블랙베리 식초를 함유하는 간기능 개선용 음료 및 이의 제조방법

블랙베리 식초를 함유하는 간기능 개선용 음료 및 이의 제조방법{Liver protecting beverage containing blackberry vinegar and its preparing method}

본 발명은 블랙베리 식초를 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 음료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 과산화수소 및 하이드록실라디칼(hydroxyl radical)과 같은 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 제노바이오틱스(xenobiotics), 약물, 중금속, 자외선(UV), 및 이온화방사선(ionizing radiation)과 같은 다양한 인자에 의해서 유도된다. 비록, ROS가 정상 생리학적 상태에서 중요한 역할을 담당하지만, 높은 수준의 ROS는 단백질, 지질 및 DNA와 같은 다양한 세포의 생물분자에 손상을 유발시키며(Kaspar, JW, et al., Free Radical Biology and Medicine , 2009), 노화, 암, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 당뇨 및 퇴행성 뇌질환과 연관되어 왔다(Wiseman, H., et al., Biochemical Journal , 1996). 살아있는 유기체는 ROS 형성을 방지하거나 또는 ROS를 무독화시키기 위한 다양한 기작을 발달시켜왔다. 이러한 기작은 과산화물제거효소(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(CAT, catalase) 및 글루타티온 페옥사이드(glutathione peroxidase, GPx)와 같은 항산화 효소 및 글루타티온(glutathione, GSH), 요산(uric acid), 및 비타민 C 및 E와 같은 비효소 항산화물질이 관련된다(Issa, AY, et al., Journal of Food Composition and Analysis , 2006; Mohammadi, M. et al., Food and Chemical Toxicology , 2009).

블랙베리(blackberry)( Rubus fruticosus L. )는 우수한 천연 항산화제로서, 다양한 치료 목적으로 사용되어 왔다. 근래의 연구에서 블랙베리는 암 및 심혈관 질환의 위험을 감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Cuevas-Rodriguez et al., 2010a). 블랙베리는 안토시아닌(anthocyanin)과 플라보놀(flavonol), 페놀산(phenolic acid), 엘라그산(ellagic acid), 비타민 C 및 E와 같은 다른 항산화물질을 다량 포함하고 있다고 알려졌다(Bowen-Forbes, CS, et al., Journal of Food Composition and Analysis , 2010). 블랙베리의 주요 폴리페놀(polyphenolic) 화합물인 안토시아닌(anthocyanin)은 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 과산화수소 및 하이드록실라디칼(hydroxyl radical)과 같은 다양한 ROS의 스캐빈저(scavenger)이다(Cuevas-Rodriguez et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry , 58, 9542-9548, 2010). 다양한 연구에서 항산화 물질 및/또는 항염증제로서의 잠재적인 생물학적 이점에 대해서 보고된바 있다(Hassimotto, NMA, et al., Journal of the Science of Food and Agriculture , 2010). 그러나, 블랙 베리의 간기능 개선에 대한 기능적 역할에 대해서 알려진 바가 매우 적다.

CCl ₄ (carbon tetrachloride)는 대표적인 급성 간 독성 유발 물질로 현재까지 CCl ₄ 의 정확한 작용기전은 알려져 있지 않으나 체내로 흡수된 CCl ₄ 가 간장 내 약물대사 효소계에 의해 CCl ₃ (trichloromethyl radical)로 대사되어 세포막의 지질과산화를 초래하여 막의 구조와 기능을 파괴함으로써 간 세포 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 세포막의 구조와 기능이 파괴되게 되면 간 세포질 내에 널리 존재하는 효소인 알라닌 아미노전이효소(Alanine Aminotransferase, ALT) 및 아스파진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST)가 혈액으로 유출되므로 혈액 내 ALT 및 AST 수치는 간 손상의 지표로 빈번히 사용되고 있다.

이에, 본 발명자들은 간 손상을 유발시킬 수 있는 CCl ₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에 본 발명에 따른 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물을 처리하였을 때, 항산화 효소인 GPx의 활성을 증가시키고, 간 손상 지표인 아미노전이효소(Alanine Aminotransferase, ALT) 및 아스파진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST) 수치를 현저히 감소시키므로, 간기능 개선에 효과적으로 사용 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 블랙베리( Rubus fruticosus L. ) 식초를 함유하는 간기능 개선용 음료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 블랙베리 식초 4 내지 10 중량부, 블랙베리 농축액 0.5 내지 3 중량부, 사과농축액 0.5 내지 3 중량부, 액상과당 6 내지 15 중량부, 플락토 올리고당 1 내지 5 중량부, 효소처리 스테비아 0.001 내지 0.020 중량부, 구연산 0.1 내지 0.5 중량부, 연잎추출물 0.01 내지 0.1 중량부, 라즈베리 향료 0.01 내지 0.1 중량부 및 정제수 70 내지 90 중량부를 혼합하여 교반하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 혼합하여 교반된 액을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과된 액을 살균한 후, 여과하는 단계를 포함하는 블랙베리 식초를 함유하는 간 기능 개선용 음료 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 블랙베리 식초를 함유하는 간 기능 개선용 음료 조성물을 제공한다.

본 발명의 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물은 간 독성을 유발한다고 알려진 CCl ₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에서 산화 스트레스에 대한 보호효과 및 간 손상을 회복시키는 효과를 보이므로, 간 기능 개선용 건강보조식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 초산발효(acetic acid fermentation) 동안 산도(Titratable acidity) 및 알코올 함량(Alcohol content)을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 음료 조성물의 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 항산화 효소 GPx 활성 증가 효과를 나타낸 도이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.05; 및
*: CCl ₄ 처리군에 대하여, p<0.05;
도 3은 본 발명의 음료 조성물의 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 간 보호효과를 측정한 그래프이다.
도 3의 A는 본 발명의 음료 조성물의 CCl ₄ 처리에 의하여 유도된 간 손상의 회복을 혈청내 아르파라진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST) 수준을 통하여 확인한 그래프이다:
#: 대조군에 대하여, p<0.001;
*: CCl ₄ 처리군에 대하여, p<0.05; 및
**: CCl ₄ 처리군에 대하여, p<0.01.
도 3의 B는 본 발명의 음료 조성물의 CCl ₄ 처리에 의하여 유도된 간 손상의 회복을 혈청내 알라닌 아미노전이효소(Alanine Aminotransferase, ALT) 수준을 통하여 확인한 그래프이다:
#: 대조군에 대하여, p<0.001; 및
**: CCl ₄ 처리군에 대하여, p<0.01.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

1) 블랙베리 식초 4 내지 10 중량부, 블랙베리 농축액 0.5 내지 3 중량부, 사과농축액 0.5 내지 3 중량부, 액상과당 6 내지 15 중량부, 플락토 올리고당 1 내지 5 중량부, 효소처리 스테비아 0.001 내지 0.020 중량부, 구연산 0.1 내지 0.5 중량부, 연잎추출물 0.01 내지 0.1 중량부, 라즈베리 향료 0.01 내지 0.1 중량부 및 정제수 70 내지 90 중량부를 혼합하여 교반하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 혼합하여 교반된 액을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과된 액을 살균한 후, 여과하는 단계를 포함하는 블랙베리 식초를 함유하는 간 기능 개선용 음료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 블랙베리는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 블랙베리 농축액 또는 사과 농축액은 1) 세척하는 단계, 2) 착즙하는 단계, 3) 여과하는 단계. 4) 농축하는 단계, 5) 살균하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조한 것, 시판되는 것 또는 당해 기술분야에서 통상적으로 행하는 방법에 의해 제조하여 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 연잎 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법 또는 시판되는 것 또는 당해 기술분야에서 통상적으로 행하는 방법에 의해 제조하여 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다:

1) 연잎에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축한 후 건조하는 단계.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 라즈베리 향료는 제조한 것 또는 당해 기술분야에서 통상적으로 행하는 방법에 의해 제조하여 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 정제수는 RO(reverse osmosis) 여과기를 통해 정제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 교반은 바람직하게는 45 내지 55℃, 보다 바람직하게는 50 내지 53℃에서 바람직하게는 20 내지 40 분간, 보다 바람직하게는 30 내지 35 분간 실시하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 여과는 바람직하게는 3 내지 7 μ, 보다 바람직하게는 5 내지 6 μ필터로 실시하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 살균은 63℃ 내지 65℃에서 약 30분간 살균하는 저온장시간 살균법(Low temperature long time, LTLT), 90℃ 내지 110℃에서 15 내지 30초간 살균하는 고온단시간살균법(High temperature short time, HTST) 및 120℃ 내지 150℃에서 1 내지 3초간 살균하는 초고온순간살균법(Ultra high temperature, UHT) 등으로 수행할 수 있으며, 원료의 갈변현상을 최소화하면서 오염세균을 최대한 살균시키기 위하여, 98℃에서 30 초간 살균하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)이후에 80 내지 95℃가 유지되도록 용기에 충진하고 냉각기에서 35 내지 50℃ 까지 냉각시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 용기의 재질은 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지 등 음료 용기의 재질로 사용될 수 있는 것이면 어떠한 것이든 무방하고, 용기의 형태는 파우치백이나 캔, 병등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 블랙베리 식초는 하기의 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

a) 블랙베리 파쇄액 25 내지 35 중량부 바람직하게는 30 중량부, 사과농축액 10 내지 20 중량부 바람직하게는 16.6 중량부 및 정제수 50 내지 60 중량부 바람직하게는 53.4 중량부를 혼합하여 초기 당도를 10 내지 20°brix으로 조정하고 효모를 접종하여 알코올 발효시키는 단계; 및

b) 상기 단계 1)의 알코올 발효물은 여과한 후, 알코올 농도 5 내지 9%로 조정하고 초산균을 접종하여 초산 발효시키는 단계.

상기 초기당도는 너무 낮으면 최종 알코올 농도가 감소하고, 너무 높으면 알코올 발효가 지연되거나 진행되지 않으므로 13 내지 18°brix인 것이 바람직하고, 15 내지 16°brix인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 a)의 알코올 발효는 효모를 접종하여 일정시간 발효시키는데, 이러한 효모는 피처리물 전체 중량을 100으로 하여 건조 중량으로 바람직하게 1 내지 10 중량부, 보다 바람직하게는 5 중량부를 접종하여 효모의 생육온도 범위, 바람직하게는 20 내지 30℃, 보다 바람직하게는 25℃에서, 바람직하게는 2일 내지 6일, 보다 바람직하게는 4일 동안 발효하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 효모는 식용가능한 다양한 효모를 사용할 수 있으며, 사카로미세스 세레비시아( Saccharomyces cerevisiae ; KCTC 7904) 또는 사카로미세스 보야뉴스( Saccharomyces boyanus )인 것이 바람직하고, 사카로미세스 세레비시아( Saccharomyces cerevisiae ; KCTC 7904)인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 b)의 알코올 농도는 바람직하게는 5 내지 9%로, 보다 바람직하게는 7 내지 8%, 가장 바람직하게는 7.4%로 조정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 b)의 초산 발효는 아세토박터 종. PA 97( Acetobacter sp . PA 97)을 바람직하게는 5 내지 20 중량부, 보다 바람직하게는 10 중량부를 접종하고 바람직하게는 25 내지 35℃, 보다 바람직하게는 35℃에서 바람직하게는 10일 내지 25일, 보다 바람직하게는 20일 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 b)의 있어서 초산 발효는 초기 산도를 바람직하게는 0.5 내지 2% 범위, 보다 바람직하게는 1 내지 1.5%로 조정하여 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 블랙베리 식초를 포함하는 음료 조성물을 제조하기 위하여, 1)의 블랙베리 식초 4 내지 10 중량부, 블랙베리 농축액 0.5 내지 3 중량부, 사과농축액 0.5 내지 3 중량부, 액상과당 7 내지 12 중량부, 플락토 올리고당 1 내지 5 중량부, 효소처리 스테비아 0.005 내지 0.015 중량부, 구연산 0.1 내지 0.5 중량부, 연잎추출물 0.01 내지 0.1 중량부, 라즈베리 향료 0.01 내지 0.1 중량부 및 정제수 70 내지 90 중량부를 혼합하여 교반하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 혼합하여 교반된 액을 여과하는 단계; 3) 단계 2)의 여과된 액을 살균한 후, 여과하는 단계를 포함하는 블랙베리 식초를 포함하는 간 기능 개선용 음료 조성물을 제조하였다(도 1 및 표 1 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서, CCl ₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에서 산화스트레스에 대한 보호효과를 확인한 결과, 본 발명의 음료 조성물을 미리 투여한 후, CCl ₄ 를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 GPx의 활성이 대조군에 비하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 2).

본 발명의 구체적인 실시예에서, CCl ₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델 간 보호효과를 확인한 결과, 본 발명에 따른 음료 조성물(3 또는 6 ㎖/㎏)을 미리 투여한 후, CCl ₄ 를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 AST와 ALT의 수준이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 3).

따라서, 본 발명의 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물은 간 독성을 유발한다고 알려진 CCl ₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에서 산화 스트레스에 대한 보호효과 및 간 손상을 회복시키는 효과를 보이므로, 간 기능 개선용 건강기능식품 또는 건강보조식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 원료들을 지시된 비율로 함유하는 외에, 액체성분에는 특별한 제한 점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 추가성분으로는 베타시클로덱스트린 0.05~0.2 중량부, 및 L-아스파라긴, 비타민 B1, 비타민 B2, 글리신, 카라멜색소, 수크랄로스, 안식향산나트륨 및 드링크향으로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가물 0.002~0.1 중량부을 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

즉, 상기 추가성분 외에 천연 탄수화물로서 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 사용할 수 있고, 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 추가성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 블랙베리 식초를 함유하는 간 기능 개선용 음료 조성물을 제공한다.

본 발명의 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물은 간 독성을 유발한다고 알려진 CCl ₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에서 산화 스트레스에 대한 보호효과 및 간 손상을 회복시키는 효과를 보이므로, 간 기능 개선용 건강기능식품 또는 건강보조식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 블랙베리 ( Rubus fruticosus L. ) 식초의 제조

<1-1> 블랙베리 식초 재료의 준비

블랙베리(blackberry mayple)는 2008 ~ 2009년 7월 전남 장흥군에서 수확한 것을 구입하여 -20℃ 냉동고에 저장하면서 실온에서 해동시킨 후 일정량을 취해 블랙베리 발효제조용으로 사용하였으며 믹서기로 파쇄한 것을 원료로 사용하였다.

<1-2> 사용 균주의 제조

알코올발효 균주는 한국생명자원센터에서 분양받은 사카로미세스 세레비시아( Saccharomyces cerevisiae ; KCTC 7904)을 YPD 평판배지에 계대 배양한 후, YM 액체배지에서 24℃에서 24시간 정치 배양하여 사용하였다. 또한, 초산균은 경북과학대학 전통식품연구소에서 보관중인 아세토박터 종. PA 97( Acetobacter sp . PA 97)을 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 0.5% 글루코스(glucose), 1.0% 글리세린(glycerin), 0.02% MgSO _{4 ·} 7H ₂ O, 5.0% 에탄올(ethanol), 1.0% 아세트산(acetic acid)의 배지 조성으로 30℃에서 72시간 배양하여 사용하였다.

<1-3> 주모 및 종초배양

주모는 블랙베리를 파쇄하여 가수한 후 100% 과당(fructose)(73°brix)으로 당도를 15°brix로 조절한 사카로미세스 세레비시아를 접종하여 25℃에서 48시간 정치배양하여 사용하였으며, 종초는 주모 제조시와 동일한 방법으로 제조된 블랙베리 알코올 발효액을 여과한 후, 그 여액을 초산균주 아세토박터 종. PA 97( Acetobacter sp. PA97)를 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 72시간 진탕 배양하여 사용하였다.

<1-4> 블랙베리 식초의 제조

블랙베리 식초를 제조하기 위하여, 2단계 발효를 진행하였다. 알코올발효는 믹서기로 파쇄한 블랙베리 파쇄액과 보당액인 사과 농축액(경북능금협동조합, 한국)을 이용하여 초기 당도를 15°brix이 되도록 농도를 맞춰 초산발효를 위한 알코올 발효에 가장 적합한 기질을 만들었다. 블랙베리 파쇄액 30%(V/V), 사과 농축액 16.6%(V/V) 및 정제수 53.4%(V/V)가 혼합된 원액에 접종하는 주모의 양은 5%(V/V)를 접종하였고, 알코올 발효가 가장 잘 일어나는 25℃의 배양온도에서 4일간 정치 배양하였다. 배양시 초산발효에 적절한 알코올 함량인 7.4%대에 도달할 때까지 일정하게 상기 상태를 유지하였다. 알코올 발효가 끝난 블랙베리주를 5,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 0.45 ㎛ 필터(filter)에 통과시켜 찌꺼기를 제거하여 초산발효 기질로 사용하였다. 상기와 같이 처리된 블랙베리주를 공기와의 접촉이 용이한 500 mL 삼각 플라스크(flask)에 100 mL을 넣고 상기 실시예 <1-3>에서 제조한 종초를 블랙베리주 부피 대비 10%를 접종하여, 초산 발효시 필요한 초기 알코올 농도 7.4%와 초기산도 1%로 맞춘 후, 30℃에서 200 rpm으로 72시간 진탕 배양하면서 산도 및 알코올 함량의 측정한 결과, 20일째 최종산도 6.6%, 잔류 알코올 함량은 0%로 우리 나라의 산업자원부 기술표준원에서 정한 과실 식초의 조건을 만족하는 블랙베리 식초 6 g을 제조하였다(도 1).

< 실시예 2> 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물의 제조

블랙베리 식초를 함유하는 음료를 제조하기 위하여, 하기 [표 1]에 기재된 배합비로 혼합한 후, 50℃에서 30분간 교반한 후, 상기 배압된 액을 5μ필터로 1차 여과한 다음, 98℃ 고온단시간살균법(High temperature short time, HTST)을 수행하여 살균한 후, 5μ필터를 이용하여 2차 여과를 수행하였다. 그런 다음, 상기 살균 및 여과된 액을 자동 충진기에서 75 ml 병에 90℃가 유지되도록 하여 충진한 후, 냉각기에서 40 ~ 45℃까지 냉각시켜 최종적으로 20℃에서 12°brix, 25℃에서 pH 3.1 및 산도(Acidity) 0.29인 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물을 제조하였다.

이때, 상기 사용한 모든 재료는 식품첨가물 공전 규격에 적합한 원료만을 검수하여 사용하였으며, 정제수는 물을 RO 여과기를 통과시켜 정수한 정제수를 사용하였다.

< 실험예 1> CCl ₄ 유도된 간 손상 동물 모델의 제조

<1-1> 실험동물의 사육

6 주령의 수컷 Sprague-Dawley 랫트(150 ± 10 g)(오리엔트바이오, 한국)은 표준 환경 조건에서 1주일간 순응시키며, 표준식이와 물을 자유식이로 섭취하게 하였다. 상기 랫트는 12/12시간의 명-암 주기로 에어컨디션 방에서 유지하였다. 또한, 본 발명에서 사용한 모든 실험 프로토콜은 한국 원자력 연구원의 동물 실험윤리위원회(KAERI-IACUC)에서 인증된 실험 동물 관리 및 이용 가이드라인에 따라 수행하였다.

<1-2> CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트의 제조

6주령 랫트를 임의로 한 그룹당 7마리로, 4그룹으로 나누었다:

그룹 1) 올리브 오일(olive oil) 및 식염수 공급;

그룹 2) CCl ₄ 1 g/kg 및 식염수 공급;

그룹 3) CCl ₄ 1 g/kg 및 본 발명의 음료 조성물 3 ㎖/㎏ 공급; 및

그룹 4) CCl ₄ 1 g/kg 및 본 발명의 음료 조성물 6 ㎖/㎏ 공급.

상기 <실시예 2>에서 제조한 본 발명의 음료 조성물을 직접 랫트에 투여하였으며, 50% CCl ₄ 는 올리브 오일에서 제조하었다. 본 발명의 음료 조성물은 15일 동안, 600(3 ㎖/㎏) 및 1200 ㎕(6 ㎖/㎏) 씩 하루에 한번 구강으로 투여하였다. 그룹1) 및 2)는 본 발명의 음료 조성물 투여군과 동일하게 식염수를 15일 동안 하루에 한번 구강으로 투여하였다. 마지막 경구투여 3시간 후, 랫트에 올리브 오일을 이용하여 제조한 CCl ₄ 300 ㎕를 복강으로 투여하였다. 그룹1)은 올리브 오일만 300 ㎕를 복강으로 투여하였다. 그 후, 18시간 동안 절식하였으며, 이의 산화스트레스 및 간 보호효과를 확인하는 실험을 수행한 후, 모든 랫트를 안락사시켰다. 혈액은 혈청의 아스파라진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST) 및 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT) 활성을 측정하기 위하여, 에테르(ether)를 이용하여 상기 랫트를 마취시킨 후, 후대 정맥(postcaval vein)으로부터 채취하였다. 또한, 상기 랫트의 간을 신속하게 채취하여, 항산화 효소 분석에 사용하였다.

< 실험예 2> CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물의 산화 스트레스에 대한 보호효과 확인

본 발명의 음료 조성물의 상기 <실험예 1>에서 제조한 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 산화 스트레스에 대한 보호효과를 측정하기 위하여 Cayman Chemical에서 구입한 키트를 이용하여 황산화 효소인 GPx의 활성을 측정하였다.

구체적으로 상기 실험예 <1-2>의 4개 군의 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트로부터 채취한 간 조직 100 ㎎에 1 ㎖의 라이시스(lysis) 버퍼를 첨가하고 호모지나이저(homogenizer)로 분쇄한 후 10000 g , 4℃에서 원심분리하여 조직 현탁액을 준비하였다. GPx 분석 키트에 포함된 100 ㎕의 에세이(Assay) 버퍼에 50 ㎕의 공통 기질 혼합물(co-substrate mixture)과 20 ㎕의 조직 현탁액을 혼합하고 20 ㎕의 큐멘 하이드로퍼옥사이드(cumene hydroperoxide)를 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 340 ㎚에서 흡광도를 측정하여 GPx 농도를 계산하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 항산화 효소인 GPx의 활성이 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트의 간에서 CCl ₄ 를 투여하지 않은 대조군 랫트에 비하여 감소하는 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 음료 조성물을 미리 투여한 후, CCl ₄ 를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 GPx의 활성이 대조군에 비하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 2).

< 실험예 3> CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 블랙베리 식초를 함유하는 음료 조성물의 간 보호효과 확인

CCl ₄ 에 의한 간 손상은 세포막의 투과성(permeability)을 증가시키고, 간에서 혈액으로 급성 간 손상의 표지로 알려진 아스파진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST)와 아미노전이효소(Alanine Aminotransferase, ALT)를 분비시킨다(Adesanoye, OA, et al., Experimental and Toxicologic Pathology , 2010; Ranawat, L., et al., Journal of Ethnopharmacology , 2010). 이에, 본 발명자들은 혈청 AST와 ALT의 수준을 간 손상의 지표로서 측정하였다. 구체적으로, AST와 ALT의 수준은 임상 생화학 자동 분석기(biochemistry automatic analyzer)(Hitachi Model 7180, 일본)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서는 독성을 유발하지 않은 대조군 랫트에 비하여 AST와 ALT의 수준이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 그런, 본 발명에 따른 음료 조성물(3 또는 6 ㎖/㎏)을 미리 투여한 후, CCl ₄ 를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 AST와 ALT의 수준이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 3).