很久以来，为获得更好味道的豆乳已开始使用微生物发酵豆乳， 使其具有特有的豆的气味和草的味道。在上述发酵处理的过程中，已使 用了多种微生物例如乳酸菌、酵母、纳豆芽孢杆菌、醋酸菌和曲霉属的 微生物。已有报道在大多数情况下这种处理能获得具有良好味道的发酵 产物。
已知豆乳可促进属于双歧杆菌属的微生物(在下文称为双歧杆菌) 的增殖，这可能是由于豆乳中含有大豆寡糖(Yoichi KOBAYASHI等， “肠道菌群和食物因素”，p69，1984，由Gakkai Shuppan中心出版)。
同时，关于双歧杆菌的用途进行了大量研究。例如，已证实活菌 制剂(短双歧杆菌)的给药在难治愈的小儿腹泻中表现出疗效，并且其可 能的机制可归因于肠道菌群的改善。并且，已发现将制剂对成人给药时 导致粪便中腐败产物及产生腐败产物的细菌的减少。此外，还阐明了双 歧杆菌的免疫活化效应。因此，认为双歧杆菌通过改善肠内环境而有利 于人体健康(由Tomotari MITSUOKA编辑，“双歧杆菌研究”，1994)。
因此，已开发出多种使用双歧杆菌的产品，同时已尽力开发发酵 的豆乳产品，其中含有大量双歧杆菌并在产品的整个销售期间维持活菌 计数(高存活率)。
然而，由于双歧杆菌经过糖代谢产生摩尔比为1∶1.5的乳酸和醋 酸，双歧杆菌易于因自身产生的酸而死亡。因此，双歧杆菌生长到一定 的活菌计数或更高并维持其活菌计数是困难的。
为解决上述问题，已提出使用高存活率的双歧杆菌(日本专利号 2563197)。
然而，即使所使用的双歧杆菌与传统的双歧杆菌相比表现出更高 的存活率，但所使用的细菌仍不能增殖到1×109细胞/ml或更高的水平， 并且在贮存14天后维持至少1×108细胞/ml的活菌计数是困难的。
因此，本发明的目的是提供在贮存一定时期后仍能保持一定水平 的活菌计数的双歧杆菌。本发明的另一个目的是提供含有双歧杆菌的发 酵豆乳。
发明的公开
考虑到前面所述的内容，本发明的发明人已进行了认真的研究， 并已发现了满足上述对活菌计数要求的双歧杆菌同时也发现了可通过使 用双歧杆菌生产味道好并具有高活菌计数的发酵豆乳。已经在这些发现 的基础上完成了本发明。
因此，本发明提供刚在豆乳培养基中培养之后表现出1×109细胞/ml 或更高的活菌计数并在于10℃贮存14天后维持1×108细胞/ml或更高的 活菌计数的短双歧杆菌。本发明还提供含有双歧杆菌的发酵豆乳。
实施本发明的最佳方式
本发明的短双歧杆菌在豆乳培养基中表现出显著高的存活率，并 在生长至1×109细胞/ml的水平之后，甚至在10℃下贮存14天后仍能维 持1×108细胞/ml或更高的活菌计数。
属于短双歧杆菌的微生物的例子包括名为YIT 4065并按照布达佩 斯条约作为FERM BP-6223(原始保藏日：1996/2/29)保藏在国立生命 科学和人体技术研究所，工业科学和技术局(地址：1-3，Higashi 1-chome， Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-0046日本)的微生物。以下列方式产生 该细菌。
将培养的短双歧杆菌YIT 4006细胞(按照布达佩斯条约作为 FERM BP-752(原始保藏日：1977/1/28)保藏在发酵研究所，工业科学 和技术局，国际贸易和工业部(地址：1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba- shi，Ibaraki-ken 305-0046日本))(1.5×109细胞)悬浮于50mM磷酸盐 缓冲液(pH7.0)中，并将等量的5μg/ml NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基 胍)溶液与悬浮液混合。获得的混合物在37℃保持30分钟。通过洗涤 去除NTG之后，将获得的突变处理的细胞接种到14％全乳粉培养基(酵 母提取物含量：0.03％)中并于37℃进行培养直至pH达到4.5-4.7。在 培养产物中加入8％的细滴溶液，并将混合物倒入试管中。每个试管用 丁基橡胶塞封住并贮存于10℃。通过使用改良的Rogosa琼脂培养基在 一段时间测定活菌计数。当活菌计数达到约1％时，将贮存的产物再次 接种到14％的全乳粉培养基(酵母提取物含量：0.03％)中并于37℃培 养直至pH达到4.5-4.7。向培养产物中加入糖之后，再次贮存混合物。 将此贮存-计数-接种-培养的过程重复4次，然后从这样获得的发酵产物 中分离得到表现出改善的存活性的短双歧杆菌YIT 4065菌株。
除了上述的存活特性以外，短双歧杆菌YIT 4065还表现出下列真 菌学特性。
通过在光学显微镜下进行的观察证明细菌是多形性的，即杆状的 或有分枝的，并且是革兰氏阳性的。当细菌在改良的Rogosa琼脂培养 基中进行厌氧培养时，形成白色而光滑的菌落，而当将它在乳培养基中 进行相似的培养时，形成的乳酸和醋酸使乳凝结。过氧化氢酶的活性是 阴性的。
细菌对核糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、 蜜二糖、绵子糖、松三糖和水杨苷表现出阳性的发酵活性，而对阿拉伯 糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇和菊粉表现出阴性的发酵活性。
本发明的发酵豆乳可通过使用上述短双歧杆菌发酵豆乳来生产。
本发明中作为原料的豆乳优选地从未经处理的含油和脂肪的大 豆、脱脂大豆、大豆薄片等中产生。脱脂大豆可作为原料。
豆乳可通过下列方法生产：将原料浸入水中；加入选择性地含有 重量百分比为0.5-1.0(在下文简称为％)的碳酸纳的热水碾碎；去除 okara(豆腐渣)；并加热消毒。然而，豆乳的生产并不限于此方法，并 且用于本发明的豆乳可用任何方法生产。
在豆乳中，可以添加细菌生长所需的营养物质，如掺入食物中的 糖，例如蔗糖、葡萄糖、果糖或转化糖；肉膏；蛋白胨；酵母提取物； 和肽以便用细菌进行后处理。此外，为实现靶细菌中的最佳pH，也可将 掺入食物中的酸如柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸和醋酸加入豆乳中。
对发酵方法没有特别的限制，并且发酵可在典型的条件下进行。 例如，当将短双歧杆菌YIT 4065接种到上述豆乳中时，可在37℃下进 行培养约20-22小时直至pH达到约4.5-4.7。发酵可在按照培养条件适 当选择的条件如静置培养、旋转培养、振荡培养和好气培养下进行发酵。
尽管本发明的发酵豆乳可以通过将短双歧杆菌加入豆乳中生产， 但也可进一步加入其它双歧杆菌或其它微生物。这样的微生物的例子包 括细菌如乳杆菌、乳球菌、链球菌、明串珠菌、芽孢杆菌、醋杆菌和葡 糖杆菌；酵母如酵母、假丝酵母、红酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、色串 孢和接合酵母；及丝状真菌如曲霉、散囊菌、红曲霉、分枝菌、脉孢菌、 青霉和根霉。
由此获得的本发明的发酵豆乳可原样作为食物或可制成口服药 物，并可进一步含有任何通常使用的添加剂。这些添加剂的例子包括糖 化物、蛋白、脂肪和油、维生素、植物提取物、动物提取物；细菌提取 物；香料和颜料。并且，本发明的发酵豆乳可加工成任何形式，如液体、 糊状物、蛋糕或固体。除了豆乳饮料以外，发酵豆乳还可加工成多种食 品如豆乳酸乳酪、豆乳布丁和豆腐。
实施例
下面以实施例的方式更详细地描述本发明。
实施例1
豆乳(Shikoku Kakoki的产品，固体含量12.0％，粗脂肪2.48％， 粗蛋白4.71％)在100℃下用蒸汽消毒90分钟。
通过使用在厌氧条件下生产的豆乳进行数次传代，从而产生如图 1所示的两个短双歧杆菌接种体和两个长双歧杆菌接种体。每个接种体 以0.5-2％的量接种到上述的消毒豆乳中，并培养至pH达到4.6。
当将葡萄糖以5％的量加入发酵产物中后，将混合物在厌氧条件 下贮存于10℃。计数存活的细胞。
两个短双歧杆菌样品在发酵产物制备之后不久表现出1×109细胞 /ml的活菌计数。但是，短双歧杆菌ATCC 15700在贮存14天后未能维 持1×108细胞/ml的活菌计数。
同时，两个长双歧杆菌样品也未能保持活菌计数。
本发明的短双歧杆菌YIT 4065(FERM BP-6223)在贮存之后保 持了1×108细胞/ml或更高的活菌计数，并提供了具有高活菌计数和高 存活率的发酵豆乳。
实施例2：
将豆乳(Shikoku Kakoki的产品，固体含量12.0％，粗脂肪 2.78％，粗蛋白5.03％)(7L)置于10-L的发酵罐中并在100℃下用蒸汽 消毒90分钟。
通过使用在厌氧条件下生产的豆乳进行数次传代，从而产生短双 歧杆菌接种体。每个接种体以0.5％的量进行接种，并培养至pH达到5.3。
当将含有天冬苯丙二肽酯(0.13％)和柠檬酸(1.1％)的糖浆溶液 以5％的量加入发酵产物中后，将混合物在厌氧条件下贮存于10℃。计 数存活的细胞并检测味道。
本发明的短双歧杆菌YIT 4065在10℃贮存14天之后保持了1×108 细胞/ml或更高的活菌计数，并且通过使用相同的双歧杆菌生产的发酵 豆乳具有很好的味道。
工业实用性
本发明的短双歧杆菌起初表现出1×109细胞/ml或更高的活菌计数 并在10℃下贮存14天后能维持1×108细胞/ml或更高的活菌计数，因此 是能通过改善肠内环境促进人体健康的非常好的双歧杆菌。
本发明的使用短双歧杆菌的发酵豆乳含有高浓度的双歧杆菌，它 可具有多种可能的用途，并在贮存过程中有利地维持活菌计数而没有剧 烈的活菌计数的大幅度下降。