[0001] 本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种不动杆菌及其在铜污染土壤修复上的应用。

[0002] 铜具有很好的导电、导热和延展性，在电子元件、电线管材等方面应用广泛。因此在众多金属矿产中，铜矿资源的开发历史悠久，但不合理的铜矿开采和冶炼等工业活动导致“三废”的产生，大量的含铜化合物进入矿区周边土壤，成为其中主要的污染物，严重破坏了该区域的环境质量，对生态和人体健康造成了极大的危害。治理包括铜在内的重金属污染迄今仍是世界各国环境热点研究问题之一。

[0003] 目前，土壤重金属污染治理的方法包括工程方法、化学方法、生物方法等。工程方法虽然能够通过换土、淋洗、热处理等措施在较短时间内降低土壤重金属的浓度，但所需设备复杂、费用高昂，容易造成二次污染。化学方法如添加改良剂虽能有效抑制土壤重金属活性，但容易对土壤理化性状如孔隙度、酸度、持水量等产生不利影响。生物方法则是通过生物本身的代谢过程对土壤重金属进行吸收、吸附、沉淀、转化等，从而减少重金属对其他生物的危害，阻断重金属进入食物链，达到无害化的目的。

[0004] 铜矿环境中存在着多种抗重金属的生物资源，其中抗铜细菌得到了极大关注，其数量多、生长快，已成为近年来土壤铜污染生物修复研究的主要对象。在经过分离、培养和驯化后，这些抗铜菌种能与适当的工艺相结合，构建出高效修复土壤重金属污染的技术体系，在包括铜矿在内的矿山环境整治和生态恢复方面具有良好的应用前景。

[0005] 本发明要解决的技术问题是通过抗铜菌种的分离、培养和鉴定，从铜矿周边土壤中筛选出能耐受高浓度铜的不动杆菌，利用该菌株显著增加培养介质和土壤pH值、降低土壤有效铜的特性。

[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供上述不动杆菌在铜污染土壤修复上的应用。将其应用于铜污染土壤修复，降低治理成本，增强修复效果，为铜矿周边土壤环境的管理和利用提供对策。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0008] 一种不动杆菌，其分类命名为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学；邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M 2016576，保藏日期为2016年10月18日。上述菌株是2016年6月发明人从安徽省马鞍山境内铜矿土壤中分离、筛选得到的一株耐高浓度铜的菌株。

[0009] CCTCC NO：M 2016576菌株的筛选包括如下步骤：

[0010] 1.土壤细菌的提取：取1g铜污染土壤添加到9mL无菌水中悬浮，培养条件30℃，摇床速度180r/min，培养24h，得到细菌培养液。

[0011] 2.耐铜细菌的筛选：配置细菌基础培养基(LB)，其中添加硫酸铜溶液使铜浓度达到100mg/L，灭菌，冷却后得到含铜LB固体培养基，取100μL细菌培养液涂布接种于固体平板上，待菌落长出。按上述方法制备含有200mg/L和300mg/L铜浓度的LB固体培养基，根据之前平板上菌落的形态和颜色等性状，挑取菌落划线依次接种于200mg/L和300mg/L的含铜固体平板培养基上，从形成的菌落中得到耐铜细菌。

[0012] 3.菌株的纯化：从含有300mg/L铜浓度的LB固体培养基中挑取细菌，划线接种到不含金属离子的LB固体培养基上，再进行多次划线，直到获得单菌落。

[0013] CCTCC NO：M 2016576菌株具有下述性质：

[0014] 1.形态特征

[0015] 经革兰氏染色和显微镜观察，该菌株为革兰氏阴性，杆状(图1、图2)。LB固体平板上30℃培养24h，菌落呈白色，圆形，边缘整齐，表面光滑(图3)。

[0016] 2.16S rRNA序列分析

[0017] 采用PCR扩增、测序等方法，可知不动杆菌CCTCC NO：M 2016576的16S rRNA序列长度为1400bp，如SEQUENCE LISTING所示。将测得序列在NCBI数据库比对分析，确定细菌分类信息(图4)。选取所得序列，采用MEGA 6.0软件对其进行系统发育分析，构建系统进化树(图5)。结果表明，菌株CCTCC NO：M 2016576与不动杆菌属(Acinetobacter sp.KO14-1)同源性达100％，再结合以上形态特征，将CCTCC NO：M 2016576鉴定为不动杆菌。

[0018] 3.生理生化特征，详见表1。

[0019] 表1

[0020]

[0021] 注：+表示阳性，-表示阴性。

[0022] 上述不动杆菌在铜污染土壤的生物修复中的应用也在本发明的保护范围之内。

[0023] 其中，所述的铜污染土壤的铜浓度为125～18100mg/kg。

[0024] 有益效果：从实施例的结果可知，本发明的不动杆菌属(Acinetobacter sp.)生长迅速(20h之内进入对数期)，具有较强的耐铜(能在含有200mg/L铜的液体LB培养基中生长)、耐酸碱(能在pH 4～10的培养基中生长)、耐盐(可在盐度高达4％的培养基中生长)能力，并且能显著提高培养介质的pH值、降低土壤有效铜的含量，因此对于不同类型铜污染土壤具有较好的修复潜力。附图说明

[0025] 图1：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576在显微镜下的菌落形态。

[0026] 图2：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576的扫描电镜照片。

[0027] 图3：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576的平板形态。

[0028] 图4：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576的16SrRNA鉴定结果。

[0029] 图5：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576的系统发育进化树。

[0030] 图6：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576在不同铜含量的LB培养基中的生长情况。

[0031] 图7：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576在不同pH的LB培养基中的生长情况。

[0032] 图8：不动杆菌CCTCC NO：M 2016576在不同NaCl含量的LB培养基中的生长情况。

[0033] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0034] 实施例1：

[0035] 菌株CCTCC NO：M 2016576在不同铜含量的LB培养基中的生长情况。

[0036] 2mL细菌接种到含有100、200、300mg/L铜的LB液体培养基中，以不加细菌为对照，接种量为1.8×109cfu/mL。之后在2、4、6、20、24h测定OD600值(图6)，结果显示，当LB培养基中铜的浓度达到200mg/L时，细菌仍然可以在6h开始生长，说明菌株CCTCC NO：M 2016576具有较强的抗铜毒害的能力。

[0037] 实施例2：

[0038] 菌株CCTCC NO：M 2016576在不同pH的LB培养基中的生长情况。

[0039] 1mL细菌接种到pH为4、6、8、10的LB液体培养基中，接种量为2×109cfu/mL。之后在2、4、8、12、24、48h测定OD600值(图7)，结果显示，当LB培养基pH为6、8时，细菌生长最快且差异不大；pH为10时，细菌生物量下降，但仍能生长；pH为4时，12h之内细菌生长受到抑制，但之后迅速生长，到48h时与pH 6时的生物量基本相同(图6)，说明菌株CCTCC NO：M 2016576能在较宽的酸碱度范围内生长。

[0040] 实施例3：

[0041] 菌株CCTCC NO：M 2016576在不同NaCl含量的LB培养基中的生长情况。

[0042] 1mL细菌接种到NaCl含量为1％、2％、3％、4％的LB液体培养基中，接种量为2×109cfu/mL。之后在2、6、12、24、48h测定OD600值(图8)，结果显示，当LB培养基中NaCl含量为
1％、2％时，细菌生长最快且差异不大；NaCl含量为3％时，细菌生物量有所下降，但24h内与
1％、2％的差异不大；当NaCl含量增加到4％，细菌仍能生长(图7)，说明菌株CCTCC NO：M 
2016576能耐受较高的盐胁迫。

[0043] 实施例4：

[0044] 菌株CCTCC NO：M 2016576对LB培养基pH的影响。

[0045] 添加2mL细菌于LB液体培养基中(包括不含铜和含有50mg/L铜的两种情况)，接种量为2×109cfu/mL。震荡培养，在6、12、24、48h取样；对照组为不含细菌的LB液体培养基，震荡培养，在6、12、24、48h取样，样品静置半小时，用pH计测量，结果见表2。

[0046] 不论是否在LB液体培养基中加铜，添加细菌处理后，随着培养时间延长，LB培养基的pH值均不断增加，说明菌株CCTCC NO：M 2016576的生长和代谢能够导致培养介质碱性增强。铜处理更显著地增加了LB培养基的pH值，随时间增加幅度不断增大，48h后达到了2.08(表2)。

[0047] 表2添加细菌对LB培养基pH的影响

[0048]

[0049] 实施例5：

[0050] 菌株CCTCC NO：M 2016576对土壤pH的影响。

[0051] 取10g灭菌后的土样置于50mL锥形瓶中，添加25mL已培养24h的菌株CCTCC NO：M 2016576溶液(约2×109cfu/mL)；对照为10g灭菌后的土样加入同样体积的无菌LB液体培养基，震荡24h，静置半小时，用pH计测定，试验结果如表3。

[0052] 表3显示，添加菌株CCTCC NO：M 2016576对供试的6种土壤的pH值均有增加作用，对pH值最低的土样A(pH 4.45)增加幅度最大，变化量为1.79。

[0053] 表3添加细菌对土壤pH的影响

[0054]

[0055] 实施例6：

[0056] 菌株CCTCC NO：M 2016576对土壤有效铜的影响

[0057] 称取5g风干土壤到50mL的锥形瓶中后，灭菌处理。添加5mL已培养24h的菌株CCTCC NO：M 2016576溶液(约108cfu/mL)，对照为5g灭菌后的土样加入同样体积的无菌LB液体培养基，震荡培养24h，培养条件为30℃，摇床速度180r/min，然后向样品中添加25mL0.1mol/L的氯化钙溶液，震荡2h，离心5min，用0.22μm的滤膜过滤，滤液用ICP-AES测定，试验结果如表4。

[0058] 表4显示，添加菌株CCTCC NO：M 2016576对供试的6种土壤的有效铜含量均有降低作用，降幅为19.9％～54.6％，说明该菌株能在不同类型土壤上对铜产生钝化效果，可应用于铜矿区域污染土壤的修复。

[0059] 表4添加细菌对土壤有效铜的影响

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