的结果。

实施例1：耐高糖并且产3-羟基丁酮菌株的筛选
从苹果园、葡萄园等地取得土样，用高糖LB培养基浸泡24h，在300ml锥形瓶 中装浸泡液50ml，在37℃条件下，置于摇床上以180r/min的转速培养48小时。将培 养液以10-2、10-3两个稀释度涂布在固体高糖LB培养基的培养皿中，37℃培养24h， 挑出单菌落，扩大培养，检测3-羟基丁酮产量，得到耐高糖并且产3-羟基丁酮的菌 株。上述高糖LB培养基配方为：1L蒸馏水中含：200g葡萄糖，10g蛋白胨，5.0g 酵母粉，10g NaCl，121℃条件下灭菌15min。固体高糖LB培养基是在上述配方的基 础上加入2g/L的琼脂粉。
实施例2：通过诱变育种得到本发明菌株
挑取固体高糖LB培养基斜面培养的由实施例1得到的耐高糖并且产3-羟基丁酮 的菌株一环，接种在装有灭菌的50ml高糖LB培养基的300ml锥形瓶中，在37℃条 件下，置于摇床上以180r/min的转速培养24小时，即制得耐高糖并且产3-羟基丁酮 菌株的细胞液体培养物。
将制得的上述细胞液体培养物以3000r/min离心5min，倾去上清，将菌体打散加 入无菌生理盐水再离心洗涤。将菌悬液放入一已灭菌的、装有玻璃珠的三角瓶内用手 摇动，以打散菌体。将菌液倒入设有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内， 作为待处理菌悬液。
用分析天平称取1mg亚硝基胍，加入2ml 0.1mol/L pH6.0的磷酸缓冲液，于暗处 振荡溶解。吸取亚硝基胍溶液1ml，加入到1ml上述待处理菌悬液中，37℃振荡30min， 立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2、10-3、10-4、10-5四个稀释度涂布在固体高糖LB 培养基的培养皿中，37℃培养36小时，挑出单菌落，扩大培养，检测3-羟基丁酮产 量，挑选其中最高产量的菌株，即得到本发明菌株。
上述本发明菌株形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm(附图2)， 菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、 甘露醇、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl 的培养基中生长，可在50℃条件下生长，其脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂肪酸图 谱，其16S rDNA序列与其它不同种的短小芽孢杆菌的16S rDNA序列有98.7％～100％ 的相似性。
本发明菌株定名为Bacillus pumilus XH195，已于2004年1月27日保藏于德国微 生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Braunschweig，Germany)，其保藏号为DSM 16187。
实施例3：制备上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的细胞液体培养物
挑取固体高糖LB培养基斜面培养的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株一 环，接种在装有灭菌的50ml高糖LB培养基的300ml锥形瓶中，在37℃条件下，置 于摇床上以180r/min的转速培养24h，即制得Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌 株的细胞液体培养物。
实施例4：利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，以葡萄糖发酵培养 基获得成熟的3-羟基丁酮发酵液
将通过实施例3的方法获得的Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株的细胞液体 培养物以50ml/L的接种量接种在装有灭菌的50ml葡萄糖发酵培养基的300ml锥形 瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以180r/min的转速培养，间隔4h取样并检测3- 羟基丁酮含量，在第60h 3-羟基丁酮的浓度达到63.0g/L。在第60h将锥形瓶从摇床 上取下停止发酵，即得成熟的3-羟基丁酮发酵液。
上述葡萄糖发酵培养基配方如下：1L蒸馏水中含：200g葡萄糖，50g NH4Cl，0.50 g KH2PO4，4.0g K2HPO4·3H2O，2.0ml 10g/L的CaCl2水溶液，2.0ml 100g/L的 MgCl2·6H2O水溶液，200μl 10g/L的FeCl3水溶液，200μl 50g/L的NaCl水溶液，5.0ml 10g/L的酵母粉水溶液，5.0ml的金属离子混合液，200μl的维生素混合液，121℃条 件下灭菌15min。其中金属离子混合液组成为：1L蒸馏水中含：ZnCl2 0.50g，FeCl3 0.50 g，MnCl2·4H2O 0.50g，NaMoO4·2H2O 0.10g，CuCl2·2H2O 0.050g，Na2WO4·2H2O 0.050g， HCl 120mmol/L。其中维生素混合液组成为：1L蒸馏水中含：0.40g泛酸钙，0.20g 肌醇，0.40g尼克酸，0.40g VB6，0.20g对氨基苯甲酸，0.5mg VB12。
实施例5：利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改变发酵条件，以 葡萄糖发酵培养基获得成熟的3-羟基丁酮发酵液
重复实施例4的操作，只是将发酵温度改为30℃，摇床转速改为220r/min。在第 70h 3-羟基丁酮的浓度达到53.2g/L。
实施例6：利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改变发酵条件，以 葡萄糖发酵培养基获得成熟的3-羟基丁酮发酵液
重复实施例4的操作，只是将发酵温度改为40℃，摇床转速改为160r/min。在第 40h 3-羟基丁酮的浓度达到55.7g/L。
实施例7：利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，以蔗糖发酵培养基 获得成熟的3-羟基丁酮发酵液
重复实施例4的操作，只是将葡萄糖发酵培养基改为蔗糖发酵培养基。在第60h 3 -羟基丁酮的浓度达到58.1g/L。
上述蔗糖发酵培养基配方与实施例4中葡萄糖发酵培养基配方相同，只是将200g 葡萄糖改为180g蔗糖。
实施例8：利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改变发酵条件，以 蔗糖发酵培养基获得成熟的3-羟基丁酮发酵液
重复实施例7的操作，只是将发酵温度改为33℃，摇床转速改为200r/min。在第 68h 3-羟基丁酮的浓度达到54.1g/L。
实施例9：利用上述Bacillus pumilus XH195 DSM 16187菌株，改变发酵条件，以 蔗糖发酵培养基获得成熟的3-羟基丁酮发酵液
重复实施例7的操作，只是将发酵温度改为40℃，摇床转速改为170r/min。在第 45h 3-羟基丁酮的浓度达到55.1g/L。