从脂肪族α，ω－二腈中制备内酰胺

1.发明领域

本发明涉及一种通过生物学和化学的结合技术从脂肪族α，ω-二 腈中制备五元或六元环内酰胺的方法。更具体而言，使用一种具有脂 肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性或者有腈水合酶(EC 4.2.1.84)和 酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的结合的催化剂在水溶液中首先把脂肪族 α，ω-二腈转变成ω-腈基羧酸的铵盐。然后，不分离中间体ω-腈基 羧酸或ω-氨基羧酸，直接在水溶液中通过氢化作用把ω-腈基羧酸转 化成相应的内酰胺。当脂肪族α，ω-二腈在α-碳原子位也被不对称地 取代时，由于ω-腈基的水解作用具有98％以上的区域选择性，腈水 解酶产生了ω-腈基羧酸铵盐，因而在后续的氢化作用中仅产生了两种 可能的内酰胺产物的一种。

2.相关领域描述

通过各种化学方法，将腈容易地转化成相应的羧酸，但这些方法 一般需要强酸或强碱的反应条件及很高的反应温度，且通常产生非所 需的副产物和/或大量的作为非所需副产物的无机盐。酶催化的水解作 用把腈底物转化成相应的羧酸的方法通常优于化学法，这是因为这些 方法经常在环境温度下进行，不需要使用强酸或强碱的反应条件，以 及不产生大量的非所需副产物。腈的酶催化水解作用优于化学水解作 用的另外一个优点是：对各种脂肪族二腈或芳香族二腈而言，酶催化 的反应可以是高度的区域选择性的，其中仅两个腈基之一个被水解成 相应的羧酸铵盐。

在水溶液中，腈水解酶直接把腈转化成相应的羧酸铵盐而不形成 酰胺中间体。用芳香族腈水解酶把芳香族腈水解成相应的羧酸铵盐的 方法已使用了许多年，但仅是最近才报道使用脂肪族腈水解酶。 Kobayashi等(《四面体》(1990)，第46卷，5587-5590；《细菌 学杂志》，(1990)，第172卷，4807-4815)描述了一种分离自紫红 红球菌K22株的脂肪族腈水解酶，该酶把脂肪族腈催化水解为相应的 羧酸铵盐；几种脂肪族α，ω-二腈也被水解，用静止细胞作催化剂， 以100％的摩尔转化率将戊二腈转变成4-氰基丁酸铵盐。从睾丸酮丛 毛单胞菌 分离到一种腈水解酶，该酶能把一系列脂肪族α，ω-二腈转化成相应的 ω-腈基羧酸铵盐或二羧酸二铵盐(加拿大专利申请号CA 2,103,616 (1994/02/11)；S.Lévy-Schil等，《基因》，(1995)，第161 卷，15-20)；水解己二腈在把5-氰基戊酸铵盐完全转变成己二酸 二铵盐前所获得的5-氰基戊酸铵盐的最大产量约为88％。

M.L.Gradley和C.J.Knowles(《生物技术通讯》，(1994)， 第16卷，41-46)报道应用具有脂肪族腈水解酶活性的紫红红球菌 NCIMB 11216的悬浮液水解几种2-甲基烷基腈。得到了把(+/-)- 2-甲基丁基腈完全转变成2-甲基丁酸铵盐的结果，而(+/-)-2 -甲基己烷腈的水解似乎是对(+)对映体的对映结构特异性。C.Bengis -Garber和A.L.Gutman(《微生物学生物技术应用》，(1989)， 第32卷，11-16)使用紫红红球菌NCIMB 11216作为催化剂水解几 种二腈。在该项工作中，将富马腈和琥珀腈转化成相应的ω-腈基羧酸 铵盐，而将戊二腈、己二腈和庚二酰腈转化成相应的二羧酸二铵盐。

联合使用腈水合酶(NHase)和酰胺酶这两种酶也能在水溶液中把 脂肪族腈转变成相应的羧酸铵盐。此反应最初由腈水合酶把脂肪族腈转 化成酰胺，然后由酰胺酶接着把酰胺转变成相应的羧酸铵盐。已知大量 的细菌种属拥有不同的腈水合酶和酰胺酶活性谱，其中包括红球菌属、 假单胞菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、杆菌属、短杆菌属、 棒状杆菌属和微球菌属。己将这些微生物的水悬液和所分离到的酶用于 把腈转化成酰胺和羧酸铵盐。

P.Honicke-Schmidt和M.P.Schneider(化学协会杂志《化学通 讯》(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.)(1990)，648-650)用固 定化的红球菌属种CH 5株分别把腈和二腈转化成羧酸铵盐和ω-腈基 羧酸铵盐。这些细胞含有腈水合酶和酰胺酶活性，把戊二腈转变成4- 氰基丁酸铵盐，以92％的底物转化率为基础则有79％的分离产量。A.J. Blakely等(《FEMS微生物学通讯》(1995)，第129卷，57-62) 用红球菌属AJ 270悬液的腈水合酶和酰胺酶活性区域特异地水解丙二腈 和己二腈，仅产生相应的ω-腈基羧酸铵盐。H.Yamada等(《发酵技 术杂志》(1980)，第58卷，495-500)描述用含有腈水合酶和酰 胺酶的假单胞菌属种K9把戊二腈水解成4-氰基丁酰胺、4-氰基丁 酸、戊二酸和氨的混合物。K.Yamamoto等(《发酵生物工程杂志》， 1992，第73卷，125-129)描述使用含有腈水合酶和酰胺酶活性的棒 状杆菌属种CH5细胞把反式1，4-二氰环己烷转变成反式-4-氰基环 己烷羧酸铵盐，产量为99.4％。

J.L.Moreau等(《生物催化》，(1994)，第10卷，325-340) 描述应用短杆菌属种R 312(腈水合酶和酰胺酶活性)、通过形成5- 氰基戊酸中间体，把己二腈水解成己二酸、己二酰二胺和己二酰胺酸 (adipamic acid)。A.Kerridge等(《生物区域选择性药物化学》 (Biorg.Medicinal Chem)(1994)，第2卷，447-455)报道使 用短杆菌属种R 312(腈水合酶和酰胺酶活性)，把前手性-3-羟基 戊二腈衍生物水解成相应的(S)-氰酸铵盐。欧洲专利178,106 B1 (1993年3月31日)公开了如下方法：使用来源于芽胞杆菌属、杆菌 属、微球菌属或短杆菌属的单腈水解酶活性(定义为腈水解酶或腈水合 酶/酰胺酶的组合)，把脂肪族二腈的氰基之一个选择性地转化成相应的 羧酸、酰胺、酯或硫酯。除了具有腈水解酶活性或腈水合酶/酰胺酶活性 的细菌催化剂的许多实施例外，Y.Asano等(《农业生物化学》， (1980)，第44卷，2497-2498)阐述了真菌节状镰孢TG-1把 戊二腈水解成4-氰基丁酸铵盐以及把2-甲基戊二腈水解成4-氰基 戊酸铵盐。

没有发现现有技术描述在水溶液中脂肪族ω-腈基羧酸铵盐的氢化 作用直接产生相应的内酰胺。接近的相关技术是美国专利4,329,498描 述用2号Raney镍催化剂、在用氨饱和的无水乙醇溶液中粘康酸单腈的 氢化形成6-氨基己酸(6-ACA)。除去氢化作用的催化剂后，把6 -ACA乙醇溶液加热到170℃-200℃可预期6-ACA环化形成己内 酰胺。已报道用Raney镍作催化剂，在1N的氢氧化钠溶液中，通过氢 化作用把β-喹喔啉基丙酸(E.C.Taylor等，《美国化学学会杂志》， (1965)，第87卷，1984-1990)或相关的2-(2-羧乙基)-3 (4H)-喹喔酮(E.C.Taylor等，《美国化学学会杂志》，(1965)， 第87卷，1990-1995)还原性环化产生相应的五元环内酰胺，只不过 从产物混合物中除去催化剂和酸化产生的滤液之后进行。作者声明对任 何的这些还原作用，“内酰胺的形成只能在酸性溶液中进行”(1992页， 第二段)，可能需要质子化的羧酸而不是羧酸盐的存在。美国专利4,730, 040公开了一种制备己内酰胺的方法，该方法是在氢化作用催化剂存在 下，把5-甲酰戊酸的水溶液和氨及氢反应，然后把氨从产物混合物中 分离，并把产生的6-ACA溶液加热到300℃。

以前的工作已公开了已将含腈水合酶和酰胺酶活性的单细胞用于把 腈和二腈转化成不同的酸性铵盐。可是，没有发现现有技术描述在本发 明的氢化反应条件下(即在加过量的氢氧化铵水溶液中)，把脂肪族ω -氨基羧酸铵盐环化成相应的内酰胺。接近的相关技术已有报道，在各 种反应条件下，把脂肪族ω-氨基羧酸(但不是铵盐)环化成相应的内 酰胺。F.Mares和D.Sheehan(《化学工业工程学设计开发》(Ind.Eng. Chem.Process Des.Dev.)(1978)，第17卷，9-16)描述了用水 或乙醇作溶剂，把6-氨基己酸(6-ACA)环化成己内酰胺的方法。 在水中，低于1mol/kg(约1M)的浓度下环化反应是可逆的，且己内 酰胺的浓度随着温度的增加而增加；在0.85mol/kg(约0.85M)的6- ACA和己内酰胺总浓度下，据报道己内酰胺的百分率从在180℃下的 38.7％增加到在250℃下的92.2％。在乙醇中，200℃时可获得的己内 酰胺产量为98％，该报道认为这是由于反应移向有利于乙醇中6-ACA 游离酸/游离胺形式的平衡，而不是在水中占优势的6-ACA分子内烷 基铵羧酸盐的形式。从6-ACA中产生己内酰胺的方法已在美国专利4, 599,199中描述，其中将6-ACA在290℃～400℃的蒸汽存在下加到 流化的氧化铝床中。在甲苯中的氧化铝或硅胶上通过脂肪族ω-氨基酸 环化脱水合成五、六和七元环内酰胺、同时不断除去反应中所产生的水 的方法，己由A.Bladé-Font(《四面体通讯》，(1980)，第21卷， 2443-2446)报道。据报道游离氨基(非质子化的)对环化脱水的发生 是必需的。

没有发现现有技术描述在含甲胺的水溶液中，脂肪族ω-腈基羧酸 铵盐的氢化作用直接产生相应的N-甲基内酰胺。接近的相关技术为用 Raney镍催化剂、在140℃，1000-2000psig的氢气下、在水中通过 乙酰丙酸和甲胺水溶液的氢化作用制备1，5-二甲基-2-吡咯烷酮 (pyrrolidinone)(R.L.Frank等，《有机合成》，(1954)，Coll. 第3卷，328-329)。然后由过滤产物混合物和蒸馏滤液以除去水和 甲胺而将所产生的4-N-甲基氨基戊酸甲铵盐环化成相应的内酰胺。 N-烷基内酰胺也可通过含2-甲基戊二腈、伯烷基胺和氢化催化剂的 水混合液的直接氢化作用产生，该方法产生1，3和1，5二烷基哌啶酮-2 的混合物(美国专利5,449,780)。N-取代的2-吡咯烷酮 (pyrrolidinones)可由如下方法制取：把γ-戊内脂和烷基胺在110- 130℃反应，然后加热生成混合物至250-270℃，同时蒸馏去水(F.B. Zienty和G.W.Steahly，《美国化学学会杂志》，(1947)，第69卷， 715-716)。

产生内酰胺或N-烷基内酰胺的上述方法受如下一种或多种缺点所 妨碍使用：当用水作溶剂时为获得高产量的内酰胺所用的温度超过250 ℃；为推动平衡移向内酰胺形成，需从反应混合物中除去水，调整反应 混合物的pH到酸性值，以利于内酰胺的形成；或者使用有机溶剂，其 中起始原料罕有可溶的。许多这些方法产生不需要的废流，或产物混合 物不易分离。有意义的进展将是如下的方法：在水溶液中把脂肪族α，ω -二腈转变成相应的内酰胺或N-甲基内酰胺，产量高，具有高度区域 选择性，几乎不产生副产物或废流，以及容易的回收产物的方法。

                         发明概述

一种从脂肪族α，ω-二腈中制备五元环内酰胺或六元环内酰胺的方 法，具有如下步骤：

(a)把在水溶液反应混合物中的脂肪族α，ω-二腈与一种酶催化 剂接触，该催化剂的特征为

(1)脂肪族腈水解酶活性，或者

(2)腈水合酶和酰胺酶活性的组合

借此，脂肪族α，ω-二腈被转化成α，ω-腈基羧酸铵盐；

(b)把从步骤(a)生成的含水产物混合物与氢和氢化作用催化 剂接触，由此将ω-腈基羧酸铵盐直接转变成相应的内酰胺，而不用分 离中间体ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸铵盐、铵盐、ω-氨基羧酸或ω -氨基羧酸铵盐；

(c)从步骤(b)生成的含水产物混合物中回收内酰胺。

在步骤(b)前，可将氢氧化铵、氨气或甲胺添加到步骤(a)的 含水产物混合物中。该添加量是相应于存在的ω-腈基羧酸铵盐的量的 0～4摩尔当量。

本发明的进一步实施例方案使用具有通式NCCXa(R)(CH2)nCN的脂 肪族α，ω-二腈，其中a＝0或1，当a＝1且R＝H、非取代或取代 的烷基、或非取代或取代的链烯基、或非取代或取代的亚烷基，且其中n ＝1或2时X＝氢。

本发明的进一步实施例方案是一种处理完整细胞催化剂从选择区域 选择性的腈水解酶活性或腈水合酶活性，能催化脂肪族α，ω-二腈转变 成相应的ω-氰基羧酸铵盐的方法。所处理的完整细胞催化剂的特征为 两种类型的活性：(1)合乎需要的区域选择性腈水解酶活性或区域选 择性的腈水合酶活性，和(2)不合乎需要的非区域选择性的腈水解酶 或腈水合酶活性。处理细胞的方法包括加热完整细胞催化剂到约35℃～ 70℃的温度，时间为10～120分钟，其中将不合乎需要的非区域选择性 的腈水解酶活性或腈水合酶活性破坏，而将合乎需要的区域选择性的腈 水解酶或腈水合酶活性保留。

本发明的进一步实施例方案是使用酶催化剂，这些催化剂的形式为 完整的微生物细胞、通透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或 多种细胞组分、以及部分纯化的酶或纯化的酶。将这些酶催化剂固定在 支持物上。具有脂肪族腈水解酶活性特征和用于本方法的微生物为敏捷 食酸菌(Acidovorax facilis)72-PE-15(ATCC 55747)、敏捷 食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)。以腈水合酶和酰胺酶活性的组合为特征且能在本方法中应用的 微生物是睾丸酮丛毛单胞菌(Comomonas testosteroni)5-MGAM -4D(ATCC 55744)。

进一步的实施例方案是一种从脂肪族α，ω-二腈中制备五元环内酰 胺或六元环内酰胺的方法，包括：

(a)和如下通式I或II的脂肪族α，ω-二腈接触：

或

其中R1和R2是H，且R3、R4、R5和R6独自选自H、非取代或 取代的烷基，或非取代或取代的链烯基、在含水反应混合液中含的酶催 化剂选自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)、敏捷食酸菌72-PF- 15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和 睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)，由此将脂肪族 α，ω-二腈转化成ω-腈基羧酸铵盐；

b)把步骤(a)中生成的含水产物混合物和氢及氢化作用催化剂 接触，由此将ω-腈基羧酸铵盐直接转化成相应的内酰胺，而不用分离 中间体ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸铵盐、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸 铵盐；和

c)从步骤(b)生成的含水产物混合物中回收内酰胺。

进一步的实施例方案是一种从脂肪族α，ω-二腈制备五元环内酰胺 或六元环内酰胺的方法，包括：

(a)把如下通式I或II的脂肪族α，ω-二腈在水反应混合液中与 睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)接触；

或

其中R7、R8、R9、R10、R11和R12独自选自H、非取代或取 代的烷基，或非取代或取代的链烯基，其中任一个或二个R7或R8不是 H；由此将脂肪族α，ω-二腈转变成ω-腈基羧酸铵盐；

(b)把在步骤(a)生成的含水产物混合物与氢和氢化作用催化 剂接触，由此将ω-腈基羧酸铵盐直接转变成相应的内酰胺，而不用分 离中间体ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸铵盐、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧 酸铵盐；和

(c)从步骤(b)生成的含水产物混合物中回收内酰胺。

最后，提供新型的化合物如下：

    通式III的化合物

其中M+是H+或者是NH4 +P

通式IV的化合物

其中M+是H+或者是NH4 +。

                    生物学保藏简述

根据Budapest条约中的条款，申请者已进行了如下的生物学保藏：

保藏者鉴定参考               国际保藏部保藏号         保藏日期

睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D    ATCC 55744               1996年3月8日

敏捷食酸菌72-PF-17           ATCC 55745               1996年3月8日

敏捷食酸菌72W                ATCC 55746               1996年3月8日

敏捷食酸菌72-PF-15           ATCC 55747               1996年3月8日

在此所用的“ATCC”指的是美国典型培养物保藏中心，国际保藏 部，位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，美国。“ATCC No.”是ATCC保藏培养物的登记号。

                        发明详述

开发了一种从脂肪族α，ω-二腈中高产量地制备内酰胺的方法，该 法利用酶和化学反应的组合。假如α，ω-二腈被不对称地取代，就能观 察到对两种可能的内酰胺产物(图1)之一种的高度区域选择性。。

图1

其中a＝0或1；

X＝氢，当a＝1时；

n＝1或2

R＝H，非取代或取代的烷基、或非取代或取代的链烯基、或 非取代或取代的亚烷基；

R1＝H，-CH3

本发明的产物在农业和药物工业中能用作高价值的聚合物、溶剂和 化学品的前体。当用水作溶剂时，本方法使用低于250℃的温度，获得 了高产量的内酰胺。相应于以前众所周知的生产内酰胺的化学法，要求 权利保护的本发明几乎不产生废物，并允许用容易的方法回收产物。

在本申请中，除非在别处具体说明，使用下列缩写和定义：

“酶催化剂”指的是特征为腈水解酶活性或腈水合酶活性和酰胺酶 活性组合的催化剂。该催化剂可能的形式为完整的微生物细胞、通透化 的微生物细胞、一种或多种微生物细胞提取物的细胞组分、部分纯化的 酶或纯化的酶。

“氢化作用催化剂”指的是能加速氢化作用而其本身不被消耗或不 发生化学变化的物质。

“含水产物混合物”被用于指含有从相应的方法步骤所生成的含水 产物混合物。

A.高产量及高度区域选择性地把脂肪族α，ω-二腈转化成相应的ω -腈基羧酸铵盐。

本方法的第一步是用酶催化剂，把脂肪族α，ω-二腈转化相应的ω -腈基羧酸铵盐。酶催化剂要么具有腈水解酶活性，要么具有两种酶腈 水合酶(NHase)和酰胺酶活性的组合，其中前者是腈水解酶把α，ω- 二腈直接转化成相应的ω-腈基羧酸铵盐(反应式1)；而后者是由腈 水合酶起始把脂肪族α，ω-二腈转变成ω-腈烷基酰胺，然后由酰胺酶 接着把ω-腈烷基酰胺转变成相应的ω-腈基羧酸铵盐(反应式2)：

从暴露在脂肪族腈或脂肪族二腈的土壤样品中分离得到新型的微生 物敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，它能利用2-乙基琥珀腈作为氮 源。当使用微生物的完整细胞催化剂水解不对称取代的2-烷基-α，ω -二腈、例如2-甲基戊二腈(2-MGN)或2-乙基琥珀腈时，得 到产物混合物。在水解反应整个过程中，除了所需的ω-腈基羧酸外， 产生了相应的二羧酸单酰胺和二羧酸。已发现在合适的缓冲液中，50℃ 下短时间加热敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的悬液可失活完整细胞 催化剂的不合乎需要的腈水合酶活性，该水合酶催化剂可催化产生不合 乎需要的二羧酸单酰胺(进一步由酰胺酶转变成相应的二羧酸)。用这 种方法，制备的完整细胞催化剂含有腈水解酶活性，由于ω-腈基的水 解，腈水解酶把2-烷基-α，ω-二腈仅转变成ω-腈基羧酸铵盐。

热处理敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的悬液50℃下1小时所 产生的微生物完整细胞催化剂，能把2-甲基戊二腈(2-MGN)水 解成4-氰基戊酸(4-CPA)铵盐，把2-亚甲基戊二腈(2- MEGN)水解成4-氰基-4-戊酸(4-CPEA)铵盐，或者把2- 乙基琥珀腈(2-ESN)水解成3-氰基戊酸(3-CPA)铵盐，水 解作用具有极为高度的区域选择性，如在完全转化二腈时，通过腈基的 水解作用至少产生98％产量的ω-腈基羧酸铵盐(表1)：

                           表1

α，ω-二腈     ω-腈/酸铵盐      浓度(M)      产量(％)

2-MGN           4-CPA(NH4 +)     0.10         99.3

″              ″                0.40         99.4

″              ″                1.00         99.4

″              ″                1.85         98.8

″              ″                2.00         98.9

2-MEGN          4-CPEA(NH4 +)    1.25         100

″              ″                2.00         100

 2-ESN          3-CPA(NH4 +)     0.10         100

″              ″                0.40         100

″              ″                1.00         100

″              ″                1.25         100

目前还没有非酶学方法能仅把脂肪族二腈的一个腈基选择性地水解 成酰胺基或羧酸基而完全转化二腈。如果为了获得对单酰胺或单酸水解 产物的高度选择性而上述的反应以不完全转化(转化率＜20％)的方式 进行，那么就需要分离步骤，把产物从未反应的二腈中分离出来，在后 续的反应中重新循环二腈。典型的非酶促水解反应包括在提高温度下加 热腈或二腈溶液，常常需要存在强酸或强碱，而上述的酶催化反应在环 境温度下的水溶液及中性pH中进行，不用添加酸或碱。

已经制备了两种敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的突变株，它们 仅产生非常低水平的不合需要的腈水合酶活性，该腈水合酶导致不合需 要的副产物形成。这些突变株、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)在用作催化剂前 不需要热处理细胞就能把脂肪族α，ω-二腈水解成相应的ω-腈基羧酸 铵盐。通过用未处理和热处理的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)和未 处理的敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)突变株水解2-MGN 而产生4-CPA和2-甲基戊二酸(2-MGA)的产量比较，在表2 中显示：

                              表2

                              [2-MGN]      4-CPA         2-MGA

催化剂                        (M)          (％产量)      (％产量)

敏捷食酸菌72W，未处理         0.10         62.7          34.6

敏捷食酸菌72W，热处理         0.10         99.3          0.7

敏捷食酸菌72-PF-15，未处理    0.10         96.8          3.6

敏捷食酸菌72W，热处理         0.40         99.4          0.6

敏捷食酸菌72-PF-15，未处理    0.40         98.8          1.2

敏捷食酸菌72W，热处理         1.00         98.7          1.3

敏捷食酸菌72-PF-15，未处理    1.00         99.2          0.8

当用热处理过的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)作催化剂水解非 取代的α，ω-二腈琥珀腈(SCN，1.25M)或戊二腈(GLN，1.5M) 的水溶液时，产生了相应的ω-腈基羧酸铵盐3-氰基丙酸(3- CPRA)和4-氰基丁酸(4-CBA)，产量分别为99.7％和92.3％， 相应的二羧酸是唯一观察到的副产物。当将该相同的催化剂用于把己二 腈(ADN)转化成5-氰基戊酸(5-CPA)铵盐时，己二酸(ADA) 二铵盐是主要产物(产量＞50％)。敏捷食酸菌72W(ATCC 55746) 及敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)均不适用于作高产量地制 备5-CPA铵盐的催化剂。

将从暴露于脂肪族腈或脂肪族二腈的土壤样品中分离并能以不同的 腈或酰胺作氮源生长的30多种不同的微生物培养物用于高选择性地产 生5-CPA的筛选。分离到了第二种新型微生物睾丸酮丝毛单胞菌5- MGAM-4D(ATCC 55744)(用2-甲基戊二酰胺 (methylglutaranide)作氮源)，该菌含有几种腈水合酶和酰胺酶活性。 当用完整细胞催化剂水解ADN时，生成的产物混合物主要由ADA二铵 盐、己二酰二胺(ADAM)和己二酰胺酸(adipamic acid)(ADMA) 组成，仅观察到微量的5-CPA铵盐。再次发现50℃下短时间加热此 种微生物可较大程度地失活不合需要的腈水合酶活性，使该微生物催化 剂保留下把ADN转化成5-氰基戊酰胺的腈水合酶活性和把5-氰基戊 酰胺转变成5-CPA铵盐的酰胺酶活性。热处理睾丸酮丛毛单胞菌5- MGAM-4D 50℃1小时形成一种微生物细胞催化剂，该催化剂产生5 -CPA，产量高达97％，完全转化ADN。

通过热处理消除不需要的腈水合酶而同时留下相对热稳定的腈水解 酶活性或腈水合酶活性以把二腈转变成氰酸，这种可能性以前未被人知 晓，也不可能预测，因为腈水解酶或腈水合酶的温度稳定性是未知的。 可以预期在35℃～70℃温度下热处理10～120分钟将产生所述的有用 效应。

B.五或六元环内酰胺的制备

已经发现一种方法，可高产量地制备五元环或六元环内酰胺，该法 把在水溶液中酶催化水解脂肪族α，ω-二腈产生的ω-腈羧酸铵盐产物 混合物直接氢化而实现。在氢化作用步骤前，这种方法不需要从水解反 应的产物混合物中分离ω-腈羧酸铵盐，也不需要在氢化作用前把ω- 腈羧酸铵盐转变成游离酸(例如，4-CPA铵盐转变成4-CPA)， 或者不需要从氢化作用产物混合物中分离生成的ω-氨基羧酸铵盐和环 化前把铵盐转化成游离羧酸。

用酶催化剂从脂肪族α，ω-二腈中生产含ω-腈基羧酸铵盐的含水 产物混合物后(反应式3)，移去酶催化剂，在合适的氢化作用催化剂 存在下把生成的水溶液和氢及加有化学计量学上过量的氨(如氢氧化 铵)反应，可预期产生含有脂肪族ω-氨基羧酸铵盐的水溶液(反应式 4)：

有必要在腈氢化成相应的胺的过程中使用过量的氨，从而通过产物ω -氨基羧酸限制亚氨中间体(在腈基氢化成胺的过程中产生)的还原性 烷基化，这种烷基化导致形成二聚体并丧失产量。这种技术已有文献详 细描述(De Bellefon等，《英国科学回顾目录》(Catal.Rev.Sci.Eng) (1994)，第36卷，459～506)并由腈氢化作用领域的技术人员普 遍使用。

依据现有技术，可以预期必须将由ω-腈基羧酸铵盐氢化作用产生 的ω-氨基羧酸铵盐在可进行热诱导的环化反应以产生所需的内酰胺前 (反应式6)转变成游离酸并加以分离(反应式5)。根据Mares等的 报道(同上)，在水中浓度低于1.0mol/kg(约1.0M)时，6-氨基己 酸(6-ACA)(反应式6，n＝3，R＝H)和己内酰胺以可逆的 平衡混合物存在，己内酰胺的浓度随着温度的增加而增加。在0.85mol/kg (约0.85M)的6-ACA和己内酰胺总浓度下，据Mares等报道：己 内酰胺的百分比从180℃时的18.7％增加到250℃时的92.2％。

在这种情况下，尽管存在所加的过量的氨(如氢氧化铵)和反应混 合物的pH为9～10，但是不能认为6-ACA铵盐在氢化作用温度低 于200℃时会环化产生明显数量的己内酰胺。6-氨基己酸的羧酸基和 质子化的胺基的pKa′值分别为4.373和10.804(Lange′s化学手册，J. A.Dean，主编，第14版，(1992)，McGraw-Hill，NY.p8.22 (如6-氨基己酸))，NH4 +的pKa为9.25。在反应混合物pH为9- 10时，能计算出至少99.97％的6-ACA在溶液中以羧酸铵盐存在，此 外，大约一半的6-氨基己酸铵盐的胺基也被质子化。因此，不能认为 在本发明的氢化作用条件下，显著量的6-ACA铵盐会环化产生己内酰 胺，其中在反应式(7)中表示的从环化反应中间物中取代氢阴离子 (-OH)是不利的：

当5-CPA铵盐(通过酶水解ADN制备)水溶液的氢化作用在0M～ 2.0M NH4OH存在下、温度70℃～160℃进行时，可观察到5-CPA 完全转变成6-ACA铵盐，几乎不形成副产物，正如预期的那样，得到 的己内酰胺(生成七元环的内酰胺)的产量小于3％(表3)：

                             表3

温度    5-CPA铵盐    [NH4OH]   时间    5-CPA转化    己内酰胺

(℃)    (M)          (M)        (h)     率(％)       (％)

70      1.0          0          2       100          0.7

70      1.0          1.0        2       100          0.7

70      1.0          1.5        2       94           0.8

70      1.0          2.0        2       84           0.8

120     1.0          0          2       99           0.9

120     1.0          1.0        2       100          0.9

120     1.0          1.5        2       97           1.0

120     1.0          2.0        2       97           1.1

160     1.0          0          2       97           2.5

160     1.0          1.0        2       84           2.3

160     1.0          1.5        2       97           3.0

160     1.0          2.0        2       95           2.7

在与由酶水解ADN制备5-CPA铵盐的氢化作用相同的氢化反应 条件下，当处理通过混合真正的6-ACA和氢氧化铵制备的水溶液时， 也可得到小于3％产量的己内酰胺。在70℃下，5-CPA铵盐的氢化 作用制备的水溶液中，环化6-ACA铵盐在高于200℃的温度时可设法 实现，该法首先除去氢化作用催化剂，然后在280℃时加热约1.0M 6 -ACA铵盐产物混合物2小时即可。产生的己内酰胺的量小于18％(表 4)。这些结果说明：在过量的氨存在下，通过5-CPA铵盐水溶液的 直接氢化作用只能获得非常低产量的己内酰胺。根据6-ACA铵盐进行 环化反应的不可预测性，尤其是存在过量的氢氧化铵时，这种结果是可 预期的。

                     表4

温度    6-ACA铵盐    [NH4OH]   时间    己内酰胺

(℃)    (M)          (M)        (h)     (％)

280     1.0          0          2       17.8

280     1.0          1.0        2       17.2

280     1.0          1.5        2       11.0

280     1.0          2.0        2       9.0

280     1.0          2.5        2       3.1

也可预期当3-氰基戊酸(3-CPA)铵盐(由酶水解2-乙基琥 珀腈(2-ESN)制备)或4-氰基戊酸(4-CPA)铵盐(由酶水 解2-甲基戊二腈(2-MGN)制备)在过量的氨存在下70℃～160 ℃氢化时，会产生相应的ω-氨基羧酸铵盐；在进行环化反应成相应的 内酰胺前(如5-CPA铵盐的情况)，这些盐类必须作游离酸予以分离。 虽然羧酸的pKa值和产物4-氨基-3-乙基丁酸或5-氨基-4-甲 基戊酸的质子化胺的机能没有报道，但是有充分理由设想这些pKa与6 -ACA异构体的pKa相似。

未曾预料到的是，在Raney镍和过量的铵存在下，在pH9～10、 温度70℃-180℃时，把3-CPA铵盐(由酶水解2-ESN产生)的 水溶液氢化作用2小时，直接产生相应的4-乙基吡咯烷-2-酮内酰 胺(4-EPRD)产量达91％(表5)。4-EPRD的产量也随所添 加的氢氧化铵(除了已经作为羧酸铵盐存在的铵离子浓度外添加)的浓 度的增加而增加，这表明为了限制众所周知的产生二聚体和聚合物的还 原性烷基化反应，需要添加氨进行单腈酸铵盐的水溶液的氢化作用(表 6)。

                                 表5

温度    3-CPA铵盐    [NH4OH]   重量％    时间    3-CPA         4-EPRD

(℃)    (M)          (M)        Raney Ni  (h)     (％转化率)    (％产量)

70      1.0          2.0        5         2       7             1.5

120     1.0          2.0        5         2       55            22.7

140     1.0          2.0        5         2       71            55.4

140     1.0          2.0        10        2       100           89.9

160     1.0          2.0        5         2       100           90.1

160     1.0          2.0        10        2       100           91.3

180     1.0          2.0        5         2       100           86.1

180     1.0          2.0        10        2       100           90.0

                                 表6

温度    3-CPA铵盐    [NH4OH]   重量％    时间    3-CPA         4-EPRD

(℃)    (M)          (M)        Raney Ni  (h)     (％转化率)    (％产量)

160     1.0          0          5          2      99            80.1

160     1.0          1.0        5          2      99            87.6

160     1.0          2.0        5          2      100           90.1

160     1.0          3.0        5          2      100           85.4

180     1.0          0          5          2      100           75.1

180     1.0          1.0        5          2      100           85.8

180     1.0          2.0        5          2      100           88.5

180     1.0          3.0        5          2      100           90.0

在Raney镍和过量的氨存在下，在pH9～10、160℃时把4-CPA 铵盐(由酶水解2-MGN制备)的水溶液氢化作用2小时，直接产生 相应的5-甲基-2-哌啶酮内酰胺(5-MPPD)，产量高达96％ (表7)：

                                 表7

温度    4-CPA铵盐    [NH4OH]   重量％    时间    4-CPA       5-MPPD

(℃)    (M)          (M)        Raney Ni  (h)     (％转化率)  (％产量)

160     1.0          0          5         2       100         85.6

160     1.0          2.0        5         3       100         96.4

180     1.0          2.0        5         2       100         91.4

180     1.0          3.0        5         2       100         89.5

3-氰基丙酸(3-CPRA)或4-氰基丁酸(4-CBA)铵盐(由 酶水解相应的α，ω-二腈产生)的水溶液的氢化作用分别产生相应的2 -吡咯烷酮(pyrrolidinone)内酰胺和2-哌啶酮内酰胺，产量分别为 91.0％和93.5％。4-氰基-4-戊烯酸(4-CPEA)铵盐(由酶水 解2-亚甲基戊二腈产生)的水溶液的氢化作用产生腈和碳-碳双键的 氢化作用而产生5-甲基-2-哌啶酮，产量达85％。

为限制腈氢化成胺过程中的还原性烷基化而加过量的氨(如氢氧化 铵)到氢化反应中，也能发生几种形成副产物的另外反应(De Bellefon 等，《英国科学回顾目录》(Catal.Rev.Sci.Eng.)，(1994)，第36 卷，459-506)。从腈制备酰胺或羧酸的普通方法是在酸或碱催化剂 存在下加热腈混合水溶液，该方法在本领域的技术人员中众所周知。因 此，在本发明所用的氢化作用条件下，可预期的单腈羧酸铵盐的竞争反 应会是腈基的碱催化水解，而产生二羧酸单酰胺铵盐或二羧酸二铵盐。 在氢化反应过程中产生了这些不需要的酰胺/酸和二羧酸铵盐副产物，但 是与内酰胺的产量相比较，它们的产量非常低。

在存在的过量氨和产物内酰胺之间的第二个形成副产物的反应可能 产生内酰胺和预期的氨解产物即ω-氨基羧酰胺的平衡混合物。在本反 应条件下得到高产量的五元和六元环内酰胺表明内酰胺产物的氨解作用 (或碱催化水解)不明显。

除了从脂肪族α，ω-二腈中产生内酰胺外，在4-CPA或3-CPA 铵盐水溶液的氢化作用中，通过甲胺对氨的取代反应制备N-甲基-内 酰胺。将1～4当量的甲胺(质子化胺的pKa为10.62)加到含有1当 量铵离子(pKa 9.25)的4-CPA水溶液中预计产生明显数量的游离 氨(由于在水中质子化甲胺和铵离子的pKa相对差异)。然后这种游离 氨与参与在腈基的氢化作用过程中产生的中间体亚胺反应的非质子化甲 胺竞争，导致产生分别为5-氨基-4-甲基戊酸铵盐和5-N-甲基 氨基-4-甲基戊酸铵盐的混合物，结果环化分别产生5-MPPD和1， 5-二甲基-2-哌啶酮(1，5 DMPD)。

已发现由1.0M  4-CPA铵盐水溶液氢化作用产生的5-MPPD 和1，5-DMPD的相对产量依赖于所选用的催化剂。Raney镍和氢化铝 上的钌分别产生作为主要的内酰胺产物的5-MPPD，甚至在3.0M甲 胺存在下也是如此，而在相同的甲胺浓度下用5％Pd/C或4.5％Pd/0.5％ Pt/C作催化剂时，1，5-DMPD是主要的产物。当用5％Pd/C作催化 剂时，1，5-DMPD的产量随着甲胺浓度的增加而增加(表8)。

用Pd/C催化剂在140℃下，在1.0M 3-CPA铵盐水溶液氢化作 用中，2.0M甲胺对氨的取代分别产生了4-乙基-1-甲基吡咯烷-2 -酮(4-EMPRD)和4-EPRD，产量分别为69.8％和20.4％，转 化率为96％。

                                       表8

温度   4-CPA(NH4 +)  CH3NH2 催化剂    时间    4-CPA         1，5-DMPD     5-MPPD

(℃)   (M)           (M)                 (h)     (％转化率)    (％转化率)    (％产量)

160    1.0           3.0        Ra-Ni     2       100           19.2          68.5

160    1.0           3.0        RuAl2O32       100           19.0          63.5

140    1.0           3.0        Pd/C      2       99            83.4          0

160    1.0           1.0        Pd/C      2       100           53.5          0

160    1.0           1.25       Pd/C      2       100           68.3          0

160    1.0           1.5        Pd/C      2       100           76.4          0

160    1.0           2.0        Pd/C      2       100           81.5          0

160    1.0           3.0        Pd/C      2       100           81.7          7.8

160    1.0           4.0        Pd/C      2       100           88.4          1.9

180    1.0           3.0        Pd/C      2       97            73.0          6.6

160    1.4           2.3        Pd/Pt/C   2       99            94.0          3.1

               优选的实施例方案描述

方法和材料：

用作制备ω-腈基羧酸的微生物催化剂

分离到了两种微生物用作微生物催化剂以把脂肪族α，ω-二腈转变 成相应的ω-腈基羧酸，这些微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)和睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)。

从在得克萨斯州Orange收集的土壤中分离到了敏捷食酸菌72W (ATCC 55746)。标准的富集步骤用下列培养基进行(E2基础培养基， pH7.2)：

E2基本培养基              g/L

KH2PO                     1.4

NaH2PO4                  0.69

柠檬酸钠                    0.1

CaCl2·2H2O              0.025

KCl                         0.5

NaCl                        1.0

MgSO4·7H2O              0.5

FeSO4·7H2O              0.05

CoCl2·6H2O              0.01

MnCl2·4H2O              0.001

ZnCl2                     0.0005

NaMoO4·2H2O             0.0025

NiCl2·6H2O              0.01

CuSO4·2H2O              0.005

生物素                      0.0002

叶酸                        0.0002

盐酸吡哆醇                  0.001

核黄素                      0.0005

盐酸硫胺素                  0.00005

烟酸                        0.0005

泛酸                        0.0005

维生素B12                  0.00001

对氨基苯甲酸                0.0005

将下列补充物加到E2基础培养基中，以进行上述的富集过程：

菌株                  富集的氮源            其它补充物

敏捷食酸菌72W         0.2％(v/v)乙基琥珀腈  0.3％(v/v)甘油

最初筛选菌株在加浓的腈培养基上根据生长情况和产生的氨进行。 分离体通过重复过BactoBrain Heart Infusion Agar(Difco，Detroit， Michigan)、接着从富集的腈中筛选产生的氨而纯化。纯化的菌株用革 兰氏阴性测试板、在Biolog测试系统(Hayward，CA，美国)上， 根据它们的碳源利用特点加以鉴别。

为测定腈水解活性，将含10g/L葡萄糖的E2基础培养基用于培养敏 捷食酸菌72W。给培养基补加25mM(±)-2-甲基戊二腈。给10ml 体积的补充E2培养基接种0.1ml冷冻贮存培养物。在摇床上以250rpm、 室温(22-25℃)下生长过夜后，将10ml接种物加到在2L培养瓶的 990ml新鲜培养基中。以引起培养基中气泡形成的足够高的速度摇动， 室温下培养细胞过夜。细胞通过离心收集，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)/15％甘油洗涤一次，将浓缩的细胞糊状物立即在干冰上冷冻并贮 存在-65℃下。将10mM己二腈也用在1升发酵液中。经16-20小时 的生长后停止发酵。细胞悬液冷却到4℃，离心收获细胞，用含15％甘 油的0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤一次后，将细胞在-60℃冷 冻。将解冻的细胞糊状物用于检测腈水解活性。所需要的微生物特性是 能区域特异地攻击二腈化合物而不干扰酰胺酶活性的腈水解活性。微生 物容易发生突变。某些突变可能对所需的腈基转变是有利的。因此，甚 至天然菌株的突变株可能用于实现本发明的方法。

将标准富集程序步骤也用于睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D， 该菌用E2基础培养基，pH7.2，将该培养基由上述标准基础培养基的维 生素浓度的十分之一来修饰。下列补充物加到修饰过的E2基础培养基中 以进行富集过程：

菌株                富集氮源          其它补充物

睾丸酮丛毛单胞菌    2-甲基戊二酰胺    甘油(0.6％)

5-MGAM-4D          (MGAM；1.0％w/v)

最初筛选菌株在加浓的腈基酰胺培养基上根据生长的情况进行。用 以上培养基、通过重复过琼脂板而纯化分离物。纯化的菌株根据它们的 碳源利用特点，用革兰氏阴性测试板在Biolog测试系统(Hayward， CA，美国)上进行。

为测定腈水解活性，将含6.0g/L葡萄糖或甘油修饰过的E2基础培养 基用于培养细胞材料。给培养基添加1.0％MGAM。用一个250ml非隔 板式摇动培养瓶，其中含50ml补充过的E2培养基，用0.2ml的冷冻贮 存培养物接种，在摇床上以200rpm速度、在30℃下培养72小时。细胞 通过离心收集，用10ml的20mM KH2PO4(pH7.0)洗涤。在含20mM KH2PO4(pH7.0)和0.1M的甲基戊二腈或甲基戊二酰胺的10ml反应 液中，用HPLC技术从区域特异性水解作用方面筛选细胞。所需的微生 物特性是能区域特异攻击二腈化合物而不干扰酰胺酶活性的腈水解活 性。微生物容易发生突变。某些突变可能对所需的腈基转变是有利的。 因此，甚至天然菌株的突变株可用于实现本发明的方法。

本发明不局限于上面提到的具体生物，而是包括应用保留所需特性 的变异株和其突变株。通过已知的各种方法如X-射线辐射、紫外线辐 射和化学诱变剂，上述变异株和突变株能从亲本菌株中产生。

为产生生物催化剂以阐明方法(实施例1-26)，可用下列培养基。

菌株            培养基

72-PF-15        Lauria-Bertani培养基(Bacto胰化白胨，10g/L

                +Bacto酵母提取物，5g/L+NaCl，10g/L)+0.5％

                (w/v)六水琥珀酸钠

72W             E2+1％(w/v)葡萄糖+0.4％(w/v)己二酰二胺

5-MGAM-4D       E2+1％(w/v)葡萄糖+0.2％(w/v)丙酰胺

为启动生长，给10ml合适的培养基用0.1ml冷冻贮存培养物进行接 种。在28℃、250rpm摇动生长过夜后，将生长细胞悬液转移到在2L 培养瓶中的1L的相同培养基中，28℃下摇动继续生长。然后将1L生 长细胞悬液加到在10L发酵罐中的9L相同培养基中，继续生长。发酵 罐的参数条件是：≥80％氧饱和度、25℃、pH7.2、300-1000rpm。 20～91小时后，将发酵罐冷却到8～12℃，加甘油至终浓度为10％。 细胞材料通过离心收获。将浓缩的糊状细胞立即在干冰上冷冻，到使用 前一直贮存在-70℃。在E2基础培养基中针对细胞生长，用作碳源和 氮源的许多其它补充物在本领域的技术人员中众所周知。可以将这些以 及复杂的营养培养基用于产生生物催化剂。不能认为上面所述的具体培 养基是限制性的。

缺乏腈水合酶活性的敏捷食酸菌72W突变株的筛选

在2-MGN水解成4-CPA过程中，将具有减低产生不合需要的 2-甲基戊二酸副产物能力的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)突变株 以不能利用2-MGN作碳和能源的特点为依据筛选出来。具体而言， 将生长在LB/琥珀酸盐培养基(1％(w/v)Bacto-胰化蛋白胨 (Difco，Detroit，Michigan，美国)，0.5％(w/v)Bacto-酵母提 取物(Difco)，1％(w/v)NaCl，0.5％(w/v)六水琥珀酸钠) 中的敏捷食酸菌72W过夜培养物与100μg/ml诱变剂N-甲基-N′-硝 基-N-亚硝基胍接触约30分钟。这导致培养物中活细胞降低99.9％。 将诱变过的细胞在无菌的1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.2)中离心而洗去 诱变剂。将洗涤过的细胞重新悬浮在LB/琥珀酸盐培养基中并在30℃下 生长过夜。然后，将细胞在无菌的50mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.2)中 离心洗涤，重新悬浮在含0.2％(v/v)2-甲基戊二腈和抗生素环丝氨 酸(0.2mg/ml)哌拉西林(40μg/ml)的E2极限培养基(没有葡萄糖) 中。将细胞在30℃下培养过夜并重新在无菌的50mM磷酸钠盐缓冲液 (pH7.2)中洗涤。将洗涤过的细胞铺展在含非选择培养基的琼脂平板 上，培养基即为E2极限培养基(没有葡萄糖)，添加以0.2％(v/v)2 -甲基戊二腈和0.5％(w/v)六水琥珀酸钠，铺皿的浓度为每平板40 -100个菌落形成单位。将平板在30℃下温育约48h，以使菌落形成。 将形成的菌落影印到含选择培养基：E2极限培养基(没有葡萄糖)添加 0.2％(v/v)2-MGN的琼脂平板上。将平板在30℃下约温育48h， 以使菌落形成。具有所需特性的突变体不能在选择培养基上生长良好。 因此，48h后比较影印过的平板，将显示为仅在非选择培养基上生长的 菌株保存作进一步测定。

从89个平板中检查了共约5，120个菌落，鉴别出了19个具有所需 特性的菌株。这些突变菌株在液体的E2极限培养基(没有葡萄糖)添加 0.2％(v/v)2-MGN中生长以作进一步测定。将显示为在这种培养 基中少量或没有生长的菌株在由E2极限培养基(没有葡萄糖)添加0.2 ％(v/v)2-MGN和0.5％(w/v)六水琥珀酸钠组成的液体培养基 生长过程中，筛选它们产生2-甲基戊二酸的能力。该方法的结果是， 将两种突变株、鉴定为敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏 捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)选为进一步开发利用，因为它 们极大地减少了产生2-甲基戊二酸的能力。

脂肪族α，ω-二腈的水解反应

含脂肪族ω-腈基羧酸铵盐的水溶液通过相应的脂肪族α，ω-二腈 与合适的酶催化剂(在上述A部分确认)水悬液混合而制备。不用任何 预处理，可将完整的微生物细胞用作催化剂。可供选择的方法有，可将 它们固定在聚合物基质(如藻酸盐珠或聚丙烯酰胺凝胶(PAG)颗粒 )中或不溶性的固体支持物(如硅藻土)上，以便于回收和重新利用催 化剂。把细胞固定在聚合物基质中或不溶性固体支持物上的方法已广泛 报道且在本领域的技术人员中众所周知。也可将腈水解酶或者腈水合酶 和酰胺酶从整个细胞中分离并直接用作催化剂，或把酶固定在聚合物基 质中或不溶性的支持物上。这些方法也已广泛报道且在本领域的技术人 员中众所周知。

在本发明中用作起始原料的某些脂肪族α，ω-二腈仅是中度水溶性 的。它们的溶解度也依赖于水相中溶液的温度和盐浓度(缓冲液和/或ω -腈基羧酸铵盐)。例如，将己二腈确定为溶解度的极限约为0.60M(25 ℃，20mM磷酸盐缓冲液，pH7)，在相同的条件下，将2-甲基戊二 腈确定为溶解度的极限约为0.52M。在这种情况下，产生比起始的α，ω -二腈溶解度极限更大浓度的ω-腈基羧酸铵盐的水溶液是使用开始时 包括两相的反应混合物实现的，两相是指含酶催化剂和溶解的α，ω-二 腈的水相和有机相(不溶解的α，ω-二腈)。随着反应进行，二腈溶于 水相中，最后得到了单一相的产物混合物。

在反应混合液中，酶催化剂的浓度依赖于酶催化剂的特殊性催化活 性和选择获得所需的反应速率。用作水解反应催化剂的微生物细胞的湿 细胞重量一般范围为每ml总反应体积0.001克～0.100克湿细胞，优选 的范围是每ml 0.002克～0.050克湿细胞。用已知重量的微生物细胞催 化剂、通过测定25℃下把0.10M二腈底物溶液转变成所需的ω-腈基羧 酸产物的速率来确定微生物细胞的比活性(IU/克湿细胞wt.)。将酶活 性的一个IU(国际单位)定义为每分钟把1微摩尔底物转变成产物所需 要的酶活性的量。

选定的水解反应温度使反应速度和酶催化剂活性稳定性最优化。反 应温度的范围可恰在悬液冷冻点(约0℃)以上至60℃，优选的反应温 度范围为5℃～35℃。微生物细胞催化剂悬液可通过把细胞悬浮在蒸馏 水中来制备，或者通过悬浮在维持反应起始pH5.0～10.0，优选的为 6.0～8.0的缓冲水溶液中来制备。当反应进行时，由于从二腈的相应腈 基功能形成羧酸铵盐，所以反应混合液的pH可能会变化。不用控制pH， 反应能进行到完全转变二腈，或者在整个反应过程中加合适的酸或碱而 维持所需的pH。

在α，ω-二腈完全转变的产物混合物中，脂肪族ω-腈基羧酸铵盐 的最终浓度可从0.001M到脂肪族ω-腈基羧酸铵盐的溶解度极限。从代 表性而言，ω-腈基羧酸铵盐的浓度范围为0.10M～2.0M。酶催化剂 通过离心和/或过滤回收后，可将水解反应的产物混合物直接用于后续的 氢化反应中。通过用浓盐酸调整反应混合液的pH为2.0～2.5，用氯化 钠饱和生成溶液以及用合适的有机溶剂、如乙酸乙酯、乙醚、或二氯甲 烷提取ω-腈基羧酸的方法，也可将ω-腈基羧酸从产物混合物中(除 去催化剂后)分离出来。然后，将有机提取物合并，用合适的干燥剂(如 硫酸镁)搅拌，过滤，除去溶剂(如，通过旋转蒸发器)，以高产量和 高纯度(代表性纯度为98-99％)地产生所需的产物。如果需要，可 将产物进一步通过重结晶法或蒸馏法纯化。

ω-腈基羧酸铵盐的氢化作用/环化作用

催化氢化作用是从脂肪族腈制备脂肪族胺的优选方法。在本发明 中，将在氢化作用过程中产生的ω-氨基羧酸环化成相应的五元或六元 环内酰胺。ω-腈基羧酸铵盐的水溶液(通过对酶水解相应的脂肪族α，ω -二腈而产生的含水产物混合物的离心和过滤制备)首先和浓缩的氢氧 化铵及水混合，以产生含1～4个化学计量当量的所加氢氧化铵的溶液。 加氢氧化铵是限制在氢化作用过程中由产物ω-氨基羧酸引起的ω-腈 基羧酸的还原性烷基化作用。相对于在反应混合液中存在的ω-腈基羧 酸的数量，2～3倍化学计量上过量的氢氧化铵是优选的用量，可获得 所需内酰胺的最适产量。可选择的是，氨气也能替代加到反应混合液中 的氢氧化铵。在氢化作用反应混合液中，ω-腈基羧酸铵盐的初始浓度 范围可以为5～20溶液重量百分比，优选的范围为7.5～12.5重量百分 比。

为制备N-甲基内酰胺，用甲胺替代氢氧化铵或氨，相对于在反应 混合液中存在的ω-腈基羧酸的数量，使用浓度为1～4个化学计量当 量。为获得所需的N-甲基内酰胺的最适产量，相对于在反应混合液中 存在的ω-腈基羧酸的数量，3～4倍化学计量上过量的甲胺是优选的 用量。

然后，向上述的氢化作用反应混合液中加以合适的氢化反应催化 剂，将生成的混合物在压力下和氢气一起加热而把ω-腈基羧酸铵盐转 变成相应的五元或六元环内酰胺。适用于本目的的氢化作用催化剂包括 (但不局限于)各种铂类金属，如依、锇、铑、钌、铂和钯，还有各种 其它的过渡金属如钴、铜、镍和锌。催化剂可能没有支持物(例如Raney 镍或氧化铂)，或者可能是有支持物的(例如，在碳上的钯，在氧化铝 上的铂，或在硅藻土上的镍)。

所用的氢化作用催化剂为在所选择的反应条件下足以得到所需的反 应速度和起始原料的总转化率的最低浓度。这种浓度容易由试验确定。 所用的催化剂的量，以催化剂的重量份表示为每100份用于反应的ω- 腈基羧酸中占0.001～20或更多份。代表性而言，上样到反应混合液中 的催化剂为1％～10％(催化剂重量/ω-腈基羧酸重量)，上样催化剂 3％～5％为优选的用量。在加有氨以产生内酰胺所进行的反应中， Raney镍(例如，促Cr-Raney镍催化剂(Grace Davison Raney 2400 活性金属催化剂))是一种优选的催化剂，而加有甲胺以产生N-甲基 内酰胺所进行的反应中，在碳上的5％或10％的钯或在碳上的4.5％钯 /0.5％铂是优选的催化剂。

氢化反应温度和压力变化很大。一般来说，温度范围可为45℃～200 ℃，优选的为70℃～180℃。一般来说，氢气压力范围从约大气压～100 个大气压，优选的为30～60个大气压。氢化作用在不调整反应混合液 pH的情况下进行，一般来说，加了过量的氢氧化铵、氨或甲胺后，pH 为9～12。在这种pH范围内，准确的pH值可通过加任一种合适的、 非干扰的碱或酸来调整到所需的pH。合适的碱包括(但不局限于)氢 氧化碱金属、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐，而合适的酸包括(但不局限 于)盐酸、硫酸或磷酸。

在水解反应中微生物细胞催化剂的裂解或来自催化剂制备时存在的 沾染物可能把抑制催化剂活性的化合物导入到氢化作用反应混合液中 (如硫醇类)。当把经微生物水解产生的ω-腈基羧酸铵盐混合液的氢 化作用与氢化作用前从水解产物混合物中分离和纯化的相同的ω-腈基 羧酸水溶液的氢化作用相比较时，未观察到抑制或失活氢化作用催化剂 的现象。

由先过滤混合液回收氢化作用催化剂的方法，可将内酰胺或N-甲 基内酰胺容易地从氢化作用产物混合物中分离，然后将产物直接从生成 的水滤液中蒸馏。在环化反应过程中产生的或加到反应混合物中的氨也 能用这种蒸馏法回收，循环使用，避免了作为废产物的不合需要的无机 盐出现。内酰胺或N-甲基内酰胺也可通过下列方法回收：过滤氢化作 用混合液，用浓盐酸调滤液的pH约为7并用氯化钠饱和，用有机溶剂 如乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚提取内酰胺或N-甲基内酰胺(水浴或连 续提取)，然后通过蒸馏法或结晶法从有机提取液中回收。在所附的实 施例中，报道用这种方法所分离的产量是非优化的，该方法仅用于得到 纯化产物，以分析和确认化学同一性。

在下列用作进一步说明本发明但不局限于此的实施例中，脂肪族α， ω-二腈的％重获率或在微生物水解反应中形成的水解产物的％产量是 根据在反应混合液中存在的α，ω-二腈的初始数量得到(除非别处注 明)并用折射率检测仪和Supelcosil LC-18-DB柱(25cm×4.6mm 直径)或Bio-Rad HPX-87H柱(30cm×7.8mm直径)的高压液 相色谱法测定。由ω-腈基羧酸铵盐水溶液的氢化作用产生的内酰胺和 N-甲基内酰胺的产量是依据在反应混合液中存在的ω-腈基羧酸铵盐 的初始浓度得到(除非别处注明)并用DB-1701毛细管柱(30m× 0.53mm ID，1微米膜厚)的气相色谱法测定。

                    实施例1

                4-氰基戊酸(铵盐)

首先，将冷冻的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞(冷冻前预 先50℃热处理1h)0.60克(湿细胞重量)放入一支15ml的聚丙烯离 心管中，然后加12ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。将细胞融 化和悬浮后，将生成的悬液离心并丢弃上清液。将生成的细胞沉淀重悬 浮在总体积12ml的相同磷酸盐缓冲液中。将重0.1081g(0.114ml， 1.00mmol，0.100M)的2-甲基戊二腈加入到第二支15ml的聚丙烯离心 管中，然后加9.89ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的细胞悬液 (0.494g细胞湿重量)，将生成的悬液在旋转平台上27℃时混合。吸取 样品(0.300ml)并离心，然后把0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺水溶液(HPLC外标准溶液)混合。加足量的1.0M HCl把样品的pH降低到约2.5，过滤生成的溶液，用HPLC分析。1.0h后， 4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为99.3％和0.7％， 没有剩余2-甲基戊二腈。

                实施例2(比较性的)

                4-氰基戊酸(铵盐)

用在冷冻前没有在50℃被热处理1h的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞重复在实施例1中描述的步骤。1.0h后，4-氰基戊酸和2 -甲基戊二酸的HPLC产量分别为62.7％和34.6％，没有剩余2-甲基 戊二腈。

                   实施例3

                4-氰基戊酸(铵盐)

首先，将冷冻的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞(在冷冻前 预先在50℃热处理1h)1.136克(细胞湿重量)放入一支50ml的聚丙 烯离心管中，接着加21.6ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。将细 胞融化悬浮后，离心生成的悬液并丢弃上清液。将生成的细胞沉淀重悬 浮于总体积22.7ml的相同磷酸盐缓冲液中。将重0.4355g(0.458ml， 4.00mmol，0.403M)的2-甲基-戊二腈加入一支15ml的聚丙烯离心管 中，然后加9.54ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞悬液(0.477g 细胞湿重量)，将生成的悬液在旋转平台上27℃时混合。用蒸馏水按1∶ 4稀释样品(0.300ml)，然后离心，将0.180ml上清液放入Millipore Ultrafree MC滤膜装置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺水溶液(HPLC外标准溶液)混合。加足量的1.0M HCl，把样品的pH降低到约2.5，过滤生成的溶液并用HPLC分析。 4.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为99.4％和 0.6％，没有剩余2-甲基戊二腈。

                      实施例4

                  4-氰基戊酸(铵盐)

除了在一支15ml的聚丙烯离心管中将1.086g(1.143ml，10.04mmol， 两相反应，1.00M产物)的2-甲基戊二腈和8.86ml的热处理敏捷食酸 菌72W(ATCC 55746)细胞悬液(0.443g细胞湿重量)在旋转平台上 27℃时混合外，重复实施例3中所描述的步骤。用蒸馏水按1∶10稀释 样品(0.300ml)，然后离心，将0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺(HPLC外标准溶液)混合。加足量的1.0M HCl，把 样品的pH降低到约2.5，过滤生成的溶液并用HPLC分析。15.25h后， 4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为98.7％和1.3％， 没有剩余2-甲基戊二腈。

                   实施例5

               4-氰基戊酸(铵盐)

用没有在50℃热处理1h的敏捷食酸菌突变株72-PF-15 (ATCC 55747)的悬液重复在实施例1中描述的步骤。3.0h后，4- 氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为96.8％和3.6％，没有 剩余2-甲基戊二腈。

                   实施例6

               4-氰基戊酸(铵盐)

用没有在50℃热处理1h的敏捷食酸菌突变株72-PF-15 (ATCC 55747)的悬液重复在实施例3中所描述的步骤。将0.4355g (0.458ml，4.00mmol，0.403M)的2-甲基戊二腈和9.54ml的敏捷食 酸菌突变株72-PF-15细胞悬液(0.477g细胞湿重量)的混合液在 一支15ml聚丙烯离心管中于旋转平台上27℃时混合。6.0h后，4-氰 基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为98.8％和1.2％，没有剩 余2-甲基戊二腈。

                   实施例7

               4-氰基戊酸(铵盐)

用没有在50℃热处理1h的敏捷食酸菌突变株72-PF-15 (ATCC 55747)的悬液重复实施例4中所描述的步骤。将1.086g (1.143ml，10.04mmol，1.00M)的2-甲基戊二腈和8.86ml的敏捷食 酸菌突变株72PF-15(ATCC 55747)细胞悬液(0.443g细胞湿重 量)的混合液在一支15ml的聚丙烯离心管中在旋转平台上于27℃时混 合。15.25h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为 99.2％和0.8％，没有剩余2-甲基戊二腈。

                     实施例8

                 4-氰基戊酸的分离

将重150g(细胞湿重量)的冷冻敏捷食酸菌72W(ATCC 55746) 细胞(冷冻前未预先在50℃热处理1h)加入到一个装备有磁搅拌棒的 2L的三角烧瓶中。然后加磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)至总体积 1.50L。细胞被融化和悬浮后，将生成的悬液在水浴中加热至50℃1h， 然后在冰/水浴中冷却到10℃，离心，丢弃上清液。形成的细胞沉淀通 过重悬浮在1.50L同样的磷酸盐缓冲液中、接着离心的方法洗涤一次。 将洗涤过的细胞沉淀转移到一个装备有磁搅拌棒的4L的三角烧瓶中，然 后悬浮在总体积2.5L的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中。随着搅拌 的同时，加129.6g(136.4ml，1.20mol，0.400M)的2-甲基戊二腈， 用同样的磷酸盐缓冲液把终体积调整到3.00L。在25℃下搅拌混合液， 在一定的时间间隔吸取样品并用HPLC分析。21.5h后，4-氰基戊酸 (4-CPA)和2-甲基戊二酸的HPLC产量分别为99.5％和0.5％， 没有剩余的2-甲基戊二腈。

离心反应混合液，回收细胞沉淀以作重新使用，将形成的上清液倾 析并用Amicon 2.5L备有YM-10滤膜(10K MWCO)的滤膜装置 过滤。将滤液放入4.0L的烧瓶中，用6N HCl调溶液的pH至2.5。然 后在溶液中一边搅拌一边加入氯化钠，直到饱和为止，将1.0L部分的生 成溶液用4×500ml乙醚提取。将合并的乙醚提取液干燥(MgSO4)， 过滤，在减压下通过旋转蒸发器把溶液浓缩到1.0L。然后，在溶液中加 入1.2L己烷和0.200ml乙醚，将产生的溶液冷却到-78℃。将生成的白 色结晶固体通过快速真空过滤并用300ml冷(5℃)己烷洗涤而分离出 来。在高真空下(150毫托)移去残留的溶剂，产生了120.3g(分离产 量79％)的4-氰基戊酸(熔点31.9-32.6℃)。

                   实施例9

               4-氰基戊酸(铵盐)

将从实施例8回收的细胞沉淀重新用在几个连续的3.0L批反应中， 以把2-甲基戊二腈水解成4-氰基戊酸铵盐。在2-甲基戊二腈的浓 度大于0.400M、超过了二腈在细胞水悬液中的溶解度时，这些反应作为 两相的水/有机混合物进行，直到剩余的2-甲基戊二腈能溶在反应混合 液中为止下表列出了产生的4-CPA铵盐的最终浓度和4-CPA及2 -甲基戊二酸的产量百分比。根据细胞催化剂的干重(1克湿重＝0.20 克干重)计，每克干重的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)产生了86g 4 -CPA。

        时间   [4-CPA(NH4)]   4-CPA       2-MGA

rxn#    (h)    (M)             (％产量)    (％产量)

1       23     0.40            99.5        0.5

2       22     0.40            99.1        0.9

3       46     1.00            99.2        0.8

4       50     1.00            99.4        0.6

5       99     1.85            98.8        1.2

6       261    2.00            98.9        1.1

                      实施例10

                  3-氰基戊酸(铵盐)

首先，将冷冻的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷冻前预先在 50℃下热处理1h)0.60克(细胞湿重)放入一支15ml的聚丙烯离心管 中，然后加入10ml磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。将细胞融化且 悬浮后，离心形成的悬液，丢弃上清液。将产生的细胞沉淀重新悬浮在 总体积10ml的相同磷酸盐缓冲液中。将重0.1080g(0.112ml，1.00mmol， 0.100M)的2-乙基琥珀腈加入到第二支15ml聚丙烯离心管中，加 8.00ml的敏捷食酸菌72W细胞悬液(0.5g细胞湿重)，用磷酸钾缓冲 液(20mM，pH7.0)调整总体积至10.0ml，将生成的悬液在旋转平 台上27℃时混合。吸取样品(0.300ml)并离心，然后将0.180ml的上 清液放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(0.22微米)中并和 0.020ml、0.750M的N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外标准溶液)混 合。过滤生成的溶液并用HPLC分析。1.0h后，3-氰基戊酸的HPLC 产量为100％，没有剩余2-乙基琥珀腈，也未观察到其它副产物。

                     实施例11

                 3-氰基戊酸(铵盐)

用0.4337g(0.449ml，4.01mmol，0.401M)的2-乙基琥珀腈和 8.00ml的热处理过的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞悬液(0.5g 细胞湿重)，在总体积10.0ml溶液中(用磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0) 调整)重复实施例10中所描述的步骤。吸取样品(0.100ml)，用水以 1∶4稀释并离心，然后将0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree- MC滤膜装置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺 的水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤产生的溶液并用HPLC分析。 8.0h后，3-氰基戊酸的HPLC产量为100％，没有剩余2-乙基琥珀 腈，也未观察到其它副产物。

                     实施例12

                 3-氰基戊酸(铵盐)

用1.087g(1.13ml，10.1mmol，两相反应，1.01M产物)的2- 乙基琥珀腈和8.00ml的热处理过的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746) 细胞悬液(0.5g细胞湿重)，在总体积10.0ml的溶液(用磷酸钾缓冲液 (20mM，pH7.0)调整)中重复在实施例10中所描述的步骤。吸取 样品(0.100ml)，用水以1∶10稀释并离心，然后将0.180ml的上清液 放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(0.22微米)中并和0.020ml 的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤 产生的溶液并用HPLC分析。71h后，3-氰基戊酸的HPLC产量为100 ％，没有剩余2-乙基琥珀腈，也未观察到其它副产物。

                      实施例13

                  3-氰基戊酸的分离

在装备有磁搅拌棒的4.0L三角烧瓶中，放入161g冷冻的敏捷食酸 菌72W(ATCC 55746)细胞(冷冻前预先在50℃下热处理1h)和27 ℃的1.60L磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。随着搅拌，将细胞融化 并悬浮，然后，一边搅拌，一边加325g(336.0ml，3.00mole)的2- 乙基琥珀腈，将混合液的总体积用磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)调 整到2.40L。形成的混合液在27℃搅拌，吸取样品(0.100ml)，用水 以1∶10稀释，离心，然后将0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree -MC滤膜装置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰 胺的水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤产生的溶液并用HPLC分 析。183h后，3-氰基戊酸的HPLC产量为100％，没有剩余2-乙基 琥珀腈，也未观察到其它副产物。离心反应混合液，回收细胞沉淀，可 重复使用，将产生的2.3L的上清液倾析并用装备有YM-10滤膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L滤膜装置过滤。在滤液中3-氰基戊酸铵盐的 浓度为1.26M。

将上述含1.26M 3-氰基戊酸铵盐的300ml部分滤液用约60ml的 6N HCl调pH至2.5，然后用氯化钠饱和，用4×200ml的乙醚提取。 将合并的有机提取液在硫酸镁上干燥，过滤，通过在28℃、减压下旋转 蒸发器除去溶剂。将生成的略带黄色的粘油物28℃下在高度真空(50 毫托)下搅拌，以移去残余的溶剂，然后冷却到-20℃2-3h，而产 生成为白色结晶固体的3-氰基戊酸(45.9g，产量96％)；熔点33.0～ 34.0℃。

                     实施例14

                 3-氰基戊酸(铵盐)

用没有在50℃热处理过的敏捷食酸菌突变株72-PF-15(ATCC 55747)的悬液，重复在实施例10中所述的步骤。1.0h后，3-氰基戊 酸的HPLC产量为100％，没有剩余2-乙基琥珀腈，也未观察到其它 副产物。

                     实施例15

                 3-氰基戊酸(铵盐)

用0.4325g(0.455ml，4.00mmol，6.400M)的2-乙基琥珀腈和 8.00ml(0.5g细胞湿重)的没有在50℃热处理过的敏捷食酸菌突变株 72-PF-15(ATCC 55747)的悬浮液，在总体积10.0ml溶液(用 磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)调整)中重复在实施例14中所描述 的步骤。25h后，3-氰基戊酸的HPLC产量为100％，没有剩余2- 乙基琥珀腈，也未观察到其它副产物。

                      实施例16

                  3-氰基戊酸(铵盐)

用1.087g(1.14ml，10.1mmol，两相反应，1.01M产物)的2- 乙基琥珀腈和8.00ml(0.5g细胞湿重)的没有在50℃热处理过的敏捷 食酸菌突变株72-PF-15(ATCC 55747)的悬液，在总体积10.0ml 溶液(用磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)调整)中重复实施例14中 所描述的步骤。71h后，3-氰基戊酸的HPLC产量为76.6％，有25.1 ％剩余的2-乙基琥珀腈，未观察到其它副产物。

                      实施例17

              4-氰基-4-戊烯酸的分离

在装备有磁搅拌棒的500ml的三角烧瓶中，放入50.0g冷冻的敏捷 食酸菌72W(ATCC 55746)细胞(冷冻前预先在50℃热处理1h)和 在27℃、450ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。随着搅拌，将 细胞融化并悬浮、然后离心、丢弃上清液。将细胞沉淀重新悬浮在1.0L 烧瓶中的总体积863ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，然后在 27℃下一边搅拌一边加133g(137.0ml，1.25mole)的2-亚甲基戊 二腈。在2-亚甲基戊二腈的浓度大于0.400M、超过了二腈在细胞水悬 液中的溶解度时，这些反应以两相水/有机混合液的方式进行，一直进行 到剩余的2-亚甲基戊二腈可溶于反应混合液中为止。吸取样品 (0.100ml)，用水以1∶10比例稀释，离心，然后将0.150ml的上清液 放入Millipore  Ultrafree-MC滤膜装置(0.22微米)，和0.150ml 的0.150M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤 产生的溶液并用HPLC分析。26h后，4-氰基-4-戊烯酸的HPLC 产量为100％，没有剩余的2-亚甲基戊二腈，也未观察到其它副产物。 离心反应混合液，回收细胞沉淀以重新使用，将上清液用装备有YM- 10滤膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L滤膜装置过滤。在滤液中4 -氰基-4-戊烯酸铵盐的最终浓度为1.298M。

将上述含有4-氰基-4-戊烯酸铵盐产物混合物的100ml部分滤 液用6N HCl调整到pH2.7，用氯化钠饱和，用4×100ml乙醚提取。 将合并的有机提取液在硫酸镁上干燥，过滤，通过28℃减压下旋转蒸发 器把合并提取液的体积降低到100ml。在乙醚溶液中加入200ml己烷， 将生成的溶液冷却到-78℃。生成的白色结晶固体由快速真空过滤法分 离并用100ml冷(5℃)己烷洗涤。将残留的溶剂在高真空(150毫托) 下除去而产生9.80g(60％分离产量)的4-氰基-4-戊烯酸(熔点 26.5-27.0℃，贮存在-20℃)。

                  实施例18

           4-氰基-4-戊烯酸(铵盐)

从实施例17(敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)细胞)回收的细 胞沉淀在把2-亚甲基戊二腈水解成4-氰基-4-戊烯酸铵盐的第二 次连续的1.0L批反应中重新使用。在2-亚甲基戊二腈的浓度大于 0.400M、超过了二腈在细胞水悬液中的溶解度时，这些反应以两相水/ 有机相混合液的方式进行，一直进行到剩余的2-亚甲基戊二腈可溶在 反应混合液中为止。将细胞沉淀重新悬浮在1.0L烧瓶中的总体积781ml 的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，然后在27℃下，一边搅拌一 边加212g(219.0ml，2.00mole)的2-亚甲基戊二腈。吸取样品 (0.100ml)，用水以1∶20稀释，离心，然后将0.150ml的上清液放入 Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(0.22微米)中并与0.150ml的 0.150M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤生 成的溶液并用HPLC分析。53h后，4-氰基4-戊烯酸的HPLC产量 为100％，没有剩余2-亚甲基戊二腈，也未观察到其它副产物。

                      实施例19

                  3-氰基丙酸(铵盐)

首先，将冷冻的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷冻前预先在 50℃热处理1h)细胞0.50克(细胞湿重)放入一支15ml聚丙烯离心管 中，接着加10ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。将细胞融化和 悬浮后，离心形成的悬液，丢弃上清液。将产生的细胞沉淀重新悬浮在 总体积10ml的同样磷酸盐缓冲液中。在第二支15ml的聚丙烯离心管中 放入溶在总体积8.0ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中的0.3236g (4.00mmol，0.400M)的琥珀腈，然后加2.00ml的敏捷食酸菌72W (ATCC 55746)细胞悬液(0.10g细胞湿重)，将产生的悬液在27℃ 下、旋转平台上混合。吸取样品(0.100ml)，用水以1∶4比例稀释， 离心，然后将0.150ml的上清液被放入Millipore Ultrafree-MC滤膜 装置(0.22微米)中，与0.015ml的0.1M HCl及0.150ml的0.100M 丙酸的水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤生成的溶液并用HPLC 分析。3.0h后，3-氰基丙酸的HPLC产量为100％，没有剩余的琥珀 腈，也未观察到其它副产物。

                      实施例20

                  3-氰基丙酸的分离

在装备有磁搅拌棒的500ml三角烧瓶中放入20.0g的冷冻的敏捷食 酸菌72W(ATCC 55746)细胞(冷冻前在50℃热处理1h)和27℃ 下、200ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。随着搅拌的同时，将 细胞融化、悬浮、然后离心，丢弃上清液。重复该洗涤步骤。将生成的 细胞沉淀重新悬浮在含101.1g(1.25mole，1.25M)的琥珀腈的总体积 1.00L的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，将产生的混合液在27℃ 下放在水浴中的1L烧瓶中搅拌。吸取样品(0.100ml)，用水以1∶10 稀释，然后将0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装 置(0.22微米)中并和0.015ml 0.1M HCl及0.150ml的0.100M丙酸 水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤产生的溶液并用HPLC分析。 1.0h后，3-氰基丙酸和琥珀酸的HPLC产量分别为99.7％和0.3％， 没有剩余琥珀腈。离心产生的混合液，用装备有YM-10滤膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L滤膜装置过滤。在滤液中3-氰基丙酸的终浓 度为1.31M。

将含有上述的3-氰基丙酸铵盐产物混合物的200ml部分滤液用6N HCl调整至pH2.5，然后用氯化钠饱和，用4×200ml乙醚提取。将合 并的有机提取液在硫酸镁上干燥、过滤，在减压下通过旋转蒸发器除去 溶剂。将生成的无色油状物溶于150ml乙醚中，然后加100ml己烷，把 产生的溶液冷却到-78℃。生成的白色结晶固体通过真空过滤法分离， 在高真空下(150毫托)移去残留的溶剂，可产生14.32g(55％分离产 量)的3-氰基丙酸(熔点，49.5-51.0℃)。

                      实施例21

                  4-氰基丁酸(铵盐)

首先，冷冻的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷冻前预先在50 ℃热处理1h)0.50克(细胞湿重)放入一支15ml的聚丙烯离心管中， 然后加10ml磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。将细胞融化和悬浮后， 离心产生的悬液，丢弃上清液。将产生的细胞沉淀重新悬浮在总体积10ml 的相同磷酸盐缓冲液中。在第二支15ml的聚丙烯离心管中放入溶在总体 积6.0ml磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中的0.3830g(4.03mmol， 0.400M)戊二腈，然后加4.00ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746) 细胞悬液(0.20g细胞湿重)，将产生的悬浮液在27℃、旋转平台上混 合。吸取样品(0.100ml)，用水按1∶4稀释，然后将0.150ml的上清 液被放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(0.22微米)中，与 0.015ml 0.1M HCl及0.150ml的0.150M乙酸钾水溶液(HPLC外标准 溶液)混合。过滤产生的溶液，用HPLC分析。4.0h后，4-氰基丁酸 和戊二酸的HPLC产量分别为85.1％和8.2％，仍剩有5.7％戊二腈。

                      实施例22

                  4-氰基丁酸的分离

在备有磁搅拌棒的250ml三角烧杯中放入15.0g冷冻的敏捷食酸菌 72W(ATCC 55746)细胞(冷冻前50℃热处理1h)和27℃的135ml 磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)。随着搅拌的同时，将细胞融化并悬 浮，然后离心，丢弃上清液。重复该洗涤步骤。将产生的细胞沉淀重新 悬浮在总体积100ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，将这种细 胞悬液加入含有磁搅拌棒、42.78g(0.450mole)的戊二腈及157.2ml 的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)的500ml烧瓶中。将产生的含有1.5M 戊二腈的混合液在27℃下搅拌。吸取样品(0.100ml)，用水以1∶10 稀释，离心。然后，将0.200ml的上清液放入Millipore Ultrafree- MC滤膜装置(0.22微米)中，与0.020ml的0.1M HCl及0.200ml的 0.150M乙酸钾水溶液(HPLC外标准溶液)混合。过滤产生的溶液并用 HPLC分析。4.0h后，4-氰基丁酸铵盐和戊二酸二铵盐的HPLC产量 分别为92.3％和7.7％，没有剩余戊二腈。

离心反应混合液，用备有YM-10滤膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L滤膜装置过滤上清液。将含有上面所述的4-氰基丁酸铵盐产物混 合物的滤液用6N HCl调整至pH3.5，然后用氯化钠饱和，用4×300ml 乙醚提取。将合并的有机提取液在硫酸镁上干燥，过滤，在减压下通过 旋转蒸发器除去溶剂，接着在真空下(100毫托)搅拌产生35.3g(62％ 产量)的以停止结晶的白黄色油状物的4-氰基丁酸。固体在1∶1乙酸 乙酯/己烷5℃下重新结晶(熔点，39.6-40.2℃)。

                      实施例23

                  5-氰基戊酸(铵盐)

首先，将冷冻的睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)细胞(冷冻前预先在50℃热处理1h)2.0克(细胞湿重)放入 一支50ml的聚丙烯离心管中，接着加30ml磷酸钾缓冲液(20mM，pH 7.0)。将细胞融化和悬浮后，离心产生的悬液，丢弃上清液。将产生的 细胞沉淀重新悬浮在总体积30ml同样的磷酸盐缓冲液中。在第二支15ml 的聚丙烯离心管中放入重0.1085g(0.114ml，1.00mmol，0.100M)的 己二腈，然后加9.29ml的磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)和0.60ml 的睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)细胞悬液 (0.040g细胞湿重)，将产生的悬液在27℃下、旋转平台上混合。吸取 样品(0.300ml)，离心，然后将0.180ml的上清液被放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750M N-乙基乙酰胺的水溶液(HPLC外标准溶液)混合，足量的1.0M HCl把样品的pH降低到约pH2.5。过滤产生的溶液并用HPLC分析。5.0h 后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺、己二 酸的HPLC产量为96.6％、1.7％、1.4％和0.3％，没有剩余己二腈。

                    实施例24

                5-氰基戊酸(铵盐)

用0.4338g(0.457ml，4.01mmol，0.401M)的己二腈和3.0ml热 处理过的睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)细胞悬 液(0.20g细胞湿重)，在总体积10.0ml的溶液中(用磷酸钾缓冲液 (20mM，pH7.0)调整)重复实施例23中所描述的步骤。吸取样品 (0.100ml)，用水以1∶4稀释，离心，然后将0.180ml的上清液放入 Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(10K MWCO)中，和0.020ml 的0.750M N-乙基乙酰胺水溶液(HPLC外标准溶液)混合，足量的 1.0M HCl把样品的pH降低到约pH2.5。过滤产生的溶液并用HPLC 分析。5.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰 二胺和己二酸的HPLC产量为94.0％、4.0％、0.6％和1.4％，没有剩 余己二腈。

                     实施例25

                 5-氰基戊酸(铵盐)

用1.084g(1.14ml，10.0mmol，两相反应，1.00M产物)的己二腈 和7.5ml热处理过的睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)细胞悬液(0.50g细胞湿重)，在总体积10.0ml溶液中(用磷 酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)调整)重复实施例23中所述的步骤。 吸取样品(0.100ml)，用水以1∶10稀释，离心，然后将0.180ml的上 清液放入Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(10K MWCO)中， 和0.020ml的0.750M N-乙基乙酰胺水溶液(HPLC外标准溶液)混 合，足量的1.0M HCl把样品的pH降低到约2.5。过滤产生的溶液并 用HPLC分析。24.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC产量为90.0％、4.2％、0.0％ 和5.7％，没有剩余的己二腈。

                     实施例26

                 5-氰基戊酸的分离

在备有磁搅拌棒的2L三角烧瓶中放入在27℃ 1.72L磷酸钾缓冲液 (20mM，pH7.0)中的4.0g睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D (ATCC 55744)细胞(预先在50℃热处理1h)的悬液。然后，一边 搅拌，一边往悬液中加入270.4g(284.3ml，2.5mole，约1.25M最终 产物浓度)的己二腈，在27℃下搅拌产生的混合液。吸取样品 (0.200ml)，用水以1∶5稀释，离心，然后将0.200ml的上清液放入 Millipore Ultrafree-MC滤膜装置(10K MWCO)中，加足量的 1.0M HCl，把样品的pH降低到约pH2.5。过滤产生的溶液并用HPLC 分析。63h后，水解反应相当缓慢，因此加另外的10.0g相同的微生物 细胞催化剂到混合液中。86h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC产量为88.2％、4.7％、6.6％ 和0.0％，没有剩余己二腈。离心反应混合物，用备有YM-10滤膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L滤膜装置过滤上清液。

将上面所述的含有5-氰基戊酸铵盐(1.13M)的200ml部分产物 混合物滤液用6N HCl调整到pH2.5，然后用氯化钠饱和，用4×200ml 乙醚提取。将合并的乙醚提取液在硫酸镁上干燥，过滤，在减压下通过 旋转蒸发器除去溶剂。将残留的乙醚通过室温下高真空(60毫托)中搅 拌无色的液体5h除去，而产生27.32g(95％分离产量)的5-氰基戊 酸。然后，将5-氰基戊酸在110-112℃、真空下(75毫托)蒸馏而 毫无分解。

                   实施例27

      来自4-氰基戊酸铵盐的5-甲基-2-哌啶酮

在100ml刻度量筒中放入54.4ml含有1.85M 4-氰基戊酸铵盐 (0.1摩尔浓度的4-氰基戊酸铵盐，通过酶水解2-甲基戊二腈产生； 实施例9，从反应#5过滤产物混合液)的反应混合物水溶液，然后加 12.9ml浓缩的氢氧化铵(29.3％NH3，0.2mole NH3)，将最终体积 用蒸馏水调整至100ml。4-氰基戊酸铵盐和加入的氢氧化铵的最终浓 度分别为1.0M和2.0M。在产生的溶液中加入0.631g(5重量％/重量 的4-氰基戊酸)的铬促Raney镍(Grace Davison Raney2400活泼 金属催化剂)，产生的混合液转移到装备有Dispersimax涡轮型推进器 的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。 给反应器充氮气后，将反应器中的内含物在500psig氢气中以1000rpm 搅拌并在160℃加热3h。冷却至室温后，通过气相色谱分析，最终反应 混合液显示5-甲基-2-哌啶酮的产量为96.4％，没有剩余4-氰基 戊酸铵盐。

过滤产物混合液以除去催化剂，然后用6N HCl调pH至6.0，用 氯化钠饱和。用100ml二氯甲烷提取产生的溶液5次，将合并的有机提 取液在硫酸镁上干燥，过滤，在减压下通过旋转蒸发器除去溶剂，而产 生无色的油状物。在真空(0.1mmHg)中除去残留的溶剂后，油状物结 晶形成白色固体，在-78℃下从150ml乙醚中重新结晶而产生6.69g(59 ％分离产量)的5-甲基-2-哌啶酮(熔点55.5-56.2℃)。

                    实施例28

        来自4-氰基戊酸的5-甲基-2-哌啶酮

用12.71g(0.100mole)的结晶4-氰基戊酸(来自实施例8描述 的分离物)和19.34ml浓缩的氢氧化铵(29.3％NH3，0.3mole NH3)， 在总体积100ml溶液中重复实施例27所描述的反应。4-氰基戊酸铵盐 和氨的最终浓度分别为1.0M和2.0M。用气相色谱分析最终的反应混合 液显示5-甲基-2-哌啶酮的产量为91.1％，没有剩余4-氰基戊酸。

                     实施例29

       来自4-氰基戊酸铵盐的5-甲基-2-哌啶酮

含有1.0M 4-氰基戊酸铵盐(来自实施例9、反应#5的过滤产物 混合液)、0～3.0M氢氧化铵和5重量％或10重量％(相对于4-氰基戊 酸的重量)选自促Cr Raney镍催化剂(Raney 2400)、5％在碳上的钯、 10％在碳上的钯、5％在氧化铝上的钌或10％在氧化铝上的钌的氢化作用 催化剂的5ml含水反应混合物，其氢化作用在500psig氢气、160℃或180 ℃下、在玻璃振摇器试管中进行，测定了产生的相应的5-甲基-2-哌 啶酮内酰胺(5-MPPD)：

温度                   [NH4OH] 重量％  时间  ％4-CPA   5-MPPD

(℃)    催化剂         (M)      催化剂  (h)   转化率    (％)

160     Raney 2400     0        5       2     100       85.6

160     Raney 2400     2.0      5       2     100       96.4

160     Raney 2400     3.0      5       2     100       86.5

160     5％Pd/C        2.0      5       2     10        0

160     10％Pc/C       2.0      5       2     14        0

160     5％Ru/Al2O3 2.0      5       2     15        0

160     10％Ru/Al2O32.0      5       2     20        0

180     Raney 2400     2.0      5       2     100       91.4

180     Raney 2400     3.0      5       2     100       89.5

                     实施例30

       来自3-氰基戊酸铵盐的4-乙基吡咯烷-2-酮

在100ml刻度量筒中放入含1.26M 3-氰基戊酸铵盐(0.1mole的3 -氰基戊酸铵盐，由酶水解2-乙基琥珀腈产生；实施例13的过滤产物 混合液)的79.4ml含水反应混合物，然后加12.9ml浓缩的氢氧化铵(29.3 ％NH3，0.2mole NH3)，用蒸馏水调整最终体积至100ml。3-氰基戊 酸铵盐和加入的氢氧化铵的终浓度分别为1.0M和2.0M。在产生的溶液 中加入0.631g(5重量％/重量的3-氰基戊酸)的促铬Raney镍(Grace Davison Raney2400活泼金属催化剂)，将产生的混合液转 移到装备有Disperimax涡轮型推进器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。给反应器充氮气后，将反应器中的 内含物在500psig氮气下以1000rpm搅拌并在160℃加热4h。冷却到室 温后，由气相色谱分析最终反应混合液显示4-乙基吡咯烷-2-酮的产 量为90.7％，没有剩余3-氰基戊酸铵盐。

                    实施例31

        来自3-氰基戊酸的4-乙基吡咯烷-2-酮

用12.71g(0.100mole)的结晶3-氰基戊酸(来自实施例13所述的 分离物)和19.34ml浓缩的氢氧化铵(29.3％NH3，0.3mole NH3)，在总 体积100ml的溶液中重复实施例30所述的反应。3-氰基戊酸铵盐和所 加的氢氧化铵的最终浓度分别为1.0M和2.0M。用气相色谱分析最终的 反应混合液(反应时间2h)显示4-乙基吡咯烷-2-酮的产量为92.1％， 没有剩余3-氰基戊酸。

过滤产物混合液以除去催化剂，然后用6N HCl调整pH到7.0，用 氯化钠饱和。用100ml二氯甲烷提取产生的溶液4次，将合并的有机提 取液在硫酸镁上干燥，过滤，在减压下通过旋转蒸发器除去溶剂，而产生 无色的油状物。在真空中(0.1mmHg)移去残留的溶剂后，将油状物溶 在150ml的乙醚中，然后冷却到-78℃。1h后，通过真空过滤法收集白 色的已结晶的固体，而总共产生8.96g(79％分离产量)的4-乙基吡咯 烷-2-酮(熔点40.5～41.5℃)。

                      实施例32

除了用于氢化作用的温度是140℃外，如上所述完全重复实施例30 中所述的反应。通过气相色谱法分析的最终反应混合物(4h反应时间) 显示4-乙基吡咯烷-2酮的产量为87.2％，没有剩余3-氰基戊酸。

                      实施例33

      来自3-氰基戊酸铵盐的4-乙基吡咯烷-2-酮

除了应用1.262g(10重量％/重量的3-氰基戊酸)的促铬Raney镍 (Grace Davison Raney2400活泼金属催化剂)外，准确按照实施例30 所描述的反应重复进行。用气相色谱分析最终的反应混合液(反应时间 1.5h)显示4-乙基吡咯烷-2-酮的产量为91.0％，没有剩余3-氰基戊 酸。

                    实施例34

      来自3-氰基戊酸铵盐的4-乙基吡咯烷-2-酮

                   (温度依赖性)

含有1.0M 3-氰基戊酸(3-CPA)铵盐(从实施例13来的过滤产 物混合液)、2.0M氢氧化铵和5重量％或10重量％的促Cr-Raney镍催 化剂(Raney 2400)(相对于3-氰基戊酸的重量)的5ml含水反应混合 物的氢化作用在500psig氢气和温度从70℃～180℃下在玻璃振摇器试管 中进行2h，然后，用高压液相色谱分析3-CPA的转化率，用气相色谱 分析产生的4-乙基吡咯烷-2-酮：

温度   3-CPA铵盐    [NH4OH]   重量％    时间    3-CPA       4-EPRD

(℃)   (M)          (M)        Raney Ni  (h)     (％转化率)  (％产量)

70     1.0          2.0        5         2       7           1.5

120    1.0          2.0        5         2       55          22.7

140    1.0          2.0        5         2       71          55.4

140    1.0          2.0        10        2       100         89.9

160    1.0          2.0        5         2       100         90.1

160    1.0          2.0        10        2       100         91.3

180    1.0          2.0        5         2       100         86.1

180    1.0          2.0        10        2       100         90.0

                   实施例35

     来自3-氰基戊酸铵盐的4-乙基吡咯烷-2-酮

               (NH4OH浓度依赖性)

含有1.0M 3-氰基戊酸(3-CPA)铵盐(来自实施例13的过滤产 物混合液)、0～3.0M氢氧化铵和5重量％的促Cr-Raney镍催化剂(Raney 2400)(相对于3-氰基戊酸的重量)的5ml含水反应混合物的氢化作用 在500psig氢气和160℃或180℃温度下在玻璃振摇器试管中进行2h，然 后用高压液相色谱分析3-CPA的转化率，用气相色谱分析产生的4-乙 基吡咯烷-2-酮：

温度   3-CPA铵盐 [NH4OH] 重量％    时间    3-CPA       4-EPRD

(℃)   (M)        (M)     Raney Ni  (h)     (％转化率)  (％产量)

160    1.0        0       5         2       99          80.1

160    1.0        1.0     5         2       99          87.6

160    1.0        2.0     5         2       100         90.1

160    1.0        3.0     5         2       100         85.4

180    1.0        0       5         2       100         75.1

180    1.0        1.0     5         2       100         85.8

180    1.0        2.0     5         2       100         88.5

180    1.0        3.0     5         2       100         90.0

                     实施例36

       来自3-氰基戊酸铵盐的4-乙基吡咯烷-2-酮

                 (3-CPA浓度依赖性)

将分别含有1.0M、1.5M或2.0M的3-氰基戊酸(3-CPA)(从实 施例13过滤产物混合液中分离)和2.0M、3.0M或4.0M氢氧化铵的5ml 含水反应混合物的氢化作用，用如5重量％的促Cr-Raney镍催化剂 (Raney 2400)(相对于3-氰基戊酸的重量)在500psig氢气和160℃或 180℃温度下在玻璃振摇器试管中进行2h，然后用高压液相色谱分析3- CPA的转化率，用气相色谱分析产生的4-乙基吡咯烷-2-酮：

温度   3-CPA铵盐  [NH4OH]   重量％    时间    3-CPA       4-EPRD

(℃)   (M)        (M)        Raney Ni  (h)     (％转化率)  (％产量)

160    1.0        2.0        5         2       100         90.1

160    1.5        3.0        5         2       99          76.1

160    2.0        4.0        5         2       99          80.0

180    1.0        2.0        5         2       100         88.5

180    1.5        3.0        5         2       99          77.3

180    2.0        4.0        5         2       99          84.1

                          实施例37

           来自5-氰基戊酸铵盐的己内酰胺

将含有1.0M 5-氰基戊酸(5-CPA)铵盐(从酶水解己二腈制备， 来自实施例26的过滤产物混合液)，0～2.5M氢氧化铵和5重量％的促Cr -Raney镍催化剂(Raney 2400)(相对于5-氰基戊酸的重量)的5ml 含水反应混合物的氢化作用在500psig氢气和70℃～160℃温度下在玻璃 振摇器试管中进行2h，然后用高压液相色谱分析5-CPA的转化率，用 气相色谱分析产生的己内酰胺：

温度  5-CPA铵盐  [NH4OH]   时间    5-CPA       己内酰胺

(℃)  (M)        (M)        (h)     (％转化率)  (％产量)

70    1.0        0          2       100         0.7

70    1.0        1.0        2       100         0.7

70    1.0        1.5        2       94          0.8

70    1.0        2.0        2       84          0.8

70    1.0        2.5        2       99          0.8

120   1.0        0          2       99          0.9

120   1.0        1.0        2       100         0.9

120   1.0        1.5        2       97          1.0

120   1.0        2.0        2       97          1.1

160   1.0        0          2       97          2.5

160   1.0        1.0        2       84          2.3

160   1.0        1.5        2       97          3.0

160   1.0        2.0        2       95          2.7

通过在70℃下5-CPA铵盐的氢化作用而制备的含水产物混合物中 (如上所述)6-氨基己二酸(6-ACA)铵盐的环化由下列方法在较高 温度下设法实现：首先用过滤法除去氢化作用催化剂，然后在280℃下， 加热约1.0M 6-ACA铵盐反应混合液2h：

温度   6-ACA铵盐(M)       [NH4OH]   时间    己内酰胺

(℃)   (按上述方法制备)   (M)        (h)     (％产量)

280    1.0                0          2       17.8

280    1.0                1.0        2       17.2

280    1.0                1.5        2       11.0

280    1.0                2.0        2       9.0

280    1.0                2.5        2       3.1

                      实施例38

      来自4-氰基戊酸铵盐的l，5-二甲基-2-哌啶酮

含有1.0M 4-氰基戊酸铵盐(来自实施例9、反应#5的过滤产物 混合液)、3.0M甲胺和5重量％或10重量％(相对于4-氰基戊酸的重 量)选自促Cr-Raney镍催化剂(Raney 2400)、5％在碳上的钯、5％在 氧化铝上的钯、5％在氧化铝上的钌、或在碳上的4.5％钯/0.5％铂的氢化 作用催化剂的5ml含水反应混合物，其氢化作用在500psig氢气和160℃ 下，在玻璃振摇器试管中进行2h，然后分析产生的1，5-二甲基-2-哌 啶酮(5-DMPD)和5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)：

温度                       重量％    时间   4-CPA        5-DMPD    5-MPPD

(℃)    催化剂             催化剂    (h)    (％转化率)   (％产量)  (％产量)

160     Raney 2400         5         2      100          19.2      68.5

160     Raney 2400         10        2      100          21.7      69.1

160     5％Ru/Al2O3     5         2      100          19.0      63.5

160     5％Pd/C            5         2      99           81.7      7.8

160     5％Pd/Al2O3     5         2      93           77.2      4.6

160     4.5％Pd/0.5％Pt/C  5         2      97           77.8      6.2

                      实施例39

      来自4-氰基戊酸铵盐的1，5-二甲基-2-哌啶酮

含有1.0M 4-氰基戊酸铵盐(来自实施例9、反应#5的过滤产物 混合液)、1.0M～3.0M甲胺和5重量％(相对于4-氰基戊酸的重量)的 5％在碳上的钯的5ml含水反应混合物，其氢化作用在500psig氢气和140 ℃下，在玻璃振摇器试管中进行2h，然后分析产生的1，5-二甲基-2- 哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊 二酸(2-MGA)：

温度               时间  [CH3NH2]4-CPA       5-DMPD    5-MPPD    2-MGA

(℃)  催化剂       (h)    (M)      (％转化率)  (％产量)  (％产量)  (％产量)

140   5％Pd/C      2      1.0       100         53.3      0         0.7

140   5％Pd/C      2      1.25      100         65.8      0         0.7

140   5％Pd/C      2      1.5       99          74.5      0         0.8

140   5％Pd/C      2      2.0       98          80.2      0         1.0

140   5％Pd/C      2      3.0       99          83.4      0         1.1

                      实施例40

      来自4-氰基戊酸铵盐的1，5-二甲基-2-哌啶酮

含有1.0M 4-氰基戊酸铵盐(来自实施例9、反应#5的过滤产物 混合液)、1.0M～4.0M甲胺和5重量％(相对于4-氰基戊酸的重量)的 5％在碳上的钯的5ml含水反应混合物，其氢化作用在500psig氢气和160 ℃下，在玻璃振摇器试管中进行，然后分析产生的1，5-二甲基-2-哌 啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二 酸(2-MGA)：

温度                时间 [CH3NH2]4-CPA       5-DMPD    5-MPPD    2-MGA

(℃)  催化剂       (h)    (M)      (％转化率)  (％产量)  (％产量)  (％产量)

160   5％Pd/C       2     1.0       100         53.5      0         0.7

160   5％Pd/C       2     1.25      100         68.3      0         0.8

160   5％Pd/C       2     1.5       100         76.4      0         0.9

160   5％Pd/C       2     2.0       100         81.5      0         1.8

160   5％Pd/C       2     3.0       99          81.7      7.8       3.3

160   5％Pd/C       2     4.0       99          88.4      1.9       2.6

                         实施例41

      来自4-氰基戊酸铵盐的1，5-二甲基-2-哌啶酮

含有1.0M 4-氰基戊酸铵盐(来自实施例9、反应#5的过滤产物 混合液)，3.0M～4.0M甲胺和5重量％(相对于4-氰基戊酸的重量)的 5％在碳上的钯或在碳上的4.5％钯/0.5％铂的5ml含水反应混合物，其氢 化作用在500psig氢气和180℃下，在玻璃振摇器试管中进行2h，然后分 析产生的1，5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮 (5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)：

温度                       [CH3NH2]  4-CPA       5-DMPD    5-MPPD    2-MGA

(℃)    催化剂              (M)        (％转化率)  (％产量)  (％产量)  (％产量)

180     5％Pd/C             3.0         97          73.0      6.6       -

180     4.5％Pd/0.5％Pt/C   3.0         96          69.0      1.9       23.9

180     5％Pd/C             4.0         95          66.6      2.6       33.5

                     实施例42

     来自4-氰基戊酸铵盐的1，5-二甲基-2-哌啶酮

在100ml刻度量筒中放入54.4ml的含有1.84M 4-氰基戊酸铵盐 (0.1mole的4-氰基戊酸铵盐，通过酶水解2-甲基戊二腈产生；实施 例9，来自反应#5过滤产物混合液)的含水反应混合物，然后加25.8ml 的40重量％甲胺(9.31g甲胺，0.3mole)，用蒸馏水调整最终体积至100ml。 4-氰基戊酸铵盐和甲胺的最终浓度分别为1.0M和3.0M。往产生的溶液 中加入0.636g(5重量％重量的4-氰基戊酸)在碳粉末上的5％Pd，把 产生的混合液转移到装备有Dispersimax涡轮型推进器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。在反应器中通入氮气 后，将反应器的内含物在500psig氢气下以1000rpm搅拌并在160℃加热 4h。经取样管移取样品(约1.5ml)以分析整个反应过程。冷却到室温后， 通过气相色谱分析最终反应混合液显示1，5-二甲基-2-哌啶酮的产量 为72.8％，5-甲基-2-哌啶酮的产量为3.5％，2-甲基戊二酸的产量为 19.9％，没有剩余4-氰基戊酸铵盐。

过滤产物混合液(取样后61ml)而除去催化剂，然后用6N HCl调 pH至7.0并用氯化钠饱和。用100ml乙醚提取产生的溶液4次，将合并 的有机相提取物在硫酸镁上干燥，过滤，并在减压下通过旋转蒸发器除去 溶剂而产生无色的液体。将该液体在3.5Torr下蒸馏，并收集在70.0～71.5 ℃沸腾的级分，而产生4.65g(60％分离产量)的1，5-二甲基-2-哌啶 酮(5-DMPD)。

                      实施例43

  来自3-氰基戊酸铵盐的4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮

在100ml刻度量筒中放入79.4ml含有1.26M 3-氰基戊酸铵盐 (0.1mole的3-氰基戊酸铵盐，通过酶水解2-乙基琥珀腈产生；实施 例13过滤产物混合液)的含水反应混合物，然后加17.2ml的40重量％ 甲胺(6.21g甲胺，0.2mole)，用蒸馏水调整最终体积到100ml。3-氰基 戊酸铵盐和甲胺的最终浓度分别为1.0M和2.0M。往产生的溶液中加入 0.636g(5重量％/重量的3-氰基戊酸)在碳粉末上的5％Pd，把产生的 混合液转移到装备有Dispersimax涡轮型推进器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。在反应器中通入氮气 后，将反应器中的内含物在500psig氢气下以1000rpm搅拌并在140℃加 热4h。经取样管移取样品(约1.5ml)以分析整个反应过程。冷却到室温 后，通过气相色谱分析最终反应混合液显示4-乙基-1-甲基吡咯烷-2 -酮的产量为69.8％，4-乙基吡咯烷-2-酮的产量为20.4％，没有剩余 3-氰基戊酸铵盐。

过滤产物混合液(取样后80ml)以除去催化剂，然后用6N HCl调 整到pH7.0并用氯化钠饱和。用100ml二氯甲烷提取产生的溶液4次， 将合并的有机提取液在硫酸镁上干燥，过滤，在减压下通过旋转蒸发器除 去溶剂而产生无色的液体。将该液体在16Torr下分馏，收集在100℃沸 腾的级分(5.15g，51％产量)。产生的4-乙基-1-甲基-吡咯烷酮-2 -酮含有＜5％的4-乙基吡咯烷-2-酮不纯物，所以将该液体在40Torr 下重蒸馏，并收集在128℃沸腾的级分而产生3.71g(37％分离产量)的4 -乙基-甲基吡咯烷-2-酮(4-EMPRD)。

                   实施例44

    来自4-氰基-4-戊烯酸铵盐的5-甲基-2-哌啶酮

在100ml刻度量筒中放入77.0ml含有1.30M 4-氰基-4-戊烯酸 铵盐(0.1mole的4-氰基戊烯酸铵盐，通过酶水解2-亚甲基戊二腈产 生；实施例17)的含水反应混合物，然后加12.9ml浓缩的氢氧化铵(29.3 ％NH3，0.2mole NH3)，用蒸馏水调整最终体积到100ml。4-氰基-4 -戊烯酸铵盐和所加的氢氧化铵最终浓度分别为1.0M和2.0M。往产生 的溶液中加入0.626g(5重量％/重量的4-氰基-4-戊烯酸)的铬促Raney 镍(Grace Davison Raney2400活泼金属催化剂)，把产生的混合液转移 到装备有Dispersimax涡轮型推进器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。在反应器中通入氮气后，将反应 器中的内含物在500psig氢气下以1000rpm搅拌，并在50℃加热5h，然 后在160℃再加热3h。冷却到室温后，通过气相色谱分析最终反应混合 液显示5-甲基-2-哌啶酮的产量为85.0％，没有剩余4-氰基-4-戊 烯酸铵盐。

                      实施例45

    来自3-氰基丙酸铵盐的2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)

在100ml的刻度量筒中放入78.5ml含有1.31M 3-氰基丙酸铵盐 (0.1mole的3-氰基丙酸铵盐，通过酶水解琥珀腈产生；实施例20)的 含水反应混合物，然后加19.4ml浓缩的氢氧化铵(29.3％NH3，0.3mole NH3)，用蒸馏水把最终体积调整到100ml。3-氰基丙酸铵盐和所加的氢 氧化铵的最终浓度分别为1.0M和3.0M。往产生的溶液中加入0.99g(10 重量％/重量的3-氰基丙酸)的促铬Raney镍(Grace Davison Raney2400 活泼金属催化剂)，把产生的溶液转移到装备有Dispersimax涡轮型推进 器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。给反 应器通入氮气后，将反应器中的内含物在500psig氢气下以1000rpm搅 拌，并在70℃加热4.5h，然后180℃再加热5h。用气相色谱分析显示2 -吡咯烷酮(Pyrrolidinone)的产量为91.0％，没有剩余3-氰基丙酸铵 盐。

                      实施例46

            来自4-氰基丁酸铵盐的2-哌啶酮

重复实施例22中所述的步骤。4.0h后，4-氰基丁酸铵盐和戊二酸 二铵盐的HPLC产量分别为91.7％和7.5％，没有剩余戊二腈。4-氰基 丁酸铵盐在离心和过滤过的反应混合液中的最终浓度为1.42M。在100ml 刻度量筒中放入70.6ml(0.100mole的4-氰基丁酸铵盐)的过滤含水产 物混合物，然后加19.4ml的浓缩的氢氧化铵(29.2％NH3，0.3mole NH3)， 用蒸馏水把最终体积调整到100ml。4-氰基丙酸铵盐和所加的氢氧化铵 最终浓度分别为1.0M和3.0M。往产生的溶液中加入1.13g(10重量％/ 重量的4-氰基丁酸)的促铬Raney镍(Grace Davison Raney2400活 泼金属催化剂)，把产生的溶液转移到装备有Dispersimax涡轮型推进器 的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal搅拌高压锅中。 给反应器通入氮气后，将反应器中的内含物在500psig氢气下以1000rpm 搅拌，并在70℃加热3.5h。用气相色谱分析显示2-哌啶酮的产量为29.7 ％，没有剩余4-氰基丁酸铵盐。把温度提高到180℃，再加热2h，接着 用气相色谱分析样品显示2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)的产量为93.5％。

                       实施例47

         来自4-氰基戊酸铵盐的5-甲基2-哌啶酮

将含有1.85M 4-氰基戊酸铵盐(0.1mole的4-氰基戊酸铵盐，通 过酶水解2-甲基戊二腈产生；实施例9，来自反应#5的过滤产物混合 液)、5.6g的29％氢氧化铵水溶液和44ml D.I.水的50毫升混合水溶液 转移到300ml高压锅中。往该溶液中加入0.73g(3重量％，以4-氰基 戊酸为主)在碳上的4.5％Pd/0.5％Pt催化剂。密封高压锅，用氮气清洗 三次，接着在100psig氢气和缓慢搅拌下加热至160℃。160℃时，把压力 提高到800psig，开始最大速度的搅拌。3小时后，冷却反应器，排气， 用氮气清洗。产物混合液气相色谱分析显示4-氰基戊酸的转化率为96％ 且5-甲基-2-哌啶酮的产量为95.5％(99.5％选择性)。

                      实施例48

      来自4-氰基戊酸铵盐的1，5-二甲基-2-哌啶酮

将含有1.85M 4-氰基戊酸铵盐(0.2mole的4-氰基戊酸铵盐，通 过酶水解2-甲基戊二腈产生；实施例9，来自反应#5过滤产物混合液)， 和14g(0.2mole)的40％甲胺水溶液的100毫升混合水溶液转移到300ml 高压锅中。往该溶液中加入在碳上的4.5％Pd/0.5％Pt催化剂。密封高压 锅，用氢气清洗3次，在100psig氢气和缓慢搅拌下加热反应液。在反应 温度下，提高压力，开始最大速度的搅拌。一定的反应时间后，冷却反应 器，排气，用氮气清洗。将气相色谱分析在不同的反应条件下几种操作的 产物混合液的结果总结如下：

温度  H2       装入的催化剂  时间   4-CPA       5-DMPD    5-MPPD

(℃)  (psig)    (wt％)        (h)    (％转化率)  (％产量)  (％产量)

175   300     7.4       3      99       67.8      28.2

160   500     10        2      99       68.6      28.1

145   500     10        2      93       65.2      26.4

                      实施例49

      来自4-氰基戊酸铵盐的1，5-二甲基-2-哌啶酮

用不同的在碳上的Pd催化剂，4-氰基戊酸铵盐的氢化作用在5ml 玻璃振摇器试管中在800psig下进行。将1.85M(7mmoles)5-氰基戊酸 水溶液(来自实施例9、反应#5的过滤产物混合液)、0.88g(11.4mmoles) 40％甲胺和选自5％Pd/C及4.5％Pd/0.5％Pt/C的催化剂共4毫升转移到 试管中并进行反应3小时。冷却到25℃后，将气相色谱分析在不同反应 条件下产生的产物混合液的结果总结如下：

温度                         装入的催化剂    时间    4-CPA        5-DMPD    5-MPPD

(℃)    催化剂               (wt％)          (h)     (％转化率)   (％产量)  (％产量)

160     5％Pd/C              1.2             2       99           91.8      5.0

160     4.5％Pd/0.5％Pt/C    0.7             2       99           94.0      3.1

150     5％Pd/C              0.7             2       99           92.5      2.2

本申请系1997年5月7日提交的、申请号为97194702.3的、发明 名称与本申请相同的申请的分案申请。