生产L－苯丙氨酸的方法

本发明涉及生产L-苯丙氨酸的方法，具体而言，涉及属于嗜甲 基菌属并且能够生产L-苯丙氨酸的细菌以及采用属于嗜甲基菌属的 细菌生产L-苯丙氨酸的方法。

作为采用微生物发酵来生产L-苯丙氨酸的方法，那些采用属于 埃希氏菌属的重组细菌的方法(日本专利申请公开号56-1890，57- 170184，58-103398，61-92565和1-104160以及国际公开号WO 87/00202)已为人熟知。作为生产L-苯丙氨酸或L-酪氨酸的方法，人 们采用属于棒杆菌属的突变体(日本专利申请公开号61-128897)，并 且那些采用属于棒杆菌属的重组细菌的方法(日本专利申请公开号60- 34197，60-24192，61-260892和61-124375)已为人熟知。

然而，通过使用属于嗜甲基菌属的细菌来生产L-苯丙氨酸则不 为人所知。

本发明的一个目标是提供能够生产L-苯丙氨酸的细菌以及通过 使用所述细菌来生产L-苯丙氨酸的方法。

本发明人发现：对苯丙氨酸类似物具有抗性的属于嗜甲基菌属 的细菌在生产L-苯丙氨酸方面具有很强的能力。基于这个发现，实 现了本发明。

本发明提供属于嗜甲基菌属的细菌，它能生产L-苯丙氨酸并且 对苯丙氨酸类似物具有抗性(此后也称为“本发明细菌”)。

优选本发明细菌对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性。

优选本发明细菌对DL-对-氟苯丙氨酸具有抗性。

本发明细菌优选通过从属于嗜甲基菌属的细菌中选择对苯丙氨 酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对于每种苯丙 氨酸类似物和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。

更优选本发明细菌对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和L-苯 丙氨酸具有抗性。

更优选本发明细菌通过从属于嗜甲基菌属的细菌中选择对DL- 对-氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得， 其中对于每种DL-对-氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸，以 任意次序至少实施一次所述选择。

优选本发明细菌对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸 和L-苯丙氨酸具有抗性。

更优选本发明细菌通过从属于嗜甲基菌属的细菌中选择对DL- 对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸和L-苯丙氨酸具有抗性的菌 株来获得，其中对于每种DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂 酸和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。

本发明细菌优选为食甲基嗜甲基菌。

本发明还提供生产L-苯丙氨酸的方法，其包括以下步骤：

在培养基中培养本发明细菌从而在培养物中生成并富集L-苯丙 氨酸，和

从所述培养物中回收L-苯丙氨酸(此后也称为“本发明方法”)。

<1>本发明细菌

本发明细菌为属于嗜甲基菌属的细菌，它能够生成L-苯丙氨酸 并且对苯丙氨酸类似物，优选对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有 抗性。

属于嗜甲基菌属的细菌包括食甲基嗜甲基菌。

在培养基中培养所述细菌时，生成L-苯丙氨酸的能力是指在所 述培养基中富集大量L-苯丙氨酸的能力。通常它指在如下面实例所 述的条件下富集不小于0.5克/升L-苯丙氨酸的能力。

苯丙氨酸类似物的实例有DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、 β-氨基-β-苯基丙酸、邻-氟苯丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、β-3-噻吩丙氨 酸、β-2-呋喃丙氨酸、β-3-呋喃丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、对氨基苯 丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、α-氨基-β-苯基乙磺酸盐、β-2-吡咯丙氨酸、 1-环戊烯-1-丙氨酸、1-环己烯-1-丙氨酸、β-4-吡啶丙氨酸、β-4-吡唑 丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、环己基丙氨酸、邻-氯苯丙氨酸、间-氯苯 丙氨酸、对-氯苯丙氨酸、邻-溴苯丙氨酸、间-溴苯丙氨酸、对-溴苯 丙氨酸、β-4-噻唑丙氨酸等。

对苯丙氨酸类似物具有抗性是指在一定量的苯丙氨酸类似物的 存在下(此时野生类型的菌株如菌株AS-1不能生长)所述细菌能够生 长。所述量取决于苯丙氨酸类似物的种类。在DL-对-氟苯丙氨酸的 情况下，在如下所述实施例描述的条件下它通常为2克/升，在间氟 苯丙氨酸的情况下，在如下所述实施例描述的条件下它通常为1克/ 升。

优选本发明细菌对至少两种苯丙氨酸类似物具有抗性。例如， 优选它对DL-对-氟苯丙氨酸和间-氟苯丙氨酸具有抗性。

对L-苯丙氨酸具有抗性是指在一定量L-苯丙氨酸的存在下(其量 使野生类型的菌株(如菌株AS-1)不能生长)，所述细菌可以生长。在 下述实施例的所述条件下其量通常为8克/升。

优选本发明细菌对较高浓度(如0.1M)的L-苯丙氨酸具有抗性。

本发明细菌可以通过依次赋予属于嗜甲基菌属的细菌所需的抗 性来获得。赋予苯丙氨酸类似物抗性和L-苯丙氨酸抗性的次序不受 限制并且可以任意次序实施所述赋予。

获得对苯丙氨酸类似物具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌和对 L-苯丙氨酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌的方法将在以下进行解 释说明。

通过在含有生长抑制浓度的苯丙氨酸类似物的基本培养基中培 养属于嗜甲基菌属的细菌和选择生长菌株，可以获得对苯丙氨酸类 似物具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌。

采用一种苯丙氨酸类似物或更多种苯丙氨酸类似物可以实施对 苯丙氨酸类似物具有抗性的菌株的选择。可以对一种苯丙氨酸类似 物进行一次或多次菌株选择。

加入所述培养基的苯丙氨酸类似物的量取决于苯丙氨酸类似物 的类型，但对于DL-对-氟苯丙氨酸而言，优选不小于2克/升。在选 择前可以对属于嗜甲基菌属的细菌进行突变处理。可以通过紫外线 照射或通过用通常用于人工诱变的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝 基胍(NTG)或亚硝酸等进行处理来实施突变。

通过在含有生长抑制浓度的L-苯丙氨酸的基本培养基中培养属 于嗜甲基菌属的细菌和选择生长菌株，可以获得对L-苯丙氨酸具有 抗性的属于嗜甲基菌属的细菌。此处的生长抑制是指慢速生长或停 止生长。可以一次或多次选择菌株。培养基中L-苯丙氨酸的浓度没 有特别的限制，但就举例而言不小于0.05M，优选不小于0.1M。在 进行选择前，可以如上述相同的方法对属于嗜甲基菌属的细菌进行 突变处理。

由上面获得的对L-苯丙氨酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细 菌，可以在L-苯丙氨酸(其浓度使得亲株不能生长)的存在下进行生 长。

优选本发明细菌对肉桂酸具有抗性。

对肉桂酸具有抗性是指细菌在野生菌株(如菌株AS-1)不能生长 的肉桂酸量的存在下可以生长。在下述实施例所述的条件下其量通 常为50毫克/升。

对肉桂酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌可以通过与对苯丙 氨酸类似物具有抗性的细菌的相似的方式来获得。赋予肉桂酸抗性、 苯丙氨酸抗性和L-苯丙氨酸抗性的次序没有限制并且可以任意次序 进行赋予。

L-苯丙氨酸涉及L-苯丙氨酸生物合成的几个调整步。因此引起 L-苯丙氨酸抗性的单突变可能有利于提高L-苯丙氨酸的生产率，然 而，优选通过两次或更多次的突变使更多的调整脱敏。尽管L-苯丙 氨酸的生产率较低，但具有单变突的属于嗜甲基菌属的细菌可以用 作繁殖L-苯丙氨酸生产菌株的起始源。

本发明细菌可以通过常规突变处理或基因工程技术来提高用于 L-苯丙氨酸生物合成路线的一种或多种酶的活性。

例如，通过在属于嗜甲基菌属的细菌中提高丙酮酸磷酸烯酯的 生产能力可以改进L-苯丙氨酸的生物合成(国际公开号WO 97/08333)。

通过改进脱敏的分支酸酯变位酶-预苯酸酯脱水酶基因(日本专利 申请公开5-236947和62-130693)，和/或脱敏的3-脱氧-D-阿拉伯- hepturosonic acid 7-磷酸酯合酶基因(日本专利申请公开5-236947和 61-124375)来提高L-苯丙氨酸的生产率。

<2>本发明方法

本发明方法是用来生产L-苯丙氨酸的方法，其包括在培养基中 培养本发明细菌，从而在培养物中生成并富集L-苯丙氨酸，并从培 养物回收L-苯丙氨酸。

本发明细菌的培养可以通过通常用于培养甲醇同化的微生物的 方法来实施。用于本发明的培养基可以为合成培养基或天然培养基， 只要所述培养基包括碳源和矿质营养素，以及其它有机微量营养素(如 果需要的话)。

如果将甲醇用作主要的碳源，可以较便宜地生产L-苯丙氨酸。 如果将甲醇用作主要的碳源，甲醇通常以0.001-30％(重量)的量加入 培养基。作为氮源，可以通过加入培养基来使用硫酸铵。此外，可 以使用少量的矿质营养素如磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁和 硫酸锰。

通常可以在需氧条件下(如摇动培养物、通风和搅拌培养物， pH5-9，温度20-40℃)实施所述培养。它通常在24-120小时内完成。

所述培养物包括细胞和培养基，并且优选培养基。

根据已知方法的组合如离子交换树脂法和沉淀法，从所述培养 物回收L-苯丙氨酸。

实施例

参考实施例对本发明进行详细描述。用于下面实施例的培养食 甲基嗜甲基菌和分析L-苯丙氨酸的方法如下所示：

<1>试管培养

1.接种培养

采用含有1％甲醇的121(Fe2)-培养基琼脂，使所述菌株在30℃ 的平板或斜面上生长48-72小时。随后将所述菌株接种至容量40毫 升试管中的121(Fe2)-培养基(含有2％的甲醇，用作接种培养基)。将 所述接种培养物在37℃的旋转摇床中培养18小时。

2.试管内发酵

在37℃、40毫升容量试管中的5毫升121(Fe2)-培养基(含有2％ 的甲醇和3％的碳酸钙)中实施L-苯丙氨酸生产者的培养。培养开始 后经过24小时，将另一份2％的甲醇加入并在37℃的旋转摇床中继 续所述培养48小时。

含有2％的甲醇和3％的碳酸钙的121(Fe2)-培养基(1升)的组成 如下：

K2HPO4.3H2O                   1.57g

KH2PO4                          0.62g

(NH4)2SO4                     3g

NaCl                              0.1g

MgSO4.7H2O                      0.2g

CaCl2                            0.025g

EDTA-Na2                         5mg

FeSO4.7H2O                      3mg

MnSO4.5H2O                      0.01mg

ZnSO4.7H2O                      0.07mg

Na2MoO4.2H2O                   0.01mg

H3BO3                           0.01mg

CoCl2.6H2O                      0.005mg

CuSO4.5H2O                      0.005mg

甲醇                              20ml(过滤灭菌)

CaCO3                  30g

                        pH 7.0

发酵管中培养基的初始体积：5ml

接种物量：10％

温度：37℃

搅拌：250rpm摇床。

<2>发酵肉汤中的L-苯丙氨酸的分析

1.样品制备

将发酵肉汤的样品在5415C型microfuge(Eppendorf)中离心15 分钟以除去细胞和碎屑。将上层清液用于高效液相色谱(HPLC)分析。

2.色谱测定L-苯丙氨酸

色谱系统包括30型HPLC泵(Gilson)和操作波长设为245nm的 2151型可变波长检测器(LKB)。采用带有1μl的内部样品环(internal sample loop)(Rheodyne)的7410型注射器将样品注入。采用实验室水 浴恒温器使所述柱恒温在45℃。

包括装填5μm的Separon C18吸着剂(Tessek)的150mm×3.9mm 玻璃柱的I.D.玻璃柱系统用于所有分离。洗脱液包括0.001M硫酸铜 的水/乙腈溶液(80/20(体积/体积))。

将发酵肉汤样品以13000×g离心5分钟并注入而不经进一步制 备。

采用960型界面和Nelson PC积分软件(PE Nelson)的IBM PC/AT 兼容数据站处理所述数据。采用外标法对峰进行计算。

实施例1形成能生产L-苯丙氨酸的食甲基嗜甲基菌突变菌株

<1>对DL-对氟苯丙氨酸、芳族氨基酸类似物具有抗性的突变 体的诱变和选择

对食甲基嗜甲基菌AS-1(NCIB 10515；ATCC 53528)菌株的DL- 对氟苯丙氨酸(一种芳族氨基酸类似物)的敏感性进行测试。在含有不 同浓度的DL-对氟苯丙氨酸的121(Fe2)-琼脂培养基中测试敏感性。 平板培养108c.f.u./ml的食甲基嗜甲基菌并在30℃下生长3天。1毫 克/毫升的DL-对氟苯丙氨酸完全抑制了所述细菌菌苔的生长。为了 选择抗所述类似物的突变体，将108的食甲基嗜甲基菌菌株接种至含 有2毫克/毫升DL-对氟苯丙氨酸的平板上。将一些N-甲基-N’-硝基- 亚硝基胍(此后缩写为NG)诱变剂晶体置于板的中央。在30℃下经过 4-5天后，对板进行分析。靠近NG诱变剂的细菌没有生长，但距其 3-4厘米处，抗所述类似物的突变体菌落生长。收集大的菌落并在采 用类似物DL-对-氟苯丙氨酸的相同培养基中进行纯化。如上所述， 培养食甲基嗜甲基菌的DL-对-氟苯丙氨酸抗性(此后缩写为pFpR)突 变体并对发酵培养基中L-苯丙氨酸的浓度进行测量。最佳的食甲基 嗜甲基菌的pFpR突变体第227号生成30毫克/升的L-苯丙氨酸，接 近1克/升的L-缬氨酸和0.2克/升的L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丙氨 酸。薄层色谱证实了HPLC分析的结果。

<2>在生长培养基中对高浓度的L-苯丙氨酸具有抗性的食甲基 嗜甲基菌突变体的诱变和选择

食甲基嗜甲基菌的DL-对-氟苯丙氨酸抗性突变体生成L-苯丙氨 酸，但是对高浓度的L-苯丙氨酸敏感(如果它存在于所述培养基中)。 如果加入琼脂化的121-培养基，0.1M的L-苯丙氨酸完全抑制食甲基 嗜甲基菌的pFpR突变体第227号的生长。

为了消除这种敏感性和增加菌株的生产率，对存在于生长培养 基中的高浓度L-苯丙氨酸具有抗性的突变体进行选择。作为用来选 择L-苯丙氨酸抗性突变体(此后缩写为pheR)的亲株，采用产生极少量 L-苯丙氨酸(30毫克/升)的食甲基嗜甲基菌第227号(pFpR突变菌株)。 所选的培养基为含有1％的甲醇和0.05M的L-苯丙氨酸的121(Fe2)- 琼脂培养基。如上所述实施由NG引起的诱变。在相同的培养基中对 L-苯丙氨酸抗性突变体菌落纯化几次并随后在没有0.05M的L-苯丙 氨酸的培养基中纯化。突变体中的pheR标记被稳定遗传并且在没有 选择压力下不会丢失。如上所述培养所选的食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR突变体并且测量发酵培养基中L-苯丙氨酸的浓度。具有对高浓 度L-苯丙氨酸有抗性的突变的最佳食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR突变 体第227-16号产生0.4克/升的L-苯丙氨酸。因此，作为在食甲基嗜 甲基菌的pFpR pheR突变体第227-16号中的第二次突变的pheR-突变 使L-苯丙氨酸的生产率提高了10倍以上：pFpR突变体(第227号)产 生30毫克/升的L-苯丙氨酸，双pFpR pheR突变体(第227-16号)产生 400毫克/升L-苯丙氨酸。

人们还发现：食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR突变体菌株第227-16 号除了对2克/升的DL-对-氟苯丙氨酸和0.05M的L-苯丙氨酸具有抗 性外，还对0.5克/升的间氟苯丙氨酸具有抗性。然而菌株第227-16 号表明在1克/升的间氟苯丙氨酸中只有轻微的生长。如上所述，经 过NG诱变后，将对1克/升间氟苯丙氨酸具有抗性的新突变体(此后 缩写为mFpR)从菌株第227-16号中分离出来。所得新的食甲基嗜甲 基菌pFpR pheR mFpR突变体菌株第227-16-10号产生如其前辈相同量 的L-苯丙氨酸(0.4克/升)。

经NG诱变后，如上所述将对更高浓度的L-苯丙氨酸(0.1M)具 有抗性的新的食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR mFpR pheRR突变体菌株第 227-16-10-11号(此后缩写为pheRR)从菌株第227-16-10号中分离出 来。pheRR突变体菌株在试管中产生0.5-0.7克/升的L-苯丙氨酸、0.3 克/升的L-缬氨酸、0.2克/升的L-亮氨酸和小于0.1克/升的L-异亮氨 酸、L-丙氨酸和L-谷氨酸。

经NG诱变后，如上所述将对肉桂酸(50毫克/升)(化学结构类似 L-苯丙氨酸)具有抗性的新的食甲基嗜甲基菌的pFpR-pheR-mFpR- pheRR-cinR突变体菌株第227-16-10-11-cin8号(此后缩写为cinR)从菌株 第227-16-10-11号中分离出来。所述cinR突变体菌株在试管中产生 0.8-0.9克/升的L-苯丙氨酸和0.6克/升的L-缬氨酸。

菌株第227，227-16，227-16-10，227-16-10-11和227-16-10-11- cin8号已于2000年2月10日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中 心(VKPM)(根据布达佩斯协议条款于2000年7月18日转变为保藏)， 其登记号分别为VKPM B-7909、VKPM B-7910、VKPM B-7911、VKPM B-7912和VKPM B-7913。