[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株作为嗜铁素高产菌株的应用。

[0002] 铁是所有生命体必需元素之一，在生物生长代谢过程中起着重要作用。尽管在多数土壤中全铁含量丰富，但能被植物吸收利用的可溶性铁含量很低，其溶解度受土壤pH值的影响(pH 7.4时溶解度仅为10-18mol/L)，中性土壤中主要以难溶性的氧化高铁等形式存在，常常成为限制生命体生长的营养元素。因此，许多微生物合成具有螯合铁离子能力的嗜铁素以获得所需要的铁离子。嗜铁微生物可通过分泌嗜铁素提高环境中铁的生物有效性，从而促进植物的生长，还可通过与病原微生物竞争环境中有限的铁离子，达到控制植物病害的目的。

[0003] 嗜铁素(siderophore)是一类由微生物在低铁条件下合成的小分子量的，能特异地螯合Fe3+的一种螯合因子，合成后被分泌到微生物的细胞外或细胞表面获取Fe3+，或者将铁变为可溶形式供给微生物利用。目前已发现500多种化学结构不同的嗜铁素，根据螯合基团的化学特性不同，可分为三大类：氧肟酸型(Hydroxamate)、儿茶酚型(Catechol，即邻苯二酚)和柠檬酸型(α-hydroxycarboxylic)(也称α-羟基羧酸型)。

[0004] 洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)是一种广泛存在于土壤、水和植物表面的革兰氏阴性菌。1950年Burkholder首次报道该菌可引起洋葱鳞茎腐烂，称为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)。1992年Yabuuchi等正式将该菌及其它6个属于rRNAII群的假单胞菌(P.solanacerum、P.pickettii、P.gladioli、P.mallei、P.pseudomonas和P.caryophylli)归为一个新属，即伯克氏菌属(Burkholderia)。随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德氏菌已不仅只是作为一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克霍尔德氏菌复合型(Burkholderia cepacia complex，简称Bcc)。目前已报道的Bcc包括10个不同的基因型。

[0005] 嗜铁素具有防止病虫害、促进植物生长的作用，同时也是环境修复的一种新工具。嗜铁素作为一种铁结合能力极强的物质，在铁吸收干预方面具有巨大的应用前景。目前，去铁灵作为一种嗜铁素，已被开发作为地中海贫血病的一种辅助治疗药物。嗜铁素的种类繁多，化学结构非常复杂，人工化学合成的难度大、步骤多、产率低、成本很高。通过生物工程发酵产生嗜铁素的研究国内外已经开始起步，Calvente等人报道了利用红酵母发酵产生嗜铁素，Sarma等也报道了通过荧光假单胞菌发酵生产嗜铁素。

[0006] 本发明的目的是提供一种吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株作为嗜铁素高产菌株的应用。

[0007] 本发明提供的菌株，经分子鉴定为吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)，隶属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Bcc)中的基因型IX，命名为吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，编号为M209028，保藏日期为2009年2月18日。吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株作为嗜铁素高产菌株的应用。

[0008] 实验证明，吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株产嗜铁素能力较高，产生的嗜铁素含有：儿茶酚型嗜铁素、三羟基氧肟酸型嗜铁素。附图说明

[0009] 图1为JK-SH007在CAS检测平板上的生长形态图。

[0010] 实施例1

[0011] 1、培养基配方：

[0012] 马铃薯葡萄糖培养基(PDB)(真菌活化用)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，121℃，20min灭菌。

[0013] 马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)(真菌拮抗平板)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15-18g/L，pH7.0，121℃，20min灭菌。

[0014] 营养肉汤培养基(NB)(细菌活化用)：牛肉浸膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.2，121℃，20min灭菌。

[0015] 营养肉汤固体培养基(NA)(细菌拮抗平板)：牛肉浸膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15-18g/L，pH7.2，121℃，20min灭菌。

[0016] 蔗糖-天冬酰胺培养基(MSA)(嗜铁素筛选培养基)：蔗糖20g/L，天冬酰胺2g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃，20min灭菌。

[0017] CAS蓝色检测液：

[0018] 溶液A：将60.5mg铬天青S溶于50mL去离子水，加入10mL1mmol/L的FeCl3溶液。

[0019] 溶液B：将72.9mg十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL去离子水中，45℃水浴加热溶解。

[0020] 将溶液A缓慢倒入溶液B中，边倒边搅拌，使溶液A与溶液B混合均匀，得到CAS蓝色液体检测液，121℃，20min灭菌。

[0021] MSA-CAS双层检测平板制备：在液体MSA培养基中加入2％的琼脂成固体培养基灭菌，当温度降低到50℃时，每100mL固体MSA加入10mL CAS蓝色检测液，沿着三角瓶壁加入，混合均匀。然后按每皿30mL倾注于培养皿中。

[0022] 2、MSA-CAS混合平板检测产嗜铁素能力

[0023] 将单菌落接种于MSA-CAS混合平板检测，30℃，200rpm振荡培养过夜，检测嗜铁圈。

[0024] 图1所示为JK-SH007在MSA-CAS双层检测平板上的生长形态，从图中可见明显嗜铁圈。

[0025] 3、嗜铁素发酵液制备

[0026] 单菌落接种于NB培养基，30℃，pH 7，1/2通气量，培养过夜，按照1％的接种量转接到20mLMSA液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养24h，得发酵液。

[0027] 4、产嗜铁素能力检测：

[0028] 上述发酵液离心过滤，取滤液，与等体积CAS溶液混合，室温下静置1h后，测定OD680，通过SU％＝(Ar-As)/Ar，计算出嗜铁素的活性单位；通过As/Ar来估计出产生嗜铁素的能力，As/Ar从1.0-0之间以0.2为间隔，每减小0.2增加一个“+”，一般产嗜铁素能力较高(+++)的细菌，其As/Ar低于0.5，(其中Ar代表等体积的MSA培养基与CAS溶液混合，室温下静置1h后OD680，As代表等体积的菌株发酵液上清与CAS溶液混合，室温下，静置1h后OD680)，测三次，取平均。

[0029]

[0030] 5、嗜铁素类型的鉴定

[0031] (1)Arnow方法(检验儿茶酚型嗜铁素)：

[0032] 上述发酵液10000rpm离心5min，取上清。

[0033] 取1mL上清与1mL 0.5MHCl、1mL钼酸-亚硝酸钠(10g亚硝酸钠和10g钼酸钠溶于少量水后加水至100mL)、1mL 1MNaOH混合，然后添加1mL水至体积为5mL，如果有儿茶酚型嗜铁素存在，该混合液的颜色会变成红色，在1h内测定该混合液的OD510。颜色越深，OD510值越大，表明儿茶酚型嗜铁素的含量越大。

[0034] 实验结果：混合后溶液为粉色透明，说明有少量儿茶酚型嗜铁素存在。

[0035]

[0036] (2)羧酸型嗜铁素检测方法(检验羧酸型嗜铁素)：

[0037] 取1mL上清与1mL250μM CuSO4和2mL0.2M pH4.0醋酸盐缓冲液混合后，添加1mL水至体积为5mL，测定在190nm-400nm的光吸收。如果有羧酸型嗜铁素存在，则该混合液在190nm-280nm有最大光吸收。

[0038] 实验结果：在190nm-280nm处没有特征吸收峰，说明没有有羧酸型嗜铁素存在。

[0039] (3)FeCl3方法(检验氧肟酸型嗜铁素)：

[0040] 取1mL上清液200μL 100mM FeCl3混合，如果有三羟基氧肟酸嗜铁素存在，则混合液会变成桔黄色；如果有二羟基氧肟酸存在，则混合液混变成粉红色。

[0041] 实验结果为桔黄色，说明有三羟基氧肟酸嗜铁素存在。

[0042] 6、分析嗜铁素对病原菌的抑制作用

[0043] 6.1牛津杯法测定嗜铁素抑菌作用

[0044] 将上述发酵液10000rpm离心5min，取上清，制备嗜铁素粗提液，作为嗜铁素制剂。利用牛津杯方法：将已灭菌的NA培养基倒入培养皿15mL，冷却凝固，涂布1mL金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌等二种指示菌，培养基表面放牛津杯，轻轻加压，令其与培养基接触无空隙，牛津杯中加200μL嗜铁素制剂，30℃培养过夜，测定抑菌圈的大小。

[0045]

[0046] 6.2嗜铁素对指示菌菌丝生长影响的研究

[0047] 将上述发酵液10000rpm离心5min，取上清，制备嗜铁素粗提液，作为嗜铁素制剂。然后以0％、10％、20％和30％的比例，加入到3％接种量黑曲霉、金黄壳囊孢、拟茎点霉和七叶树壳梭孢的液体培养基中，采取液体共培养方法，观察不同嗜铁素制剂的添加量，对黑曲霉和杨树溃疡病病原菌生长的抑制作用。48h后将发酵液抽滤，烘箱干燥称量菌丝体的重量。

[0048]

[0049] 抑菌率＝(对照菌丝干重-添加JK-SH007上清的菌丝干重)/对照菌丝干重。