[0001] 相关申请

[0002] 本申请相关于下列专利申请，但是并不要求它们的优先权：美国专利申请系列号[律师文档号81289-284779]，2003年9月10日提交，美国专利申请系列号[律师文档号81289-284781]，2003年9月10日提交，美国专利申请系列号[律师文档号81289-294309]，
2003年9月10日提交，以及美国专利申请系列号[律师文档号81289-305694]，2003年9月10日提交，上述申请的内容以其全文并入本文作参考。
发明领域

[0003] 本发明一般性涉及亚硝酸盐氧化剂，特别涉及能将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的细菌。

[0004] 发明背景

[0005] 氨是硬骨鱼和淡水及海水中许多无脊椎动物的主要含氮废产物。所述氨来自生物体通过饮食接受的蛋白质的脱氨和转氨作用。然而，高氨浓度对许多上述这些水生生物可以是有毒的。在自然系统中，如在湖泊、江河和海洋中，氨的浓度很少达到有毒水平，因为每体积水中鱼类(及其它生物体)的密度较低。

[0006] 然而，在公众和私人的人工水生系统如水产养殖场、养殖箱、水槽和水塘及水族箱(aquarium)中，氨可以达到有毒浓度，有时甚至非常迅速即可达到毒性水平。一个原因是在上述系统中鱼类密度相对于少量的水而非常大。另一个原因是在许多这些系统中水未持续更换；甚至水只是周期性部分更换而在系统中再循环。

[0007] 因此，大多数水产养殖系统和水族箱利用某种形式的过滤以保持适于水生生物维持和生长的水质程度。任何这种过滤设备的一个主要成分是生物过滤器。所述生物过滤器的名称是由于其作为能够通过氧化作用将氨转变为另一种化合物亚硝酸盐的细菌生长的基质或部位而获得的。高浓度的亚硝酸盐也可以是有毒的，但是有生长在生物过滤器上并将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的其它物种的细菌，如美国专利No.6,268,154，6,265,206和6,207,440所描述，所述专利以其全文并入本文作参考。硝酸盐被认为对水生生物无毒性，除了在极高浓度的极端情况中。

[0008] 有使用生物过滤器的一些其它的情况或应用。这些包括污水处理设备、废水处理设备和饮用水过滤设备。尽管这些情况均具有其自身特殊的原因而使用生物过滤器，但是目的是相同的：将毒性无机氮化合物转变为有害程度较低的无机氮物质。生物过滤器对于许多设备是必需的，以符合美国环境保护署(EPA)规定的国家推荐的水质标准。

[0009] 氨氧化成亚硝酸盐是由氨氧化细菌(AOB)介导的过程。特别地，这是一个两步氧化过程，包括氨根据如下反应式氧化为亚硝酸盐：

[0010] NH3+O2+H2O+2e-→NH2OH+H2O (1)

[0011] NH2OH+H2O→NO2-+5H++4e- (2)

[0012] 亚硝酸盐氧化成硝酸盐也是细菌介导的过程。特别地，这是一个一步氧化过程，包括亚硝酸盐根据如下反应式而被氧化为硝酸盐：

[0013] NO2-+H2O→NO3-+2H++4e- (1)

[0014] 研究最多的亚硝酸盐氧化细菌(NOB)是维氏硝化杆菌(Nitrobacterwinogradskyi)。其最初分离自土壤并据称在水产养殖设备(Wheaton，F.W.1977.
Aquacultural Engineering.John Wiley & Sons，Inc.New York.)、废 水 处 理 设 备(Painter，H.A.1986.Nitrification in thetreatment of sewage and waste-waters.In Nitrification J.I.Prosser ed.IRL Press.Oxford.)和水族箱(Spotte，S.1979.Seawater Aquariums-TheCaptive Environment.Wiley-Interscience.New York)中是活性的NOB。这些参考文献及本文引用的所有其它参考文献均以其全文并入本文作参考。

[0015] 然而，最近通过利用生物体(或生物体类群)的DNA序列的独特性的现代分子学方法进行的研究示出维氏硝化杆菌及其密切相关生物在淡水水族箱环境中低于检测 极 限 (Hovanec，T.A.and E.F.DeLong.1996.Comparative analysis of nitrifying bacteria associated withfreshwater and marine aquaria.Appl.Environ.Microbiol.62：2888-2896.)。另外，研究显示来自硝化螺菌门(Nitrospira)的细菌在水族箱中(Hovanec，T.A.，L.T.Taylor，A.Blakis and E.F.DeLong.1998.Nitrospira-like bacteria associated with nitrite oxidation in freshwaeraquaria.Appl.
Environ.Microbiol.64：258-264.)及在废水处理设备中(Burrell，P.C.，J.Keller and L.L.Blackall.1998.Microbiology of anitrite-oxidizing bioreactor.Appl.Environ.Microbiol.64：1878-1883.)将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。然而，在海水水族箱中未发现已确定在淡水水族箱中将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的硝化螺菌分离株(Hovanec et.al.1998)。

[0016] 海洋硝化螺菌(Nitrospira marina)最初是由Watson在1986年发现的(Watson，S.W.，E.Bock，F.W.Valois，J.B.Waterbury，and U.Schlosser；1986.Nitrospira marina gen.nov.，sp.nov.：Achemolithotrophic nitrite oxidizing bacterium.Archives Microbiology，144：1-7)。然而，它不被认为是自然环境(土壤、海水或淡水或蓄水池)或人工环境(废水处理设备)中重要或主要的氧化亚硝酸盐的生物(Abeliovich，A.2003.The Nitrite Oxidizing Bacteria.In M.Dworkin etal.Eds.The Prokaryotes：An Evolving Electronic Resource for theMicrobiological Community，third edition，release 3.13，March 2003.Springer-Verlag，New York)。另一硝化螺菌菌种Nitrospira moscoviensis分离自位于俄罗斯莫斯科的一幢建筑物的加热系统中部分腐蚀的铁管。这种细菌在非海水介质中在39℃最适生长(Abeliovich，A.2003)。也已经报道了海生移动床反应器(marine moving bed reactor，MBB)的微生物聚生体既包括AOB(耐冷亚硝化单胞菌(Nitrosomonascryotolerans))也包括NOB(海洋硝化螺菌)，以及许多异养细菌(Y.Tal，J.E.M.Watts，S.Schreier，K.R.Sowers and H.J.Schreier，2003.Characterization of the microbial community and nitrogen transformationprocess associated with moving bed bioreactors in a closed recirculatedmariculture system.Aquiculture215(2003)187-202)。

[0017] 对于水族箱环境和废水处理一个特别重要的环境因素是盐度，更特别的是淡水和盐水(saltwater)环境之间的许多物理化学差异。各种NOB在局部环境中耐受这些巨大改变的能力之间的差别对于设计这些系统和在其中应用NOB是关键的。如此，一种特定的NOB对一种盐水环境的经证实的耐受性可以使该NOB适用于特定的水族箱和盐水环境。另外，耐受淡水和盐水环境之间的变化的能力可具有更广泛的意义，如一种特殊的NOB可适用于广泛的环境，适合淡水和盐水这两种环境。

[0018] 另外，NOB的贮存和运输通常限于液体及类似的可能不方便的介质中，这至少部分是由于各种NOB菌株不能耐受冻干处理所致。冻干使得可以将一定体积的NOB制成固体的冻干的粉末或者类似的组合物，这样可耐受更大的例如温度的起伏并且因此可以使得在商业产品中相应地更便于运输和处理及具有更长的保存期。

[0019] 因此，本领域需要鉴别能耐受盐水环境和/或盐水和淡水两种环境的NOB。本领域还需要在进行冻干处理后保持存活的NOB。

[0020] 发明概述

[0021] 在本发明的一个实施方案中，提供了能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的分离的细菌或细菌菌株。在一个实施方案中，所述细菌或细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。

[0022] SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列是硝化球菌(Nitrococcus)-样NOB的实例，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列是硝化螺菌样NOB的实例。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所表示的硝化球菌样NOB保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，指定登记号为PTA-5424。SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的硝化螺菌样NOB保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，指定登记号为PTA-5422。

[0023] 在各种实施方案中，所述细菌或细菌菌株的16S rDNA具有SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有至少96％、97％、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。

[0024] 本发明还包括核酸序列和细菌，其具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有至少96％、97％、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。

[0025] 对于本申请而言，“96％相似性”是指碱基中可以存在最多4％的单一碱基取代，“97％相似性”是指碱基中可以存在最多3％的单一碱基取代，“98％相似性”是指碱基中可以存在最多2％的单一碱基取代，“99％相似性”是指碱基中可以存在最多1％的单一碱基取代。

[0026] 本发明还另外包括能减轻介质中亚硝酸盐积聚的组合物，其中所述组合物包含一或多种本发明的细菌菌株，其中所述细菌菌株的16SrDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的核苷酸序列，或者具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8具有至少96％、97％、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。

[0027] 本发明还包括冻干本发明所公开的细菌或细菌菌株的方法。所述方法包括用冷冻保护剂处理所述细菌或细菌菌株，将它们置于制冷器中并在真空压力下干燥所述细菌或细菌菌株。本发明的冻干方法产生了可以冻干形式贮存而同时保持其存活力和将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力的冻干的NOB。

[0028] 本发明还包括减轻介质中亚硝酸盐积聚的方法。所述方法包括在所述介质中放置足够量的细菌菌株或者包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，或者具有与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ NID NO：8具有至少96％、
97％、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。

[0029] 本发明还包括检测并确定介质中能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的细菌数量的方法。所述方法包括提供一种本发明的被可检测地标记的探针；从所述介质中分离总DNA；将分离的DNA在一定条件下暴露于所述探针，所述条件是当所述细菌的16rDNA具有SEQ ID NO：
1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列时所述探针只与所述细菌的核酸杂交；检测并测定所述探针以检测和测定细菌的量。

[0030] 本发明还包括可用于检测本发明的细菌及核酸序列的聚合酶链反应(PCR)引物。

[0031] 附图简述

[0032] 图1示出了根据本发明的一个实施方案，从16S rDNA序列的对比分析中推断的8种细菌菌株(即以SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，和SEQ ID NO：8所表示的细菌菌株)的系统发生关系。这个系统发生树基于含有最少1445个核苷酸的序列的邻位相连距离(neighbor-joining distance)分析。

[0033] 图2示出了根据本发明的一个实施方案，来自选择的富集物和以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的亚硝酸盐氧化细菌的生物量的变性梯度凝胶电泳(DGGE)。

[0034] 图3示出了根据本发明的一个实施方案，来自选择的富集物和以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7所表示的亚硝酸盐氧化细菌的生物量的变性梯度凝胶电泳(DGGE)。

[0035] 图4示出了根据本发明的一个实施方案，来自选择的富集物和以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的亚硝酸盐氧化细菌的生物量的变性梯度凝胶电泳(DGGE)。

[0036] 图5示出了对于盐水细菌菌株与两种商购添加物的细菌添加物测试(Bacterial Additives Test)添加物的平均亚硝酸盐浓度趋势。

[0037] 图6示出了对于盐水细菌菌株相对于未接种的对照组的细菌添加物测试的的平均亚硝酸盐浓度趋势。

[0038] 图7示出了用于评价已经贮存5.5个月的冻干的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均氨浓度趋势。

[0039] 图8示出了用于评价已经贮存5.5个月的冻干的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均亚硝酸盐浓度趋势。

[0040] 图9示出了用于评价已经贮存5.5个月的冻干的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均硝酸盐浓度趋势。

[0041] 图10示出了用于评价已经贮存11个月的冻干的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均氨浓度趋势。

[0042] 图11示出了用于评价已经贮存11个月的冻干的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均亚硝酸盐浓度趋势。

[0043] 图12示出了用于评价已经贮存11个月的冻干的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均硝酸盐浓度趋势。

[0044] 图13示出了用于评价已经贮存5个月的冷冻的盐水细菌菌株的存活力，及用于评价已经以液体形式贮存14个月的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均氨浓度趋势。

[0045] 图14示出了用于评价已经贮存5个月的冷冻的盐水细菌菌株的存活力，及用于评价已经以液体形式贮存14个月的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均亚硝酸盐浓度趋势。

[0046] 图15示出了用于评价已经贮存5个月的冷冻的盐水细菌菌株的存活力，及用于评价已经以液体形式贮存14个月的盐水细菌菌株的存活力的细菌添加物测试的平均硝酸盐浓度趋势。

[0047] 发明详述

[0048] 本发明基于对新的细菌菌株的发现，所述细菌菌株在盐水和/或淡水环境中能氧化亚硝酸盐并且在冷冻或冻干处理后可保持存活。本发明的实施方案描述了使用和检测所述细菌菌株的方法。

[0049] 本发明提供了一种能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的分离的细菌菌株或者细菌菌株的生物学纯培养物，其中所述细菌菌株的16S rDNA包括表1-表8中示出的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8所示核苷酸序列。

[0050] 表1：SB7c32所示硝化球菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ IDNO：1

[0051]

[0052] 表2：SB7c11所示硝化球菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ IDNO：2

[0053]

[0054] 表3：SB7c136所示硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ IDNO：3

[0055]

[0056] 表4：SB7c47所示硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ IDNO：4

[0057]

[0058] 表5：R21c76所示硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ IDNO：5

[0059]

[0060] 表6：R21c28所示硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ IDNO：6

[0061]

[0062] 表7：B7c10所示硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ ID NO：7

[0063]

[0064] 表8：B7c7所示硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌的序列：SEQ ID NO：8

[0065]

[0066] 对于本发明而言，分离的细菌菌株是指从其天然环境中经过一定程度纯化的细菌菌株。细菌的培养物是指如果所述细菌的至少20％来自一个细菌菌株则认为其是生物学纯的。然而，优选所述培养物是至少33％纯的，更优选是至少45％纯的，最优选所述培养物是至少90％纯的。

[0067] 本发明的细菌菌株也可以彼此组合，与其它菌种、营养素和/或其它成分组合以提供保持或纯化水性介质的组合物。例如可以将本发明的细菌与能除去水性介质中其它污染物或不希望的化合物的细菌组合。这些细菌例如包括氨氧化细菌(将氨氧化为亚硝酸盐的化能自养细菌)、异养细菌(将有机物矿物质化为氨及其它物质)及本领域技术人员已知的其它细菌。已知氨氧化细菌来自变形菌门(Proteobacteria)的β和γ亚门。例如包括亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)和亚硝化球菌属(Nitrosococcus)的菌种。已知硝酸盐还原细菌来自固氮弧菌属(Azoarcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和产碱菌属(Alcaligenes)。已知异养细菌来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和产碱菌属(Alcaligenes)。
可以与本发明的细菌组合的其它类群的细菌包括浮霉状菌属(Planctomyces)的成员。这些细菌可得自已知来源(例如美国典型培养物保藏中心ATCC，10801 University Blvd.，Manassas VA20100，USA)或者可以直接分离自水族箱生物过滤器。

[0068] 例如，本发明的细菌菌株可以与氨氧化细菌组合，由此水系中存在的氨被氧化为亚硝酸盐并且亚硝酸盐被氧化为硝酸盐。加入的氨氧化细菌可以是本领域已知的任何氨氧化细菌，例如但非限于是如下共同转让的专利申请中公开的那些氨氧化细菌：2003年9月10日提交的美国专利申请系列号[律师文档号81289-284779]，2003年9月10日提交的美国专利申请系列号[律师文档号81289-284781]，2003年9月10日提交的美国专利申请系列号[律师文档号81289-294309]，及2003年9月10日提交的美国专利申请系列号[律师文档号81289-305694]。

[0069] 另一个实例是将本发明的细菌菌株与需氧或厌氧脱氮细菌组合。在这种情况中，由本发明的细菌菌株与脱氮细菌的相互作用产生的硝酸盐被还原为四氧化二氮或其它氮产物。第三个实例是将本发明的细菌菌株与异养细菌组合，所述异养细菌将有机物矿物质化为较简单的无机物，该无机物随后可以被本发明的细菌菌株用作底物。

[0070] 在一些实施方案中，本发明提供了包含亚硝酸盐氧化细菌和氨氧化细菌的维持或纯化水性介质的组合物。在一个实施方案中，提供了维护家庭水族箱的组合物，所述组合物包括本发明的盐水NOB以及盐水AOB。在一个实施方案中，将0.5-1.5mL，优选1mL的本发明的浓缩的盐水NOB与2.25-3.25mL，优选2.75mL浓缩的盐水AOB混合。然后将浓缩的混合物用人工海水稀释为2.5-3.5液体盎司，优选大约3液体盎司(88.7mL)，用于处理50-60加仑，优选大约55加仑的水族箱的水。所述组合物可包括本发明的盐水NOB的一些菌株，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包括本发明的所有盐水NOB菌株，所述组合物的大部分包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的细菌菌株(如本文所用，术语“大部分”是指至少50％)。

[0071] 在另一个实施方案中，本发明提供了维护公共水族箱和水产养殖设备的组合物，所述组合物包括本发明的盐水NOB以及盐水AOB。在一个实施方案中，将40-50mL，优选大约45mL浓缩的本发明的盐水NOB与118-128mL，优选123mL浓缩的盐水AOB混合。然后将此浓缩的混合物用脱氯的经过滤的水稀释为0.9-1.1加仑，优选大约1加仑(3.79L)，用于处理2410-2510加仑，优选大约2460加仑水族箱或水产养殖设备的水。所述组合物可包括本发明的盐水NOB的一些菌株，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的所有盐水NOB菌株，所述组合物的大部分包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的细菌菌株(如本文所用，术语“大部分”是指至少50％)。

[0072] 本发明还提供了包括浓缩的能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的细菌菌株的混合物，其中所述细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列或者具有与SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8有至少96％、97％、98％或至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。根据本发明的这个实施方案，如果所述细菌菌株的浓度高于其在自然界的浓度，则认为该细菌菌株是浓缩的。一般地，细菌菌株的浓度是样品中总细胞的至少20％，这是通过本领域技术人员已知的标准技术如在原位杂交(FISH)技术中使用荧光的分子探查方法确定的，同时使用合适的对照物和计数方法进行。更优选地，所述细菌菌株的浓度是总细胞的33％或更高，更优选45％，最优选为总细胞的90％或更高。然而，优选混合物中具有一种以上的具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8所示核苷酸序列的细菌。在这种情况中，上述百分比相关于混合物中总NOB的百分比，同时应理解细胞群的平衡可能包含氨氧化细菌或其它类型的细菌。

[0073] 特别地，非限于任何理论，确信本发明讨论的SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8所表示的那些菌株特别耐受盐水环境；但这些菌株也可用于淡水环境中，并确信在此也可有效发挥功能。除了SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8所表示的那些菌株之外的细菌菌株及包含这些菌株的混合物也可以适当程度地耐受盐水环境，在本发明的一个优选实施方案中，盐水环境中包括的将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所表示的那些菌株。

[0074] 另外，本发明讨论的任何细菌菌株均可以是冻干的，确信SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所表示的那些菌株特别耐受冻干处理，这是通过其在这种处理后保持存活并且在这种处理后保持将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力表明的。因此，在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所表示的那些细菌菌株可以是冻干的，并随后在盐水环境中用于将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。

[0075] 在另一个实施方案中，本发明提供了冻干本发明公开的细菌或细菌菌株的方法。所述方法包括用冷冻保护剂处理所述细菌或细菌菌株，将其置于制冷器中并在真空压力下干燥所述细菌或细菌菌株。本发明的冻干方法生产了可以以冻干形式贮存并且在解冻后保持其存活力及将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力的冻干的NOB。

[0076] 在一些实施方案中，本发明的冻干细菌或细菌菌株的方法包括特定的冻干条件。在一个实施方案中，本发明的NOB菌株在盐度为30ppt的培养基中生长。然后将NOB用作为冷冻保护剂的海藻糖处理，将40-60g，优选大约50g海藻糖与900-1100mL，优选大约1000mL的NOB混合形成大约5％的溶液。将所述NOB溶液在4℃贮存直至进行处理，随后将其倒在预先冷却的托盘(tray)上，在大约-40℃冷冻大约3小时。然后将冷冻的溶液置于干燥器中，以温和的基础升华速度(primary sublimination rate)升华大约12小时，结束温度为大约27℃，总干燥时间为大约35小时。在另一个实施方案中，冻干条件是相同的，不同之处是将冷冻的溶液置于干燥器中以快速的基础升华速度升华大约2小时，总干燥时间为大约
28小时。

[0077] 在另一个实施方案中，本发明的NOB菌株在盐度为30ppt的培养基中生长。然后将所述NOB用作为冷冻保护剂的海藻糖处理，将90-110g，优选大约100g海藻糖与900-1100mL，优选大约1000mL的NOB混合形成大约10％的溶液。所述NOB溶液在大约4℃贮存直至进行处理，随后将其倒在预先冷却的托盘上并在大约-40℃冷冻大约3小时。然后将冷冻的溶液置于干燥器中，以温和的基础升华速度升华大约12小时，结束温度为大约
27℃。在另一个实施方案中，冻干条件是相同的，不同之处在于将冷冻的溶液置于干燥器中，以快速的基础升华速度升华大约2小时，结束温度为大约27℃。

[0078] 应理解本发明的细菌菌株、混合物和组合物可以是本领域技术人员易于了解的粉末、液体、冷冻形式、冻干形式或者任何其它合适的形式。这些通常被称作“商业添加物”，并且可以包括但非限于：

[0079] (1)液体形式，其中一或多种所述菌株、混合物或组合物处于含有无机盐或有机化合物的液体溶液，由此细胞的存活力在贮存期间不被破坏；

[0080] (2)冷冻形式，其中一或多种所述菌株、混合物或组合物处于如上述液体混合物中，任选包括冷冻保护剂化合物以防止细胞裂解，将其在32 或更低温度冷冻和贮存；

[0081] (3)粉末形式，其通过冻干或其它方式产生，其中脱水形式的一或多种所述菌株、混合物或组合物可以在正常室温贮存而不丧失存活力。

[0082] 根据本发明公开的内容，本领域技术人员可以获得适当形式的本发明的细菌菌株及混合物。本领域技术人员也理解本发明的细菌菌株及混合物可以单独使用，或者与其它成分组合使用。这些成分例如包括但非限于氨氧化细菌、异养亚硝酸盐氧化细菌、异养氨氧化细菌，等等。所有形式的生物学纯细菌菌株也均可以含有营养素、氨基酸、维生素及保持和促进所述细菌菌株生长的其它化合物。本发明的细菌菌株和混合物及组合物可以用于淡水水族箱、海水水族箱及废水中，以减轻亚硝酸盐的积聚。它们也可以用于生物补救处理中以降低亚硝酸盐所致污染水平。生物补救处理(bioremediation process)，也称作生物增加(bioaugmentation)，包括但非限于向系统(例如发生生物学或化学污染的部位)中补充性加入微生物以促进或建立导致原始系统中存在的一或多种形式的化合物发生变化的生物学和/或化学过程。

[0083] 因此，本发明的一方面提供了一种减轻介质中亚硝酸盐积聚的方法。所述方法包括如下步骤：向所述介质中加入足够量的能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的一或多种本发明的细菌菌株，以减轻所述介质中亚硝酸盐的积聚，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，或者具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：
3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有至少96％、
97％、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。如果加入的细菌可减轻或防止亚硝酸盐在所述介质中积聚，则所述细菌菌株的量是足够的。一般地，预期向淡水或盐水水族箱中加入一或多种本发明的细菌菌株可以将最大亚硝酸盐浓度与没有所述细菌菌株时相比降低至少50％。

[0084] 在本发明的另一个实施方案中，提供了一种减轻亚硝酸盐在介质中积聚的方法，所述方法包括向所述介质中加入足够量的本发明公开的组合物以减轻亚硝酸盐在介质中的积聚。所述组合物可包括能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的本发明的一或多种细菌菌株，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，或者具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有至少96％、97、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列。

[0085] 在各种实施方案中，本发明提供了维护或纯化水性介质的方法，所述方法包括向所述介质中加入足够量的本发明揭示的组合物以维护或纯化水性介质。在所述组合物中，本发明的细菌菌株可以与氨氧化细菌组合，由此水系中存在的氨被氧化为亚硝酸盐，亚硝酸盐被氧化为硝酸盐。另一个实例是将本发明的细菌菌株与需氧或厌氧脱氮细菌组合。在这种情况中，由本发明的细菌菌株与脱氮细菌相互作用产生的亚硝酸盐被还原为四氧化二氮或其它含氮产物。第三个实例是将本发明的细菌菌株与异养细菌组合，所述异养细菌将有机物矿物质化为简单的无机物，该无机物随后可用作本发明的细菌菌株的底物。

[0086] 在一些实施方案中，本发明提供了维护或纯化水性介质的方法，所述方法包括向所述介质中加入足够量的包含亚硝酸盐氧化细菌和氨氧化细菌的组合物。在一个实施方案中，提供了维护家庭水族箱的方法，所述方法包括向所述水族箱中加入足够量的组合物，所述组合物包含本发明的盐水NOB以及盐水AOB。在一个实施方案中，所述组合物是通过将0.5-1.5mL，优选大约1mL的浓缩的本发明的盐水NOB与2.25-3.25mL，优选大约2.75mL的浓缩的盐水AOB混合形成的。然后将浓缩的混合物用人工海水稀释为2.5-3.5液体盎司，优选大约3液体盎司(88.7mL)，用于处理50-60加仑，优选大约55加仑的水族箱的水。所述组合物可包括本发明盐水NOB的一些菌株，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含所有本发明的盐水NOB菌株，所述组合物的大部分包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的细菌菌株如本文所用，术语“大部分”是指至少50％)。

[0087] 在另一个实施方案中，本发明提供了维护公众水族箱和水产养殖设备的方法，所述方法包括向所述水族箱或水产养殖设备中加入足够量的组合物，所述组合物包含本发明的盐水NOB以及盐水AOB。在一个实施方案中，所述组合物是通过将40-50mL，优选大约45mL本发明的浓缩的盐水NOB与118-128mL，优选大约123mL浓缩的盐水AOB混合而形成的。然后将浓缩的混合物用脱氯的经过滤的水稀释为0.9-1.1加仑，优选大约1加仑(3.79L)，用于处理2410-2510加仑，优选大约2460加仑水族箱或水产养殖设备的水。所述组合物可包括本发明盐水NOB的一些菌株，其中所述细菌菌株的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包括所有本发明的盐水NOB菌株，所述组合物的大部分包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所表示的细菌菌株如本文所用，术语“大部分”是指至少50％)。

[0088] 应意识到在特定环境中达到的实际水平是系统的大小和内容物(即鱼、植物等的数量)的函数。在新建立的37升水族箱10条鱼的情况中，亚硝酸盐的浓度在不加入所述细菌菌株的条件下可以达到14mg/L或者更高，而在加入一或多种所述细菌菌株的条件下最大水平可降低至大约5mg/L。一般地，如果向这种系统中加入一或多种本发明的细菌菌株，则最大亚硝酸盐浓度可期望不超过3mg/L。当所述系统达到稳定状态时，亚硝酸盐水平降低至0.5mg/L以下，这是当存在一或多种本发明的细菌菌株时更迅速发生的一个过程。

[0089] 在本发明的一个实施方案中，本发明的细菌菌株和组合物被直接置于介质例如但非限于淡水水族箱、海水水族箱和废水中。在本发明的另一个实施方案中，所述细菌菌株和组合物可以在旋转式生物学接触器上生长，然后置于所述介质中。在不同的实施方案中，本发明的细菌菌株和组合物可以置于所述介质中包含的生物过滤装置上。在另一个实施方案中，本发明的细菌菌株和组合物可以固定在固定的聚合物中，所述聚合物例如但非限于是丙烯酰胺，藻酸盐或角叉菜胶。然后将这个加载了细菌的聚合物置于过滤器上或者其自己可以处于合适设备的过滤流中。

[0090] 如本文所用，术语“水族箱(aquarium)”是指可以组合或者全部由但非限于玻璃、塑料或者木材制成的盛水容器及其内容物，所述水族箱中放置了活的水生生物(如鱼、植物、细菌和无脊椎动物)。水族箱可以是为了展示水生生物、为了短期或长期容纳、为了科学研究、为了运输及其它目的。淡水水族箱通常是其中液体介质的盐度小于15‰的水族箱。盐水水族箱通常是其中液体介质的盐度大于15‰的水族箱。术语“水族箱的水”指的是水族箱及其相关的过滤系统内包含的其中存在有水生生物的介质。水族箱的水可含有众多的无机或有机化学物质，并因此具有众多的参数如盐的浓度、pH、总计溶解的固体和温度等等。

[0091] 如本文所用，“废水”通常是指工业或人类产生的液体介质。需要通过一或多种过滤方法处理废水以使其对环境危害减小，由此符合政府机构确定的排放标准。废水也可以再循环，由此不排放到环境中。

[0092] 如本文所用，“生物学过滤器(biological filter)”，也称“生物过滤器(biofilter)”，通常是指这样的一种过滤器类型，其目的是促进微生物的生长或者为微生物的吸附和生长提供基质。生物过滤器可以是水族箱过滤系统或者废水过滤系统的一部分。如本文所用，术语“旋转式生物学接触器(rotating biological contactor)”通常是指在水或介质中旋转的一类生物过滤器。其可以全部或部分浸没在水或介质中。本领域技术人员了解如美国专利No.2,085,217、2,172,067、5,423,978、5,419,831、5,679,253、5,779,885及所有后续申请、改进以及外国同族申请中所述的旋转式生物接触器，所述文献均以全文并入参考。

[0093] 如本文所用，“过滤丝绵(filter floss)”是指不规则形状的天然或合成多链材料，其可以作为生物过滤器、机械过滤器或者这些的组合。

[0094] 如本文所用，“水族箱砂砾(aquarium gravel)”是指通常置于水族箱内部、底部的物质。其可以由不规则的或规则形状的石头、珊瑚、塑料或其它材料组成。其可以作为生物过滤器、机械过滤器、为了装饰目的或者这些的组合。

[0095] 如本文所用，术语“过滤海绵(filter sponge)”是指当用于水族箱中或者作为水族箱过滤系统的一部分可作为机械过滤器、生物过滤器或者这两者的天然或合成的材料。

[0096] 如本文所用，“塑料过滤介质(plastic filter media)”是指作为生物过滤器、机械过滤器或者这两者的人造材料。其可以是塑料制模或注模的。

[0097] 在另一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列或者具有与SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ NO：8具有至少96％、97％、98％或者至少99％相似性的其变体的核苷酸序列的核酸序列和细菌。

[0098] 在另一个实施方案中，本发明提供了检测和测定介质中存在的本发明的细菌的量的寡核苷酸探针。所述探针具有SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18所示核苷酸序列。本发明的寡核苷酸探针可以通过本领域已知的方法合成。

[0099] 本发明的寡核苷酸探针可以通过任何可检测的标记物进行标记。合适的标记物例如包括但非限于放射性标记、荧光标记等等。合适的标记物可商购并为本领域技术人员所已知。标记寡核苷酸或多核苷酸的方法也为本领域技术人员所已知(见例如Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.Molecular Cloning-A Laboratory Manual，secondedition，1989，Cold Spring Harbor Press)。

[0100] 本发明的寡核苷酸探针能与本发明的细菌菌株的16S rDNA杂交。因此，本发明的寡核苷酸探针非常适用于检测和确定本发明的细菌的数量的方法中。

[0101] 在本发明的一方面，提供了检测和确定在介质中能将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的细菌的数量的方法，其中所述细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。所述方法可包括：

[0102] (a)提供具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的本发明的被可检测地标记的探针；

[0103] (b)从介质中分离总DNA；

[0104] (c)将分离的总DNA在所述探针仅与所述细菌的核酸杂交的条件下暴露于所述被可检测地标记的探针，其中所述细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；以及

[0105] (d)检测并测定杂交的探针以检测和测定所述细菌的数量。

[0106] 本发明的探针以SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18表示。与前述任何探针在全长上具有至少96％相似性的序列也可以用于检测本发明的细菌。这些探针在随后的实施例中进一步描述。

[0107] 所述介质可以是水族箱的水，其中所述DNA分离自其中。所述介质也可以含有但非限于一种材料如水族箱砂砾、海绵过滤材料、过滤丝绵、或者塑料过滤介质。因此，所述DNA可以分离自期望可以发现所述细菌的上述及其它来源。

[0108] 本发明的方法可以联合DNA芯片或者本领域技术人员已知的相似工具进行。DNA芯片可包括一种固体载体及通过共价键固定在所述固体载体上的一组核苷酸衍生物或其相似物。利用DNA芯片检测核酸片段通常使用与待检测的核酸片段互补的寡核苷酸探针通过杂交进行。所述寡核苷酸探针通常被固定在固体载体(例如固相基质)上。在检测过程中，将液体样品中的核酸片段用荧光标记或放射性同位素标记进行标记，然后将所述液体样品与DNA芯片的寡核苷酸探针接触。如果所述液体样品中标记的核酸片段与所述寡核苷酸探针互补，则标记的核酸片段通过杂交而与所述寡核苷酸探针组合。通过与寡核苷酸探针杂交而固定在DNA芯片上的标记的核酸片段然后可以通过适当的检测方法检测，例如通过荧光测定法或者放射自显影术检测，也可以利用其它检测方法检测。

[0109] 所述方法或者可以与本领域技术人员了解的许多自动化方法联合进行，及通过常规实验执行。例如，本发明的方法可以用DNA或蛋白质微阵列，生物传感器，生物探针，毛细管电泳及实时PCR等方法进行，以产生一些通用方法，但本领域技术人员也可以使用除了上述之外的方法进行。

[0110] 本发明的检测方法提供了用于监测及检测在介质中能够将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的细菌的存在的有效工具。本发明还提供了通过测定本发明的细菌的存在或量而核查商业添加物以确定所述添加物的效力的工具。

[0111] 在另一个实施方案中，本发明提供了PCR引物，其可用于检测本发明的细菌和核酸序列。所述PCR引物如SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示。与前述PCR引物在全长上具有至少96％相似性的序列也可以用于检测本发明的细菌。这些PCR引物在随后的实施例中进一步描述。

[0112] 本领域技术人员易于意识到可用于检测本发明的细菌和核酸序列的前述寡核苷酸探针和PCR引物的变体也包含在本发明的范围内。例如，由于一或多个核苷酸的添加、缺失或取代而与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19、SEQID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22不同但仍可用于检测本发明的细菌和核酸序列的所述寡核苷酸探针或引物的变体包含在本发明范围内。

[0113] 本发明包括分离的细菌、分离的细菌菌株、细菌培养物及包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示序列或这些序列的变体的核苷酸序列。特别优选的变体是与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有高度相似性的那些变体。本发明包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8具有至少96％、
97％、98％或者至少99％相似性的变体。本领域技术人员意识到教导怎样产生和使用相关序列(如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8)的公开也足以教导如何产生和使用所述变体。

[0114] 美国发布了描述了亚硝酸盐氧化细菌、使用该细菌的方法及检测该细菌的方法的三个被共同转让的(commonly-assigned)专利(见美国专利No.6,207,440，6,265,206和6,268,154)。所有这三个专利均描述了一种核苷酸序列及与该序列具有96.1％以上同源的任何变体。这些专利的被授权表明阐述特定序列及描述特定变体的说明书使得本领域技术人员可以产生并使用所述序列及其所述变体。另外，公开核苷酸序列的专利也公开并要求保护这些序列的变体是本领域的常规做法(见例如美国专利No.6,465,621，6,509,170和
6,573,066)。

[0115] 特定核苷酸序列的变体可以是天然发生的序列多态性或合成的序列改变(见例如美国专利No.6,485,938)。核苷酸序列的众多天然的和合成的修饰以及产生合成的变体的方法是普遍的并为本领域所熟知(见例如美国专利No.6,448,044和6,509,170)。对比两或多个核苷酸序列的相似性的方法为本领域所熟知。相似的序列通常使用计算机程序如BESTFIT和BLAST(见例如美国专利No.6,461,836)鉴别。另外，可使用杂交方法检测变体序列与参考序列之间的相似性(见例如美国专利No.6,573,066)。因此，本领域技术人员能通过使用已知技术合成并鉴别参考序列的变体的核苷酸序列。因此，描述核苷酸序列及其变体的说明书使得本领域技术人员可以产生并使用所述序列及其变体。

[0116] 实施例

[0117] 进行了一系列分析和实验来分离、鉴别并示出本发明报道的细菌菌株的效力。所述分析和实验包括各种细菌培养技术、培养物样品中提取的DNA的分子生物学分析、细菌菌株的分子生物学分析、及浓缩的细菌菌株培养物以液体和冻干形式在水族箱中的应用以测定其控制亚硝酸盐浓度的能力。

[0118] 实施例1：细菌培养

[0119] 搭建细菌培养容器(称为反应器)并接种从运行中的水族箱中收集的细菌生物量。每个反应器接受含有50g KH2PO4、50g K2HPO4、18.75g MgSO4·7H2O、1.25g CaCl2·2H2O和1g FeSO4·7H2O的4.95L无机盐溶液(用蒸馏水制成)。提供空气，由此溶解的氧等于或高于7.5mg/L，搅动，并将反应器在大约28℃置于暗箱中。

[0120] 为了在盐水环境中分离并培养本发明的NOB菌株，加入合成的海盐(INSTANT OCEAN，Aquarium SystemsInc.，Mentor，OH)以达到盐浓度为28-33ppt。

[0121] 氨和亚硝酸盐浓度每日使用流动注射分析(f1ow injectionanalysis)(FIA，Tecator FIASTAR 5010 system)测定，pH使用电极(Denver Instruments Model 225 pH/ISE计和相关的pH/ATC电极)测定。盐度使用YSI Model 30 Salinity，Temperature，Conductivity probe测定。定期测定亚硝酸盐浓度，并将该数据用于确定何时需要更换水。在更换水期间细菌生物量保持在反应器中，因为所述生物量在自然状态是非常絮凝的。因此在通过适当的取样口轻轻倒出50％的反应器体积之前，将所述生物量通过关闭通气和搅动装置1小时而沉降。另外，定期擦洗反应器以从表面除去所述生物量，从而使该生物量恢复悬浮状态。依常规进行生物学取样用于DNA提取(进行PCR)和细胞固定(进行FISH)以进一步分析。

[0122] 实施例2：核酸取样和提取

[0123] 为了进行DNA提取，获取合适的生物学过滤介质的样品并将其再悬浮于细胞裂解缓冲液(40mM EDTA，50mM Tris-HCl，pH8.3)中。将样品在-20℃或者-74℃贮存直至进行提取。为了进行处理，将溶菌酶加入样品中至终浓度为10mg/ml。在37℃温育90分钟后，加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为1％。然后将样品进行4次冷冻/解冻循环，随后加入蛋白酶K(原液浓度为10mg/ml)至终浓度为2mg/ml，在70℃温育35分钟。在一些情况中，加入额外的蛋白酶K和SDS，并且将样品在55℃另外温育30分钟。

[0124] 在细胞裂解后，使用EASY DNA提取试剂盒(QiagenInc.，SantaClarita，CA，后文称作Qiagen″)提取DNA。将DNA洗脱至50μl体积，并通过Hoechst型33258染料结合及荧光测定方法(DYNAQUANT200，Hoefer Pharmacia B iotechInc.，San Francisco，CA)量化。

[0125] 实施例3：PCR扩增的rRNA基因的克隆文库

[0126] 克隆文库衍生自取自反应器和水族箱的生物量样品的DNA提取物。将来自以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8的序列所表示的细菌的核糖体RNA基因片段使用引物S-D-Bact-0011-a-S-17(8f；GTT TGA TCC TGG CTC AG)(SEQ IDNO：9)和1492r(真细菌；GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)(SEQ IDNO：10)进行扩增。PCR条件、循环参数及反应成分如先前所述(DeLong，E.F.1992.Archaea in coastal marine environments.Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89：5685-5689)。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳评价。将PCR片段在用TE缓冲液漂洗及用CENTRICON浓缩器(Amicon，Inc.Beverly，MA)浓缩为30μl之后，使用TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据厂商指导进行克隆。

[0127] 实施例4：测序及系统发生分析

[0128] 将包含克隆文库的每个克隆的16S rDNA插入体使用限制酶HaeIII通过限制酶分析(REA)进行筛选，以保证16S rDNA插入体是可以扩增的，并且确定当16S rDNA用Hae III酶消化时是否具有独特的REA模式。如果克隆是可扩增的并且具有独特的REA模式，则对含有感兴趣的16S rDNA插入体的克隆质粒进行部分测序。将针对测序选择的每个克隆的扩增的PCR 16S rDNA模板使用PCR纯化试剂盒目录号No.28142(Qiagen)进行纯化。使用LICOR 4000L自动DNA测序仪使用荧光标记的引物和SEQUITHERM EXCEL II DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI)对模板循环测序。

[0129] 对相同REA模式的两或三个克隆进行部分测序以保证它们是相同的。对许多克隆进行完全测序并通过PAUP(Phylogenetic AnalysisUsing Parsimony ver 4.0b2a，D.L. Swofford)(自引导值(bootstrap value)和距离分析)、ARB(A Software Environment for SEQuence Date，W.Ludwig and O.Strunk)(系统发 生树)和 Phylip(Phylogeny InferencePackage J.Felsentein)(相似性矩阵)进行系统发生分析。使用ARB探针设计和探针匹配程序以及之后的人工序列对比产生来自所述克隆文库的感兴趣的克隆的引物和探针。引物和探针用BLAST(S.F.Altschul et al.1990.Basic local alignment tool.J.Mol.Biol.215：403-410)进行双重检验。引物的特异性通过将其用于自已知细菌的克隆和纯培养物中提取的DNA而确定。探针的特异性使用已知细菌的纯培养物及来自反应器的样品进行测试。

[0130] 实施例5：DGGE分析与表征(Profiling)

[0131] 为了进行一般的真细菌DGGE分析，将rDNA片段使用如Murray等所述在5’末端具有40-bp GC-夹(GC-clamp)的正向引物358f(真细菌；CCT ACG GGA GGC AGC AG)(SEQ ID No：11)(A.Murray et al.1996.Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two Californiaestuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of16SrDNA fragments.Appl.Environ.Microbiol.62：2676-2680)， 及 反 向 引 物*S--Univ-0519-a-A-18(5 19r：GWA TTA CCG CGG CKG CTG)(SEQID NO：12)进行扩增。对于特异性NOB DGGE，在5’末端具有40-bpGC-夹的正向引物358f(SEQ ID No：11)与反向引物NSP685(NSP685：CAC CGG GAA TTC CGC GCT CCT C)(SEQ ID NO：13)一起使用。PCR条件是相同的，使用TAQ PCR核心试剂盒(Qiagen)在ROBOCYCLER GRADIENT 96(Stratagene，La Jolla，CA)上进行。PCR条件包括热起始(80℃)及降温(touchdown)程序。最初在94℃变性3分钟，随后在94℃变性1分钟，从65℃至55℃降温退火1分钟29秒(在降温期间退火时间每次循环增加1.4秒)及在72℃引物延伸56秒(延伸时间每次循环增加1.4秒)。
上述热循环的最后温度系列共重复20次，随后在72℃最后延伸5分钟。扩增子通过琼脂糖凝胶电泳检测。

[0132] DGGE使用Bio-Rad D-GENE系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA；后文称作Bio-Rad)进行。凝胶是8.5％丙烯酰胺/Bis，使用Bio-Rad试剂(D GENE Electrophoresis Reagent Kit，Bio-Rad)进行。除非另外说明，凝胶梯度使用变性梯度为25％-55％(其中100％变性剂是40％去离子的甲酰胺与7M尿素的混合物)的Bio-Rad试剂(D GENE Electrophoresis Reagent Kit，Bio-Rad)及Bio-Rad梯度输送系统(Model 475，Bio-Rad)倾注。所有凝胶均在200伏特运行6小时。为了进行文件记录，将一些凝胶在Vistra Green(1∶10,000稀释)(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA；后文称作“Molecular Dynamics”)中染色20分钟，随后在1×TAE缓冲液中洗涤20分钟，然后使用FLUORIMAGER SI(Molecular Dynamics)扫描。

[0133] 使用经酒精消毒的手术刀从DGGE凝胶中切下各个条带。从所述凝胶中根据Ferris等的方法(M.J.Ferris et al.1996.Denaturinggradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populationinhabiting a hot spring microbial mat community.Appl.Environ.Microbiol.62：340-346)提取DNA。将切下的条带置于具有500μl无菌去离子水的2ml无菌螺旋盖的试管中。将该试管充填一半的玻璃珠(cat.no.11079-101，Biospec ProductsInc.，Bartlesville，OK；后文称作Biospec)并置于机械的珠搅动器(MINI-BEADBEATER-8，Biospec)中以最高设置搅动3分钟。将处理的DNA在试管中在4℃保持过夜。在过夜贮存后，将该试管在4℃以3,200×g离心8分钟以浓缩凝胶片段。将上清移至干净的Eppendorf管中。

[0134] 为了检测提取效率，有时将上清用DGGE引物再扩增及通过DGGE再次分析。如果在DGGE分析中产生与混合的样品群中最初的DGGE条带共迁移的单一条带，则认为所述提取是可接受的。切下的条带的核苷酸序列通过先前所述方法使用荧光标记的引物测序。

[0135] 实施例6：寡核苷酸探针产生

[0136] 用荧光染料标记的寡核苷酸探针被设计为与分离自本研究中的反应器的密切相关的细菌的16S rRNA基因序列特异性杂交。一种探针，SNOBTP(GTT GCC CCG GAT TCT CGT TC)(SEQ ID NO：14)，靶向本研究中发现的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的所有硝化螺菌样细菌，但不包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所表示的其它亚硝酸盐氧化细菌(硝化球菌样细菌)，也不包括维氏硝化杆菌所代表的变形菌门α亚门的亚硝酸盐氧化细菌。这种探针已经与Cy-3或荧光素-ON(Qiagen Inc.，USA)染料一起成功使用，甲酰胺百分比为20％。

[0137] 另一种探针，NSP685(CAC CGG GAA TTC CGC GCT CCT C)(SEQ ID NO：15)，可用于靶向SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所表示的硝化螺菌样细菌的特异性进化枝(称为进化枝1)。探针NSP685(SEQ ID NO：15)用荧光染料Cy-3标记，在杂交期间向反应中加入两种额外的探针。这两种额外的探针是用荧光素-ON(QiagenInc.，USA)标记的SNTSP2(CAC CGG GAA TTC CGC ACTCCT C)(SEQ ID NO：16)和也用荧光素-ON标记的EUBAC338(GCTGCC TCC CGTAGGAGT)(SEQ ID NO：17)。甲酰胺的百分比为55％。在这种方式中，进化枝1硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌是在显微镜目测视野中可见的唯一生物体。

[0138] 第三种探针组合可用于靶向SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所表示的硝化螺菌样细菌的另一特异性进化枝(称作进化枝2)。这包括使用荧光素-ON标记的探针SNTSP2(SEQ ID NO：16)组合两种其它的探针：用Cy-3标记的NSP685(SEQ ID NO：15)及也用Cy-3标记的EUBAC338(SEQ ID NO：17)。甲酰胺的百分比为55％。在这种方式中，进化枝2硝化螺菌样亚硝酸盐氧化细菌是显微镜目测视野中可见的唯一生物体。

[0139] 第四种探针，MOBP(CTC GCC AGC CAC CTT TCC GAA)(SEQID NO：18)，靶向SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所表示的硝化球菌样亚硝酸盐氧化生物，但不包括所有硝化螺菌样亚硝酸盐氧化生物，也不包括维氏硝化杆菌所代表的变形菌门α亚门的亚硝酸盐氧化细菌。这个探针的甲酰胺百分比为20％，应用的染料是Cy-3。

[0140] 探针匹配最初使用BLAST(S.F.Altschul et al.1990.Basic localalignment tool.J.Mol.Biol.215：403-410)和CHECK PROBE(B.L.Maidak et al.1994.The ribosomal database project.Nucleic Acids Res.22：3485-3487.)筛选。探针是由Operon Tech，Inc.(Alameda，CA)合成的。探针的核苷酸序列示于表9。

[0141] 表9：亚硝酸盐氧化细菌的寡核苷酸探针和PCR引物组的核苷酸序列和位置[0142]

[0143] 探针(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：18)的严格性通过在不同甲酰胺浓度的一系列FISH实验确定，使用反应器生物量作为本发明的细菌序列(SEQ ID NO：1、SEQED NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、或SEQ ID NO：8)的阳性对照。在杂交溶液中进行固定的细胞原位杂交，所述杂交溶液由0.9M NaCl，20mM Tris/HCl(pH7.4)，0.01％十二烷基硫酸钠(SDS)，25ng寡核苷酸探针及不同量的甲酰胺组成。将载玻片在46℃在平衡后的湿度室中温育90-120分钟。将杂交溶液用预温的(48℃)洗涤溶液漂洗掉。然后将该载玻片在48℃在洗涤溶液中温育15分钟。为了在洗涤步骤中达到与在杂交步骤中相同的严格性，则洗涤溶液含有20mM Tris/HCl(pH7.4)，0.01％SDS，5mM EDTA，和NaCl。NaCl的浓度根据溶液中使用的甲酰胺的百分比而变化。对于20％的甲酰胺，NaCl的浓度为215mM，对于30％甲酰胺则NaCl浓度为120mM，对于40％甲酰胺则NaCl浓度为46mM。使用装配了针对FITC/FLU03和HQ CY3的滤镜装置的AXIOSKOP 2落射荧光显微镜(Carl Zeiss，Jena，Germany)检测细胞。对于SNOBTP探针(SEQ ID NO：14)，确定的最佳严格性为20％甲酰胺。对于NSP685和SNTSP2三重标记的探针(分别为SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)，确定的最佳严格性均为55％甲酰胺。对于SEQ IDNO：18所示的MOBP探针，确定的最佳严格性为20％甲酰胺。

[0144] 实施例7：PCR引物产生

[0145] 产生特异性检测本发明的序列的硝化螺菌样细菌(表9)的一组PCR引物(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)。产生特异性检测本发明的序列的硝化球菌样细菌(表9)的另一组PCR引物(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。第一组引物(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)特异性检测包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8所示16S rDNA序列的硝化螺菌样细菌，但不包括其它亚硝酸盐氧化细菌(表10)。第二组引物(SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22)特异性检测包括SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示16S rDNA序列的硝化球菌样细菌，但不包括其它亚硝酸盐氧化细菌(表10)。PCR条件如实施例5所述，不同之处是退火温度修改为表10所示。

[0146] 表10：PCR引物产生特异性测试和退火温度实验的结果

[0147]

[0148] “+”强信号，“-“无信号，“+/-“弱信号

[0149] 每个引物组的特异性通过用每个引物组使用StratageneROBOCYCLER温度梯度模式进行PCR实验而优化。在这种模式中，可以在最多12个不同退火温度运行所有反应的一个单一实验。典型地，在间隔提高2℃的4-6个不同温度进行实验。每个PCR引物组针对具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的克隆产物进行测试。表9示出了PCR引物系列，最佳退火温度结果示于表10。

[0150] 实施例8：相似性分析

[0151] 从盐水硝化生物量中构建三个克隆文库，以鉴别将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的亚硝酸盐氧化剂。关于所述生物量的详细内容示于表11。

[0152] 表11：关于从中提取生物量并构建克隆文库的反应器和水族箱的详细内容[0153]

[0154] 克隆文库数据示出在测试的给予氨的反应器中存在两组亚硝酸盐氧化细菌。两种类型的亚硝酸盐氧化细菌是硝化螺菌样生物和硝化球菌样微生物(表12)。然而，在所有三个克隆文库中只发现硝化螺菌样NOB。经鉴别是硝化螺菌样NOB的克隆的百分比是全部筛选的克隆的3.11-33.33％。硝化球菌样NOB在三个克隆文库的两个文库中发现，百分比为全部筛选的克隆的2.56％和8.70％(表12)。

[0155] 表12：针对亚硝酸盐氧化细菌产生的三个克隆文库中属于不同系统发生类群的克隆的数目

[0156]

[0157] “+”存在；“-”不存在。括号中给出了筛选的总克隆的百分比

[0158] 对本文所述的8个克隆序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)进行相似性等级评定，使用RDP进行(Maidak，B.L.，J.R.Cole，C.T.Parker，Jr，G.M.Garrity，N.Larsen，B.Li，T.G.Lilburn，M.J.McCaughey，G.J.Olsen，R.Overbeek，S.Pramanik，T.M.Schmidt，J.M.Tiedje and C.R.Woese.A new version of the RDP(RibosomalDatabase Project).Nucleic Acids Res.27：171-173(1999))(表13)。

[0159] 表13：分离自反应器和水族箱的亚硝酸盐氧化克隆的相似性等级评定

[0160]

[0161] 相似性分析表明一组克隆(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所表示)与活动硝化球菌(nitrococcus mobilis)具有98.9％相似性(表13)。

[0162] 相似性分析表明有本发明的硝化螺菌样NOB的两个进化枝(SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)。进化枝1包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所表示的NOB。在进化枝1中，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所表示的NOB与海洋硝化螺菌具有99.2％相似性，SEQ ID NO：5所表示的NOB与海洋硝化螺菌具有98.7％相似性。进化枝2包括SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的NOB。在进化枝2中，SEQ ID NO：6所表示的NOB与海洋硝化螺菌具有92.2％相似性，SEQID NO：7所表示的NOB与海洋硝化螺菌具有91.6％相似性，SEQ IDNO：8所表示的NOB与海洋硝化螺菌具有94.0％相似性。

[0163] 通过使用邻位相连距离分析(neighbor joining distance analysis)和拔靴分析(bootstrap analysis)构建系统发生树对序列进行的系统发生分析支持了相似性分析的结果(图1)。系统发生分析结果示出SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2彼此相似的高可能性，最接近的已知相关物种是活动硝化球菌。然而，这个结果还示出SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2不是活动硝化球菌。

[0164] 系统发生分析结果还支持了存在与已知硝化螺菌属细菌截然不同的盐水硝化螺菌样NOB的两个单独的进化枝的结论(图1)。SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所表示的进化枝1与SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的进化枝2截然不同。进化枝1盐水硝化螺菌样NOB与海洋硝化螺菌具有最接近的相关性。

[0165] 例如，毫无疑问进化枝2盐水硝化螺菌样NOB(SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)至少是一种新的细菌菌种。相似性分析示出其最接近的相关性(海洋硝化螺菌)是至多94.0％相似性(在SEQ ID NO：8的情况中)。系统发生分析示出这3个序列与所有已知硝化螺菌属细菌均明显地截然不同(图1)。BLAST分析示出海洋硝化螺菌是数据库中与这些序列最接近的细菌，但是海洋硝化螺菌的序列与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列显然不同，这通过相似性和系统发生分析证实。

[0166] 表13中给出的相似性等级评定是确定细菌菌株唯一性的指导。没有定义新的细菌菌种的硬性和可靠的规则。然而，例如具有0.989相似性等级的氨氧化细菌多形亚硝化叶菌(Nitrosolobus multiformis)和纤细亚硝化弧菌(Nitrosovibrio tenuis)被所有微生物学机构公认是不同的菌种，多形亚硝化叶菌和白里亚硝化螺菌(Nitrosospira briensis)同样如此(相似性等级为0.980)。当与海洋硝化螺菌相对比时，SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所表示的细菌菌株相似性等级为0.992。这个相似性等级略高于上述0.989，但是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4仍与海洋硝化螺菌足够不同，构成新的和独特的菌种。

[0167] 因此，克隆数据、PCR结果、系统发生分析、DGGE数据和相似性等级评定的全部结果表明本发明报道的细菌菌株是独特的，与已知的亚硝酸盐氧化细菌截然不同。

[0168] 实施例9：细菌分析和实验结果

[0169] 硝化螺菌样NOB的克隆成员在产生克隆文库的所有三种盐水富集物中均发现(表12)。硝化螺菌样NOB在鉴别的全部克隆中占显著的一部分，从全部克隆的略超过3％(SB7)至高于33％(P4)。

[0170] 硝化球菌样NOB在3个克隆文库的仅2个中发现(表12)，并且数目少于硝化螺菌样NOB。在样品B7中，少于3％的克隆经鉴别是硝化球菌样NOB，而在样品SB7中，该百分比是14％。在样品P4中未发现硝化球菌样NOB(表12)。

[0171] 实施例10：克隆及反应器的变性梯度凝胶电泳测量

[0172] 本发明报道的各种细菌菌株的新颖性通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)测试的结果而进一步论证。图2示出硝化球菌样NOB(SEQID NO：1和SEQ ID NO：2)及硝化螺菌样NOB的进化枝1(SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)和进化枝2(SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8)二者连同氨和亚硝酸盐氧化细菌的富集物的代表性克隆的DGGE结果。结果示出SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(硝化球菌样NOB)在凝胶中迁移距离略有不同。三个进化枝2硝化螺菌样克隆(SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)的条带位置也不同，预测这是因为16S rRNA基因中序列略有不同所致(表6-8)。另外，当对比图2上4个富集物的条带位置时(泳道E，F，G和H)，难以区别凝胶中这些富集物的条带是否与SEQ ID NO：1(硝化球菌样NOB)或SEQ ID NO：7(硝化螺菌样NOB)排列在一起。

[0173] 因此，进行另一种类型的DGGE分析。对于这种DGGE分析，将梯度从标准的25-55％改变为30-60％，在200伏特运行360分钟。图3示出由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2(二者都是硝化球菌样NOB)和SEQ ID NO：7(硝化螺菌样NOB)组成的一组混合的克隆标准物以及单独运行的这些相同克隆及NOB富集物(泳道A)的条带迁移模式。结果示出可以通过这种DGGE将这三种克隆的条带清晰分离。另外，切下富集物(泳道A)中的两条条带，如前述处理并测序。上方的条带与克隆SB7c32(SEQ ID NO：1)匹配，下方的条带与克隆B7c10(SEQ ID NO：7)匹配，进一步证实本发明的方法和结果的有效性。

[0174] 图4表示了另一种DGGE分析，示出与图2同样富集的样品，但由于凝胶条件的改变(见上述)而导致更高的分辨率。结果清晰示出在环境样品中可以区分硝化螺菌样NOB和硝化球菌样NOB(泳道G-K)。

[0175] 实施例11：细菌添加物测试(Baeterial Additive Test)

[0176] 进行一系列实验以确定含有本发明的细菌菌株的各种细菌混合物与如下组相对比的效力：(1)未接受混合物的水族箱，(2)接种用于热带鱼水族箱的细菌混合物的水族箱，(3)保藏或贮存的本发明的细菌菌株的细菌混合物。

[0177] 混合物的效力通过示出本发明的亚硝酸盐氧化细菌菌株使水族箱中的亚硝酸盐氧化并且当与其它细菌菌株(例如氨氧化细菌)组合时该细菌促进在水族箱中建立硝化作用而证明。硝化作用的建立可以至少三种不同方法测定。第一种方法是通过计数在设置新的水族箱后水族箱的水中氨和亚硝酸盐浓度达到接近0mg/L浓度需要的天数测定。在新设置的盐水水族箱中，典型地氨浓度需要大约14天达到0mg/L，亚硝酸盐浓度需要30-35天达到0mg/L。

[0178] 第二种测定向水族箱中加入硝化细菌菌株的有益作用的方法是比较氨或亚硝酸盐的浓度降低至0mg/L之前所达到的最大浓度。如果氨或亚硝酸盐在加入硝化细菌的水族箱中所达到的最大浓度显著低于在对照水族箱中所达到的最大浓度，则表明了该细菌效力的程度。

[0179] 实施例12：细菌添加物测试

[0180] 这个测试的目的是评价本发明的NOB菌株的各种混合物将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力，从而它们可以在“真实世界”环境中应用。将本发明的混合物的性能与适用于淡水或盐水水族箱的可商购细菌混合物相对比。

[0181] 为进行这个测试，将15个10加仑水族箱和15个Penguin 170B(Marineland Aquarium Products)后挂式动力过滤器进行消毒，彻底漂洗并风干。第二天，将每个水族箱充填10磅经漂洗的Tideline CrushedCoral#5并装备消毒的动力过滤器(PF 0170B)和经漂洗的碳滤筒(cartridge)。每个水族箱充填35L人工海水。所述人工海水是通过将Tropic海盐混合物与后GAC水组合成盐度为30ppt而制成的。在加入细菌添加物和鱼之前将过滤器运行过夜。

[0182] 第二天早晨，将所述水族箱中加满超纯净水以补偿蒸发的水分，然后取水样。每个水族箱给予一种细菌处理，然而对照组中不加入细菌混合物。

[0183] 这个测试有4种处理方式：反应器21和29，其均包括SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所表示的本发明的硝化螺菌样NOB的所有菌株；CYCLE(用于淡水或盐水中的商购的细菌混合物)；以及STRESSZYME(用于淡水或盐水中的另一种商购的细菌混合物)。每种处理一式三份进行。接受反应器21和反应器29处理的水族箱在测试的第1天给予一次100ml两种混合物中的任一种。接受CYCLE或STRESSZYME处理的水族箱在测试第1天给予10ml两种材料中的任一种处理，在第7天再给予10ml，之后在测试期间每7天再给予5ml处理。在测试的第1天向每个水族箱中放入4条经分类的热带鱼(雀鲷科(Pomacentrus spp.))，并每日喂食两次。

[0184] 每日收集水样并测试pH，氨，亚硝酸盐和导电性。在周一、周三和周五测试水的硝酸盐和浊度。pH的测定使用装备了DenverInstruments pH复合电极的Denver Instruments Model 225pH/Ion仪表进行。使用Tecator FIASTAR 5010分析仪根据Tecator使用说明中所述方法测定氨浓度、亚硝酸盐浓度和硝酸盐(以氮的形式)浓度。使用YSI Model 30手持式盐度、导电性和温度系统每日直接测定每个水族箱中的盐度。浊度数据使用DRT-100浊度仪(HF Scientific)测定。

[0185] 4种处理的处理组和对照组的平均亚硝酸盐浓度示于图5。包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所表示的NOB菌株的处理反应器21和29与其它处理组相比更快速地氧化亚硝酸盐。反应器处理组中的亚硝酸盐浓度与其它处理组相比更快速地达到峰值及下降至0mg/L(图5)。反应器21在第21天达到0mg/L，反应器29在第29天达到0mg/L，而对照组和商业添加物处理组直至第37天或更晚的时间才下降至0mg/L(图5)。

[0186] 这些结果表明：(1)本发明的NOB菌株在新设置的盐水水族箱中促进亚硝酸盐的氧化，(2)据报道含有NOB维氏硝化杆菌的商业添加物在新设置的海水水族箱的启动期间对控制亚硝酸盐是无效的。

[0187] 实施例13：细菌添加物测试

[0188] 这个测试的目的是评价本发明的NOB菌株的各种混合物将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力，从而它们可以在“真实世界”环境中应用。将来自反应器SB7(含有本发明的硝化螺菌样NOB及硝化球菌样NOB菌株)的材料置于水族箱中，将这个系统的性能与未接受细菌接种的水族箱的性能相对比。

[0189] 为进行这个测试，将8个10加仑水族箱和8个Penguin 170B(MarinelandAquarium Products)后挂式动力过滤器进行消毒，彻底漂洗并风干。第二天，将每个水族箱充填10磅经漂洗的Tideline CrushedCoral#5并装备消毒的动力过滤器(PF 0170B)和经漂洗的碳滤筒。每个水族箱充填35L人工海水。所述人工海水是通过将INSTANTOCEAN海盐(Aquarium Systems，Mentor，Ohio)加入碳过滤的自来水中直至盐度为30ppt而制成的。
将水族箱充填该海水并在加入细菌添加物和鱼之前将过滤器运行过夜。

[0190] 第二天早晨将水族箱用超纯净水加满以补偿蒸发的水分，然后取水样。接着将4个水族箱给予150ml的SB7反应器细菌混合物。其它4个水族箱不给予细菌混合物。SB7反应器混合物由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所表示的本发明的硝化球菌样NOB和硝化螺菌样NOB菌株组成。在测试的第一天向每个水族箱中加入6条小丑鱼(眼斑海葵鱼(Amphiprion ocellaris))，每日喂食两次。用冷冻盐水虾和螺旋藻(Spirulina)碎鱼肉糜(fish flakes)混合物喂食该鱼。在测试的第三天，向每个水族箱中再加入4条小丑鱼(眼斑海葵鱼)。

[0191] 每日收集水样并测试pH，氨，亚硝酸盐和导电性。在周一、周三和周五测试水的硝酸盐和浊度。pH的测定使用装备了DenverInstruments pH复合电极的Denver Instruments Model 225pH/Ion仪表进行。使用Tecator FIASTAR 5010分析仪根据Tecator使用说明中所述方法测定氨浓度、亚硝酸盐浓度和硝酸盐(以氮的形式)浓度。使用YSI Model 30手持式盐度、导电性和温度系统每日直接测定每个水族箱中的盐度。浊度数据使用DRT-100浊度仪(HF Scientific)测定。

[0192] SB7处理组的处理和对照组的平均亚硝酸盐浓度示于图6。SB7处理组氧化亚硝酸盐的速度显著快于对照组。接受SB7处理的水族箱中平均亚硝酸盐浓度在第24天达到0mg/L，而对照组在亚硝酸盐达到相同的0mg/L水平之前需要38天。另外，SB7处理的平均最大亚硝酸盐浓度(大约2.4mg/L-N)明显低于对照处理的平均最大亚硝酸盐浓度(7.2mg/L-N)(图6)。

[0193] 结果表明本发明的NOB菌株对于在新设置的海水水族箱中促进亚硝酸盐氧化，并在此期间保持亚硝酸盐低于毒性浓度是有效的

[0194] 实施例14：细菌添加物测试

[0195] 这个测试的目的是评价已经贮存5.5个月的冻干的盐水亚硝酸盐氧化细菌的存活力。这个测试的目的也是测试本发明所述的各种组合物在维护水性介质中的效力。

[0196] 方法：细菌的制备

[0197] 将取自反应器SB1的600L NOB与取自反应器SB2的600L NOB混合在一起并在Harvest Only罐(HOT)沉降过夜。反应器SB1和反应器SB2均含有本发明的所有NOB菌株(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所表示)，并且这两个反应器均保持在30ppt盐度。第二天，从该罐中尽可能多地除去上清。在较小的容器中进行第二次浓缩直至尽可能多地除去上清。收集剩余的细菌并置于5L容器中，沉降另外4-5个小时。再一次，尽可能多地除去上清，并将该溶液分成两部分。此时，向细菌溶液中加入各种量的海藻糖作为冷冻保护剂。在一份溶液中，将50g海藻糖与1000mL NOB混合为5％海藻糖溶液，在另一份溶液中，将100g海藻糖与1000mL NOB混合成10％海藻糖溶液(表14)。相似制备取自两个盐水反应器的AOB以进行冻干。在进一步处理前将样品贮存在4℃。将没有冷冻保护剂的过量的NOB和AOB在4℃贮存用作阳性对照。

[0198] 表14：冻干细菌的实验安排

[0199]

[0200] 为了进行冻干，将样品分成两部分以测试两个基础升华速度(PSR)：温和和快速。将所有样品均倒入预先冷却的盘子中并置于制冷器中。将所述制冷器冷却至-40℃。将样品冷冻3小时，随后置于干燥器中。将样品经过温和或快速PSR进行干燥。将冻干的样品以冻干形式在4℃贮存5.5个月。

[0201] 测试安排：

[0202] 将28个5加仑水族箱和过滤器用Sanaqua消毒，漂洗并通风干燥。将水族箱充填19升新鲜制备的人工海水，所述海水是将INSTANTOCEAN海盐溶解于后-GAC中盐度为29ppt而制成的。将装备了新鲜漂洗的碳滤筒和新的BIOWHEEL的Penguin 125动力过滤器置于每个水族箱上，通电并运行过夜。使用Access Test数据库，将水族箱随机指定特定的处理，每种处理一式四份进行(表15)。

[0203] 表15：细菌添加物测试48安排

[0204]

[0205] 在测试开始时，将水族箱加满去离子水，以补充蒸发丧失的水分，取基线样品。在11a.m.加入细菌并使其循环30分钟，之后取第二个基线样品。在12:30p.m.，向每个水族箱中加入9条三点白(dominodamsel)。每天早晨加满去离子水，然后取样。

[0206] 每日分析样品的pH，氨，亚硝酸盐和浊度。在测试期间间断测定硝酸盐。氨和亚硝酸盐在Foss FIASTAR 5000上使用Foss使用说明所述方法测定。使用Tecator FIASTAR5010根据Tecator使用说明所述方法测定硝酸盐(以氮的形式)浓度。浊度数据使用HF ScientificMicro 100浊度计测定。

[0207] 结果：

[0208] 表16报道了进行每种处理的冻干的细菌和海藻糖混合物的初始湿重及冻干后的干重。

[0209] 表16：各种冻干的细菌处理的初始湿重及冻干后的干重

[0210]

[0211] 在冻干过程期间记录如下情况：温和PSR进行大约35小时，在27℃结束。快速PSR进行大约28小时，在27℃结束。NOB干燥快于AOB。10％海藻糖溶液在干燥的产物上形成一薄层糖。未发现内在沸腾。

[0212] 图7示出这个测试中各种制品处理的平均氨数值(N＝4)。阴性对照组(未加入细菌)需要20天达到0mg/L氨浓度。这个处理中的氨在第7天达到接近7mg/L的峰值。与这些数值相反，无论接受液体(阳性对照)还是冻干形式的硝化细菌的所有处理均显著较快地达到0mg/L氨浓度(图7)。

[0213] 冻干制品处理的平均氨浓度数值在阳性和阴性对照处理之间(图7)。一般地，接受冻干制品处理的水族箱达到大约4-6mg/L的最大氨浓度，在第10-13天之间达到0mg/L。

[0214] 这个测试的各种处理的平均亚硝酸盐浓度示于图8。这些结果对映于氨的数据。接受了细菌(无论阳性对照还是冻干的)接种的所有水族箱均呈现显著快于接受阴性处理的那些水族箱的硝化作用(图8)。

[0215] 图9证实了氨和亚硝酸盐的消失是由于这些化合物氧化成硝酸盐所致。该图清晰示出所有处理随着时间的过去而均产生硝酸盐浓度的增加。阳性对照处理几乎就在测试开始后立即产生硝酸盐。冻干制品处理在大约第10-15天开始产生硝酸盐。这证实了在接种了本发明的细菌菌株的水族箱中比在未接种的水族箱中更迅速地建立硝化作用。

[0216] 这个测试的结果表明本发明的冻干的细菌菌株制品在以冻干形式长期贮存后保持其存活力及将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力。这个测试的结果还表明本发明的液态和冻干的细菌菌株制品在新设置的水族箱中比在未接种的水族箱中可更快速地建立硝化作用。这个测试的结果还表明如本发明所描述的维护水性介质的组合物在所述水性介质中能将氨氧化成亚硝酸盐及将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。

[0217] 实施例15：细菌添加物测试

[0218] 这个测试的目的是评价已经贮存了11个月的冻干的盐水亚硝酸盐氧化细菌的存活力，及确定所述盐水亚硝酸盐氧化细菌在水性介质中降低亚硝酸盐浓度的最佳剂量。这个测试的目的也是测试本发明所描述的各种组合物在维护水性介质中的效力。

[0219] 方法：细菌的制备

[0220] 将取自反应器SB1的600L NOB与取自反应器SB2的600L NOB混合在一起并在Harvest Only罐(HOT)沉降过夜。反应器SB1和反应器SB2均含有本发明的所有NOB菌株(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所表示)，并且这两个反应器均保持在30ppt盐度。第二天，从该罐中尽可能多地除去上清。在较小的容器中进行第二次浓缩直至尽可能多地除去上清。收集剩余的细菌并置于5L容器中，沉降另外4-5个小时。再一次，尽可能多地除去上清，并将该溶液分成两部分。此时，向细菌溶液中加入各种量的海藻糖作为冷冻保护剂。在一份溶液中，将50g海藻糖与1000mL NOB混合为5％海藻糖溶液，在另一份溶液中，将100g海藻糖与1000mL NOB混合成10％海藻糖溶液(表17)。相似制备取自两个盐水反应器的AOB以进行冻干。在进一步处理前将样品贮存在4℃。将无冷冻保护剂的过量NOB和AOB在4℃贮存用作阳性对照。

[0221] 表17：冻干细菌的实验安排

[0222]

[0223] 为了进行冻干，将样品分成两部分以测试两个基础升华速度(PSR)：温和和快速。将所有样品均倒入预先冷却的盘子中并置于制冷器中。将制冷器冷却至-40℃。将样品冷冻3小时，随后置于干燥器中。样品经过温和或快速PSR干燥。冻干的样品以冻干形式在
4℃贮存11个月。

[0224] 从两个盐水NOB反应器(SB1和SB2)中取2L新鲜的细胞及从两个盐水AOB反应器中取5L新鲜的细胞以进行对比测试。将NOB分别组合并沉降过夜。第二天，将上清汲取出并将剩余样品置于Imhoff沉降锥(settling cone)中以确定密度。基于密度，用混合INSTANTOCEAN海盐和去离子水的新鲜制备的盐度为28ppt的盐水进行稀释以达到高剂量浓度(表18)。用盐水对此原液进行系列稀释以获得这个测试中使用的介质及低剂量(表18)。

[0225] 测试安排：

[0226] 将32个10加仑水族箱和过滤器用Sanaqua消毒，漂洗，并通风干燥。将水族箱充填37升新鲜制备的人工海水，所述人工海水是将INSTANT OCEAN海盐溶解于后-GAC中至盐度为29ppt而制成的。将装备了新鲜漂洗的碳滤筒和新的BIOWHEEL的Penguin 125动力过滤器置于每个水族箱上，通电并运行过夜。使用Access Test数据库，将水族箱随机指定特定处理，每种处理一式四份进行(表18)。

[0227] 表18：细菌添加物测试54安排

[0228]

[0229] 在测试开始时，将水族箱加满去离子水以补偿蒸发丢失的水分，取基线样品。在10a.m.加入细菌并使其循环30分钟，之后取第二个基线样品。每天早晨将水族箱加满去离子水，然后取样。每天在取样后向水族箱中人工加入氨(0.5mg/L)以刺激鱼类排泄。

[0230] 每日分析样品的pH，氨，亚硝酸盐和浊度。在测试期间间断地测定硝酸盐浓度。在Foss FIASTAR 5000上使用Foss使用说明所述方法测定氨和亚硝酸盐浓度。使用Tecator FIASTAR 5010根据Tecator使用说明所述方法测定硝酸盐(以氮的形式)浓度。浊度数据使用HFScientific Micro 100浊度计测定。

[0231] 结果：

[0232] 表19报道了进行每种处理的冻干细菌和海藻糖混合物的初始湿重及冻干后的干重。

[0233] 表19：各种冻干细菌处理的初始的湿重及冻干后的干重

[0234]

[0235] 在冻干过程期间记录如下情况：温和PSR进行大约35小时，在27℃结束。快速PSR进行大约28小时，在27℃结束。NOB干燥快于AOB干燥。10％海藻糖溶液在干燥的产物上形成一薄层糖。未观察到内在沸腾。

[0236] 图10示出这个测试中各种处理的平均氨数值(N＝4)。对照组(未加入细菌)经过20天达到0mg/L氨浓度。这个处理中的氨在第12天达到接近7mg/L的峰值。与这些数值相反，无论接受液体还是冻干形式的硝化细菌的所有处理均显著较快地达到0mg/浓度(图10)。

[0237] 对于液体形式，有较高剂量可更快速建立硝化作用的明显倾向。高剂量处理中的平均氨数值不超过0.3mg/L，在第4天水族箱达到0mg/L NH3-N。对于中等剂量处理，平均氨浓度达到大约1mg/L的最大值，在第5天达到0mg/L(图10)。对于低剂量处理，平均氨浓度达到1.5mg/L最大值，在第6天达到0mg/mL。

[0238] 冻干制品处理的平均氨浓度数值彼此非常接近，并且在液体制品处理与对照组的数值之间(图10)。一般地，接受冻干制品处理的水族箱达到最大的氨浓度是大约4mg/L，在10-12天之间达到0mg/L。

[0239] 这个测试的各种处理的平均亚硝酸盐浓度示于图11。这些结果对映于氨的数据。未接种的水族箱在达到接近26mg/LNO2-N的最大浓度后平均50天后达到0mg/LNO2-N。接受细菌(无论是液体还是冻干制品)接种的水族箱与未接种的那些水族箱相比均呈显著较快的硝化作用(图11)。

[0240] 图12证实了氨和亚硝酸盐的消失是由于这些化合物氧化为硝酸盐所致。该图明确示出所有处理随着时间的过去均导致硝酸盐浓度的增加。液体制品处理几乎在测试开始后立即开始产生硝酸盐。冻干制品处理在大约第17天开始产生硝酸盐，而未接种的水族箱直至第40天也不开始产生硝酸盐。这证实了接种了本发明的细菌菌株的水族箱比未接种的水族箱更快速地建立硝化作用。

[0241] 这个测试的结果表明本发明的细菌菌株的冻干制品在以冻干形式长时间贮存后仍保持其存活力及将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力。这个测试的结果还表明本发明的细菌的液体和冻干制品在新装置的水族箱中比在未接种的水族箱中更快速地建立硝化作用。这个测试的结果还表明本发明描述的维护水性介质的组合物在所述水性介质中能将氨氧化为亚硝酸盐及将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。

[0242] 实施例16：细菌添加试验

[0243] 这个试验的目的是评价已经贮存5个月的冷冻的盐水亚硝酸盐氧化细菌的存活力，及评价在不同温度在液体中贮存14个月的细菌的存活力。这个试验的目的也是测试本发明所述的各种组合物在维护水性介质中的效力。

[0244] 方法：细菌的制备

[0245] 从反应器SB1和SB2中收获盐水NOB以进行本试验。反应器SB1和SB2均含有本发明的所有NOB菌株(以SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8表示)，并且均维持在30ppt盐度。还从两个盐水反应器中收获AOB以进行本试验。制备AOB和NOB的3个原种溶液，每个溶液掺入0％，5％和10％的海藻糖作为冷冻保护剂。然后将样品在4℃放置1小时，然后在-80℃放置72小时。最后，将样品分成三份并置于3个不同贮存温度下：-15℃，-20℃及-80℃。将样品在这些温度下贮存5个月。

[0246] 大约在11个月之前，将来自反应器SB1和SB2的盐水NOB及来自AOB反应器的AOB在3个不同温度下贮存：4℃、室温和37℃。将这些液体样品贮存14个月。在贮存期结束时，每种贮存条件产生不同的细胞密度。因此，进行稀释以便每个样品含有等量的细胞(表20)。最后，通过从反应器SB1和SB2及从AOB反应器中收获细菌样品而选择阳性NOB和AOB对照物，之后立即进行细菌添加物51测试。

[0247] 表20：液体样品的制备

[0248]

[0249] 测试安排：

[0250] 将36个5加仑水族箱和过滤器用Sanaqua消毒，漂洗，并通风干燥。将水族箱充填19升新鲜制备的人工盐水，所述人工盐水是将INSTANT OCEAN海盐溶解于后-GAC中至盐度为30ppt而制成的。将装备了新鲜漂洗的碳滤筒和新的BIOWHEEL的Penguin 170动力过滤器置于每个水族箱上，通电并运行过夜。使用Access Test数据库，将水族箱随机指定特定处理，每种处理一式四份进行(表21)。测试的处理条件基于对各种贮存的冷冻的和液体的细菌进行的初始存活力测试而选自较大一组的细菌贮存条件(具有各种浓度的海藻糖的在-80℃、-20℃和-15℃冷冻细菌，及在4℃、室温和37℃的液体细菌)。

[0251] 表21：进行细菌添加物测试的测试安排

[0252]

[0253] 在测试开始时，将水族箱加满去离子水，以补偿蒸发失去的水分，取基线样品。加入细菌并使其循环30分钟，之后取第二个基线样品。每天早晨将水族箱加满去离子水，然后取样。每天在取样后向水族箱中人工加入氨(0.5mg/L)以刺激鱼类排泄。

[0254] 对样品每日分析pH、氨、亚硝酸盐和浊度。在测试期间间断测定硝酸盐。氨和亚硝酸盐在Foss FIASTAR 5000上使用Foss使用说明所述方法测定。使用Tecator FIASTAR5010根据Tecator使用说明所述方法测定硝酸盐浓度(以氮的形式)。浊度数据使用HF ScientificMicro 100浊度计确定。

[0255] 图13示出这个测试中各种处理的平均氨数值(N＝4)。阴性对照(未加入细菌)进行25天以达到氨的浓度为0mg/L。这种处理中氨在第14天达到接近7mg/L的峰值。与这些数值相反，所有实验水族箱，无论接受冷冻制品还是液体细菌处理，均显著较快地达到氨浓度为0mg/L(图13)。

[0256] 图14示出这个测试中各种处理的平均亚硝酸盐数值(N＝4)。接受阴性对照物和在37℃贮存的液体细菌处理的水族箱呈现亚硝酸盐水平增加，该水平在30多天后不减少。与这些数值相反，剩余的实验水族箱，无论接受冷冻制品还是液体细菌处理，均呈现亚硝酸盐浓度降低(图14)。

[0257] 图15示出这个试验中各种处理的平均硝酸盐水平数值(N＝4)。在试验结束后所有水族箱均呈现硝酸盐浓度有一些增加。除了在37℃贮存的液体细胞之外，接受所有冷冻制品和液体细菌处理的水族箱均示出硝酸盐浓度的持续上升倾向。

[0258] 这个试验的结果表明本发明的NOB的冷冻制品在冷冻贮存5个月后仍保持其将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的能力。这个试验的结果还表明本发明的NOB的最佳冷冻贮存温度是-80℃，但是-20℃和-15℃也是良好的贮存温度。

[0259] 上文的描述阐述了本发明的特殊实施方案，但本领域技术人员显而易见在不偏离本发明精神的前提下可以对本发明进行许多修改。所附权利要求书涵盖了这种在本发明的真正精神和范围内的修改。因此本文公开的实施方案在任何方面都应理解为只是说明本发明而无限制之意，本发明的范围由所附权利要求书指定而非限于前文所描述。在权利要求书的等价含义和范围内的所有变化均涵盖在本发明内。