[0001] 本申请是申请日为2011年3月10日的题为“肠杆菌638及其应用方法”的中国专利申请No.201180023739.9的分案申请。

[0002] 相关申请的参考

[0003] 本申请要求于2010年3月12日提交的美国临时专利申请NO.61/313,415的权益，该专利申请在此全部引用作为参考。

[0004] 本发明在政府的支持下完成，合同号DE-AC02-98CH10886，其由美国能源部颁发。政府具有本发明中的某些权利。

[0005] 本发明涉及一种新型肠杆菌物种，尤其涉及其与植物生长和发育相关的应用。

[0006] 可以预料地球的气候变化会对农业生产力产生很大影响。例如，化石燃料燃烧造成排放物增加，影响地球气候，这就更需要生产源自可再生资源的生物燃料。气候改变会影响农业生产力的另一个方面是其造成温度升高并对降雨模式造成影响。

[0007] 虽然期望增加用于生产生物燃料的原料生产中的农业资源需求，但是该增加的需求需与同时增加的用于养活仍在增长的世界人口的食物需求相平衡。

[0008] 因此，需要实现用于优化粮食生产和生物燃料原料生产的可持续发展。通过可持续方式最佳地提高总植物生产力，提高植物的抗旱性，使得农作物和原料可承受较大波动的降雨模式，并增加植物的耐病原体感染性。

[0009] 一方面，本发明涉及肠杆菌638(杨树内生菌，Enterobacter sp.638)的分离培养物(isolated culture)。

[0010] 另一方面，本发明涉及用于植物的接种物。该接种物包括肠杆菌638的分离培养物和生物学可接受的基质(medium)。

[0011] 仍在另一个方面，本发明涉及用于增加植物生长的方法。该方法包括为植物施加(应用，apply)可有效增加植物生长的量的组合物，其中该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。

[0012] 在进一步方面，本发明涉及用于增加植物中的生物量(biomass)的方法。该方法包括为植物施加可有效增加植物中生物量的量的组合物，其中该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。

[0013] 仍在进一步方面，本发明涉及用于提高植物的果实和/或种子生产力(productivity)的方法。该方法包括为植物施加可有效提高植物的果实和/或种子生产力的量的组合物。该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。

[0014] 在其他方面，本发明涉及提高植物抗病性(耐病性，disease tolerance)的方法。该方法包括为植物施加可有效提高植物抗病性的量的组合物。该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。

[0015] 仍在其他方面，本发明涉及提高植物耐旱性的方法。该方法包括为植物施加可有效提高植物抗病性的量的组合物。该组合物包括肠杆菌638的分离培养物。

[0016] 从以下详述和附图可了解本发明的其他优点和方面。

[0017] 图1表示关于接种不同内生细菌的杨树插条(cutting)的生长指数。在砂土中接种和种植插条的10周后测定生长指数。每个条件使用7个植物。植物生长于温室中。未接种的植物用作对照(参考)。棒表示标准误差。接种和未接种的植物生长10周后，其生长指数计算为(Mt-M0)/M0。M0表示0周时植物的重量(g)；Mt表示10周后植物的重量(g)。利用Dunnett检验，相比未接种的对照植物，接种植物中产生的增加生物量的统计学显著性证实在5％水平(**)。

[0018] 图2示出肠杆菌638对杨树DN-34的芽(shoot)和根形成的影响。植物水培于不存在株638(对照)或存在株638的半强度的Hoagland溶液中。在1(A)和10(B)周后出现芽和根的生长。

[0019] 图3示出经4个月生长期收获的西红柿(番茄)的总重量。相比未接种的对照植物，接种肠杆菌638的植物产量高出10％。

[0020] 图4显示相比作为对照的未接种向日葵，接种肠杆菌638的向日葵植物接种后缩短了开花时间。

[0021] 图5示出在不存在(顶部色谱)或存在(底部色谱)植物提取物时生长的肠杆菌638提取物的色谱比较。当存在植物提取物时，注意乙偶姻和2，3-丁二醇的产生。结果从包含蔗糖的确定培养基(definite medium)中获得。

[0022] 图6示出来自根据其不同基因定位：染色体或质粒pENT638-l的特定COG类的基因的百分比。Cog类图例：D细胞周期控制，细胞分裂，染色体分离；M细胞壁/膜/包膜(envelope)的生物合成；N细胞活动性；O翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣；T信号转导机制；U细胞内运输、分泌和膜泡运输；V防御机制；W胞外结构；J翻译，核糖体结构和生物合成；K转录；L复制，重组和修复；C能量的产生和转换；E氨基酸的运输和代谢；F核苷酸的运输和代谢；G碳水化合物的运输和代谢；H辅酶的运输和代谢；I脂质的运输和代谢；P无机离子的运输和代谢；Q次生代谢产物的生物合成，运输和分解代谢；R仅一般功能预测；S功能未知。

[0023] 图7示出当接种肠杆菌638后烟草中产生的增加的生物量。为了比较，包括未接种的对照植物和接种恶臭假单胞菌W619(Pseudomonas putida)的植物。接种肠杆菌638的烟草植物不仅生长最多，而且和向日葵一样，其开花较早。

[0024] 根据本发明的肠杆菌638于2011年3月4日生物保藏于ATCC专利保藏机构，10801 University Blvd.，马纳萨斯，VA 20110。

[0025] A.肠杆菌638的培养

[0026] 一方面，本发明涉及肠杆菌638的分离培养物。肠杆菌638为非植物病原细菌菌株。在有氧条件下，从表面灭菌的根和茎样品中分离出肠杆菌638菌株，所述根和茎样品取自生长于其下含地下水并被四氯化碳或三氯乙烯污染的粉砂壤土(silty loam soil)中的杂交杨树H11-11。

[0027] 肠杆菌638菌株包括4,518,712bp的单环染色体，其总G+C含量为52.98％，且其稳定地包括157,749bp的质粒pENT638-l，其总G+C含量为50.57％。根据GC含量，pENT638-l质粒至少显示四个不同区域。pENT638-l质粒与发现于其他肠杆菌科中的F质粒有关。该类质粒涉及宿主的相互作用和毒性，例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的pFra质粒。然而，在pENT638-l中，pFra致病岛被独特的23kb假定基因组岛(侧接整合酶基因且其GC含量与其余质粒的GC含量显著不同)取代。

[0028] “分离培养物”指的是不包含其他物质的微生物培养物，其他物质包括(i)在微生物生长的土壤中通常发现的物质，和/或(ii)在微生物从中分离的物质。另外，该培养物可以是不包含其他的其数量足以干扰复制培养物或足以通过正规的细菌学、分子生物学和/或化学技术进行检测的生物、微生物和/或细菌物种的培养物。

[0029] B.植物接种物

[0030] 另一方面，本发明涉及植物接种物。接种物包括肠杆菌638的分离培养物和生物学上可接受的基质。术语“微生物接种物”或“接种物”指的是包含肠杆菌638分离培养物的制剂。

[0031] 为了促进肠杆菌638的培养物，例如可利用合适的培养基或载体对该培养物进行稀释。“生物学上可接受的基质”指的是不干扰肠杆菌638生物活力有效性且对肠杆菌638没有毒性的基质。

[0032] 示例性的生物学上可接受的基质包括含葡糖酸盐的最低盐基质和稀释的富集基质(1/100 LB)。生物学上可接受的基质可包括碳源，如下面示例的化合物：D-甘露糖醇、乳糖、蔗糖、熊果苷、水杨苷、海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、葡糖酸盐和葡萄糖。优选地，该基质包括葡萄糖，蔗糖，其他的植物中提取的糖和/或引起促进植物生长的植物激素诱导的杨树提取物(乙偶姻，2，3-丁二醇，见图5)。

[0033] 在一个实施例中，接种物进一步包括促植物生长微生物(plant-growth promoting microorganism)，例如包括促进植物生长的内生细菌、真菌、根际细菌(rhizosphere bacterium)和/或菌根真菌。具体示例性的促植物生长微生物包括但不局限于放线菌(Actinobacter)、产碱杆菌(Alcaligenes)、芽孢杆菌(Bacillus)、伯克氏菌(Burkholderia)、布丘氏菌(Buttiauxella)、肠杆菌(Enterobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、克吕沃尔氏菌(Kluyvera)、假单胞菌(Pseudomonas)、拉恩氏菌(Rahnella)、青枯菌(Ralstonia)、根瘤菌(Rhizobium)、沙雷氏菌(Serratia)、寡养单胞菌
(Stenotrophomonas)属中的成员。

[0034] C.增加生长的方法

[0035] 另一方面，本发明涉及用于增加植物生长的方法。该方法包括为植物施加有效量的含肠杆菌638分离培养物的组合物。

[0036] 这里使用的“植物”指的是任何类型的植物，例如树(乔木，tree)、灌木、花、草本植物、藤本植物或草。术语“植物”还指植物的任何部分，例如，指整个植物、植物的部分、植物细胞或植物细胞群如植物组织、或其后代。幼苗也可包含于“植物”含义中。植物包括，例如，任何裸子植物和被子植物，单子叶植物和双子叶植物以及树。

[0037] 示例性的单子叶被子植物包括但不局限于芦笋、野生甜玉米(field and sweet corn)、大麦、小麦、大米(稻，rice)、高粱、洋葱、御谷(pearl millet)、黑麦和燕麦以及其他的粮谷(cereal grain)、甘蔗、象草(elephant grass)、柳枝稷(switch grass)和芒草(miscanthus)。

[0038] 示例性的双子叶被子植物包括但不局限于西红柿、烟草、棉花、油菜籽、野生豆、大豆(soybean)、辣椒、莴苣、豌豆、紫花苜蓿(alfalfa)、三叶草、油菜作物或甘蓝(Brassica oleracea)(如，卷心菜、花椰菜、菜花、球芽甘蓝)、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、甜瓜、哈密瓜、向日葵和各种观赏植物(ornamental)。在一个优选实施例中，该植物为西红柿。在另一个优选实施例中，该植物为向日葵。仍在另一个优选实施例中，该植物为烟草。

[0039] 植物的示例性木本物种包括杨树、松树、红杉、雪松、栎树等。树种进一步包括，例如，冷杉、松树、云杉、落叶松、雪松、铁杉、洋槐、赤杨、山杨、山毛榉、桦树、胶皮糖香树(sweet gum)、枫树、杨树、柳树和诸如此类的。在一个优选实施例中，该植物为杨树。

[0040] 这里使用的术语“增加”生长指的是增加利用本发明的方法或组合物处理的植物的生长特性，其中该生长特性的增加大于在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物的生长。“相应的”对照植物指的是与利用本发明的方法和组合物处理的植物相同类型和物种的野生型植物。

[0041] 生长增加可为植物特定部分的生长增加，例如根、芽、叶片、花、果实和/或种子，或者生长可分布于整个植物。生长的测定方法是本领域内所熟知的。

[0042] 生长增加可包括，例如，植物和/或植物的部分的以下特性：高度、宽度、质量、放射性碳的累积的一种或其组合的增加，干重的增加，鲜重的增加和/或特定时期的这些增加的速率的提高。

[0043] 生长增加还可包括，例如，产生的果实数量的增加，开花时间的缩短和/或起有益作用的营养器官的质量的增加，如植物的根或块茎，其中这些部分是食物来源。

[0044] 生长增加可为在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物生长的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的对照植物，生长增加的植物具有比相应对照植物多出10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，100％或更大的生长。

[0045] D.增加生物量的方法

[0046] 在进一步方面，本发明涉及增加植物生物量的方法。该方法包括为植物施加有效量的含肠杆菌638分离培养物的组合物。

[0047] 术语“生物量”指的是植物的干重或鲜重。例如，生物量包括除另外规定之外的所有植物的部分，如有关芽生物量(所有地面以上的植物部分)、叶生物量和根生物量。术语“干重”指的是已除去大多数细胞水的干燥植物的重量。术语“鲜重”指的是未干燥至除去大多数细胞水的植物的重量。生物量的测量方法是本领域所熟知的。

[0048] 术语“增加生物量”指的是增加利用本发明方法和组合物处理的植物的生物量，其中生物量的增加数量大于在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照组的生物量数量。

[0049] 生物量增加可为在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照组植物生物量的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的野生型植物，生物量增加的植物具有比相应对照植物多出10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，100％或更大的生物量。

[0050] E.提高耐病性和/或抗病性的方法

[0051] 仍在另一个方面中，本发明涉及提高植物的耐病性和/或抗病性的方法。该方法包括为植物施加有效量的含肠杆菌638分离培养物的组合物。虽然不局限于任何特定理论，但由于肠杆菌638产生乙偶姻和2，3-丁二醇或由于产生抗菌化合物2-苯乙醇和4-羟基苯甲酸酯，或通过凭借铁载体(siderophore)肠杆菌素合成的必须营养物质的直接竞争，和/或通过由肠杆菌638对异源产生的铁-铁载体复合物的摄入，所以肠杆菌638可提高植物的耐病性和/或抗病性。

[0052] 术语“耐病性”指的是植物忍耐或抵抗疾病的能力并在疾病存在时保持功能和生产的能力。疾病包括，例如，对植物生存能力产生不利影响的病理状态，如，植物中和/或植物上的病原体(如真菌、病毒或细菌)感染。

[0053] 术语“抗病性”指的是植物得病后，在相同条件和相同疾病下生长，相比相应的不显示抗病性的对照植物，植物产生较少疾病症状的能力。抗病性包括对疾病的完全抗性和/或表现为症状减轻、较长生存或其他疾病特征如较高的产量、增加生长、增加生物量、加速果实成熟等的不同程度的抗性。

[0054] 疾病可以是，例如，真菌感染如壳针孢属(Septoria)、无柄锈属(Melampsora)或septotina，病毒感染如白杨花叶病毒和/或细菌感染如土壤杆菌感染、立克次氏体感染或棒状杆菌感染。

[0055] 术语“提高”耐病性和/或抗病性指的是提高有病害的借助本发明的方法或组合物处理的植物的耐病性和/或抗病性，其中在相同条件和相同疾病下生长时，该耐病性和/或抗病性大于相应对照植物的耐病性和/或抗病性。

[0056] 在相同条件和相同疾病下生长时，耐病性和/或抗病性的提高可为相应对照植物的耐病性和/或抗病性的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的野生型植物，耐病性和/或抗病性提高的植物具有比相应对照植物高出10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，100％或更大的耐病性和/或抗病性。

[0057] 耐病性和/或抗病性的评估方法是本领域内所熟知的。例如，这些方法可包括对比对照植株，观察和评定物理表现的疾病症状、植物活力的减少或死亡以及特定疾病响应基因的活化。

[0058] F.提高果实和/或种子生产力的方法

[0059] 仍在进一步实施例中，本发明涉及提高植物果实和/或种子生产力的方法。该方法包括为植物施加有效量的含肠杆菌638分离培养物的组合物。

[0060] “提高生产力”指的是提高利用本发明的方法或组合物处理的植物的果实和/或种子的质量或数量，其中生产力的提高量大于在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物的生产力的量。

[0061] 评估生产力提高的方法可包括，例如，测定植物所结果实的数量、植物所结的单个果实的重量、植物的开花时间、植物果实的成熟时间和/或植物的单个果实或花产生的种子数量。

[0062] 例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物，如果植物所结果实的数量增加，植物所结的单个果实的重量增加，植物的开花时间缩短、植物果实的成熟时间缩短和/或植物的单个果实或花所产生的种子数量增加，那么植物的生产力得到提高。

[0063] 植物生产力的提高或降低分别比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物多或少2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的对照植物，生产力提高的植物具有比相应对照植物高出10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，100％或更大的生产力。

[0064] G.提高耐旱性和/或抗旱性的方法

[0065] 在另一方面，本发明涉及提高植物耐旱性和/或抗旱性的方法。该方法包括利用含肠杆菌638分离培养物的组合物处理植物。虽然不局限于任何特定理论，但由于肠杆菌638产生乙偶姻和2，3-丁二醇，所以肠杆菌638可提高植物的耐旱性和/或抗旱性。

[0066] 术语“耐旱性”指植物忍耐或抵抗干旱条件的能力。“干旱”指的是植物在其中经受渗透胁迫或减少的水势的环境。例如，一段时间缺乏可利用水分可导致干旱。可通过植物生长或成熟所需的水分量与植物可利用的水分量的比较评估干旱条件。例如，相对于植物内部利用或蒸发的水分量，缺乏降雨或灌溉可导致干旱条件。

[0067] 术语“抗旱性”指当在相同水胁迫的条件下生长时，相比相应的对照植物，植物产生较少水胁迫症状的能力。抗旱性包括对干旱效应的完全抗性(不损失生产力)或表现为下降症状、较长生存的不同程度的抗性。

[0068] 症状的表型评估可用于测定植物是否遭受干旱以及遭受何种程度的干旱。例如，通过观察和评定(评级，rating)植物的萎蔫、生长停滞、死亡、生产力、叶片损失(如，叶片卷曲、叶片扭曲、叶片脱落、叶片枯萎)、茎或枝条顶梢枯死、光合效率、开花、和产量水平，评估耐旱性和/或抗旱性。另外，例如可通过生化或核酸检测来测定植物中的特定响应基因的表达或活化，评估植物的耐旱性和/或抗旱性。

[0069] 如果植物表现出不太严重的干旱胁迫症状，那么植物的耐旱性和/或抗旱性得到提高。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物，如果植物的萎蔫、生长停滞、死亡、生产力、叶片损失(如，叶片卷曲、叶片扭曲、叶片脱落、叶片枯萎)、和/或茎或枝条的顶梢枯死减少，那么植物的耐旱性和/或抗旱性得到提高。其他的耐旱性和/或抗旱性提高的示例包括相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的相应对照植物，植物的生产力、植物活力、光合效率、开花和/或产量的提高。

[0070] 相应地，术语“提高”耐旱性和/或抗旱性指的是提高利用本发明方法或组合物处理的植物的耐旱性和/或抗旱性，其中当在相同的条件和水胁迫下生长时，该耐性和/或抗性大于相应对照植物的耐旱性和/或抗旱性。

[0071] 在相同的环境和水胁迫下生长时，耐旱性和/或抗旱性的提高可为相应对照植物的耐旱性和/或抗旱性的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不应用本发明方法和组合物的相同条件下生长的对照植物，耐旱性和/或抗旱性提高的植物具有比相应对照植物高出10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，90％，100％或更大的耐旱性和/或抗旱性。

[0072] H.一般方法

[0073] 任何为植物施加组合物的方法可用于本发明方法中。在植物上和/或植物中施加组合物的方法是本领域内所熟知的。在一个实施例中，该组合物可接种至植物的土壤中。在另一个实施例中，通过在溶液培养基(hydroponic medium)中生长可将本发明组合物引入植物的根或将其喷洒在植物的叶片上。

[0074] 本发明组合物可施加至植物的任何部分，包括通过利用合适的涂层机制(coating mechanism)或粘合剂将其施加至植物的种子。本发明组合物既可在种植前施加至植物，亦可在种植期间引入植物的犁沟(furrow)。如另一个示例所示，本发明组合物可施加至植物的根。本发明组合物可借助或不借助载体制备，其作为直接插入种植植物的犁沟中的单独接种物出售。

[0075] 按照本发明的方法，发明组合物的有效量指足以建立足够细菌生长的量，使得处理过的植物达到所需结果。本发明组合物的有效量可通过本领域内针对特定植物物种的已知方法进行测定。例如，接种本发明组合物可水培6天进行，并在接种三天后更新细菌悬液。

[0076] 在一个实施例中，例如有效量可为每棵植物约101至约1012个细胞间的任何量。在另一个实施例中，有效量为细胞浓度约105至约1010 CFU/ml接种物，较优选地为约106至108 8
CFU/ml之间，且最优选地约为10  CFU/ml。仍在另一个实施例中，本发明组合物可与土壤混合，其量为每克土壤约105至1010个细胞。

[0077] 实施例

[0078] 实施例1：肠杆菌638的分离和鉴定

[0079] 根和芽样品采自10年(10-year-old)的在华盛顿州的实验场地于存在四氯化碳(均匀地含12ppm)的环境下生长8年的杂交杨树H11-11(毛果杨美洲黑杨)。另外，原生柳树(Salix gooddingii)材料采自5年的在存在三氯乙烯(18ppm)和四氯化碳(12ppm)的环境下生长5年的原生植物。利用剪刀从植物上剪取插条，剪刀在切割时，需利用酒精进行清洗，并将剪刀放置在丙酮漂洗的易挥发的有机分析瓶中，为了可从场地装运将分析瓶放置在冰上。分别对根和芽进行处理。在蒸馏水中大力地清洗新鲜的根和芽样品5min，在每100ml溶液附加1滴吐温80的含1％(重量/体积)活性氯化物(作为次氯酸钠[NaOCl]溶液)的溶液中表面灭菌5min并在无菌的蒸馏水中漂洗三次。将取自第三次漂洗的100μl的水样品平面接种于869培养基(25)，以验证灭菌效率。灭菌后，利用Polytron PT1200均质器(Kinematica A6)将根和芽在10ml的10mM MgSO4中浸软。然后进行连续稀释并将100μl的样品平板接种在非选择性的培养基上，以便检验内生菌的存在及其特性。

[0080] 在有氧条件下，从取自生长于其下含地下水并分别被四氯化碳或三氯乙烯和四氯化碳污染的粉砂壤土中的杂交杨树H11-11和原生柳树(Salix gooddingii)的表面灭菌的根和茎样品中分离出肠杆菌638。提取其全基因组DNA并用于扩增16S rRNA基因。16S rRNA基因利用标准6F-1392R引物组进行PCR扩增(Amann，1995)。

[0081] 实施例2：针对杨树的植物生长促进特性的内生细菌的筛选

[0082] 借助30℃旋转摇床上的1/10强度的869培养基(25)上生长的内生细菌制备接种物9
(250ml培养)，直到细胞浓度达到10 CFU/ml(1光密度在660nm[OD660])。通过离心法收集细胞，并利用10mM MgSO4对其冲洗两遍，然后将其悬浮于1/10的原始体积(在10mM MgSO4中)中，从而获得细胞浓度为1010 CFU/ml的接种物。检测每个微生物菌株，对来自杨树(美洲黑杨×欧亚黑杨)DN-34的大约30cm的七个插条进行称重并将其放置在其中含0.5L半强度无菌Hoagland营养液(5)的1L烧杯中，该营养液每3天更新一次。插条经过约4周的生根后形成根。随后，在半强度Hoagland营养液中的最终浓度为108 CFU/ml时向每个杯子加入细菌接种物。孵育3天后，对插条进行称重，将其种植在有菌的砂土中并放置于温度恒定在22℃且进行14h光照-10h黑暗循环的光合有效辐射为165mmol/m2s的温室中。10周后，收获植物并测定其总生物量、其增加的生物量和不同植物组织的生物量。同样收集未接种的对照植物的数据。接种和未接种内生菌的植物生长10周后，其生长指数计算为(Mt-M0)/M0，其中M0表示0周时植物的重量(g)且Mt表示10周后植物的重量(g)。利用Dunnett检验，结果的统计学显著性证实在5％水平。为了测定内生细菌对杨树DN-34生根的影响，按上描述除第一天开始加入内生菌接种物外，对插条进行处理。

[0083] 检测分离自杨树的肠杆菌638提高其宿主植物生长的能力以及在杨树中发现的其他内生γ变形菌纲(gammaproteobacteria)。将洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)Bu72和耐金属亲铜菌(Cupriavidus metallidurans)CH34分别列为阳性和阴性对照，洋葱伯克霍尔德菌Bu72是最初从黄色羽扇豆分离出的被发现可对杨树产生植物生长促进影响的内生菌，耐金属亲铜菌CH34(也称为Ralstonia metallidurans CH34)是没有已知的植物生长促进影响的典型的土壤细菌。同样地，将未接种的插条用作对照。

[0084] 在水培条件(hydroponic condition)下形成根和随后的内生菌接种后，将杨树DN-34插条种植于边缘砂土(marginal sandy soil)中，让其生长10周，然后收获植物并测定其生物量。生长10周后，接种杨盘单格孢菌(M.populi)BJ001的杨树的生物量少于对照(图1)(P＜0.05)。接种肠杆菌638(P＝0.018)和洋葱伯克霍尔德菌Bu72(P＝0.042)的杨树插条如其生长指数所示，比对照植物显示出统计上更好生长(图1)。肠杆菌638和洋葱伯克霍尔德菌Bu72的植物生长促进影响在独立实施的实验中具有可再现性。

[0085] 在温室环境下的测试发现未接种的对照植物和接种嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)R551-3、恶臭假单胞菌(P.putida)W619和变形斑沙雷氏菌
(S.proteamaculans)568的植物间的生长指数无差异；其生长和接种耐金属亲铜菌CH34的植物类似。并且，除接种杨盘单格孢菌BJ001植物显示包含叶片萎黄的胁迫迹象外，对照植物和接种内生细菌的植物都显示健康。

[0086] 实施例3：烟草中针对植物生长促进特性的内生细菌的筛选

[0087] 虽然烟草物种不用于野外应用，但由于其作为针对转化和代谢产物研究的大植物模型常用于实验室中，所以其可用于该研究。将珊西烟(nicotiana xanthi)幼苗种植在无土生长的培养基中，当其长出初叶后，将其移至水培溶液。一周后，将植物放置在含108 CFU肠杆菌638的溶液中。三天后，更新接种物，然后再过三天后，将植物放于温室的盆中。

[0088] 每周监测植物的生长并记录开花开始的时间。植物比未接种植物更快达到完整尺寸且大部分植物比相同数目的未接种植物早开花一个月。

[0089] 实施例4：内生细菌对杨树根发育的影响

[0090] 为进一步测验内生细菌对根发育的影响，在存在和缺少肠杆菌638 gfp标记衍生物的条件下进行生根实验。未接种植物的根形成非常缓慢。相反地，插条可在选择的内生菌存在下进行生根，一周内开始根形成，相比未接种植物，其芽形成更明显(图2A)。10周后，未接种的对照(植物)的根形成仍稀少，但接种肠杆菌638植物的根和芽发育很好(图2B)。利用荧光显微镜通过gfp标记菌株观察植物根的内部定殖(internal colonization)，以确定其内生菌的活动情况。在恶臭假单胞菌W619接种植物的根表面观察到有小菌落形成，而肠杆菌638接种植物的根上未观察到小菌落，仅观察到内部定殖。并发现未接种的对照植物的根没有gfp表达。

[0091] 实施例5：内生细菌对结实和开花生产力的影响

[0092] 为了测验内生细菌对结实量的影响，首先将西红柿种子(heirloom variety Brandywine，Park Seed)放于珍珠岩/水基质，然后将其转移至1/2强度的Hoagland溶液。当8
植物大约3英寸高时，将其转移至如上述的每ml含10  CFU内生细菌的溶液中。接种三天后，将幼苗种植于温室中可从市场买到的盆栽混合土(potting mix)ProMix中。记录三个月的西红柿第一坐果日期和总量。接种肠杆菌638的西红柿植物的果实生产力比未接种植物高出10％。未接种植物产出82个果实，其总质量为22.374kg，而接种植物产出90个果实，其总质量为24.909kg(图3)。

[0093] 利用上述方法首先将向日葵种子(Mammoth，Park Seed)放于珍珠岩/水基质并记录开花时间。在温室条件下，接种的向日葵比未接种植物早开花5天，并且当其50％处于开花期时，未接种植物仅10％处于开花期；当100％接种植物处于开花期时，未接种植物仅70％处于开花期(图4)。

[0094] 实施例6：抗旱性

[0095] 将杂交杨树的硬插条(OP-367美洲黑杨×欧亚黑杨)于水中放置3天，使其开始生根，然后将其移至每ml含108 CFU内生细菌的1/2强度的Hoagland溶液中，放置3天。之后将插条种植于含园土(garden soil)的盆中，再将其放于温室生长3个月，同时为其供应过量的水。三个月后，停止为植物供水，监测衰老时间。接种植物出现初始干旱症状的时间比未接种植物平均延迟了20％。

[0096] 实施例7：抗病性

[0097] 由于植物的增加活力和内生细菌中的基因因素，使得接种植物对致病菌定殖更具有抗性，且接种植物的症状不太明显。

[0098] 如所述的对杂交杨树插条H11-11(易感染真菌疾病)和OP-367(对真菌疾病具有抗性)进行接种。将植物种植于无菌的盆栽混合土中，生长至出现6至8片叶片。然后，将植物暴露于真菌病原菌，并监测感染物质症状出现的时间和严重程度。还可对植物进行分析，以测定已知的疾病响应基因的活力。

[0099] 实施例8：基因组结构和一般特征

[0100] γ-变形菌纲的肠杆菌638的基因组包括4,518,712bp的单一环状染色体，其总G+C含量为52.98％，且还包括157,749bp的质粒pENT638-l，其总G+C含量为50.57％(表1)。肠杆菌638的染色体显示GC偏移转变(GC skew transition)，其对应其复制原点(oriC)和终点。oriC部位包含完整的DnaA结合框(TTATCCACA)(SEQ ID NO：2)，其位于dnaA ATG起始密码子上游31,985bp处(坐标为4,487,245bp)。

[0101] 根据GC含量，pENT638-l质粒至少显示四个不同区域。该质粒包括与F族质粒共同的且包含质粒转移和复制基本功能的祖先主链(ancestral backbone)，且其区域可能通过水平基因转移产生。pENT638-l质粒中的这些区域的密码子使用矩阵与其余的肠杆菌物种不同。此外，这些区域与测序的染色体或密切相关菌株的质粒没有共线性(synteny)，且这些区域可感兴趣地编码与植物附着和定殖相关的基因。关于6个relBE的毒素/抗毒素(TA)系统的存在，pENT638-l和这些区域中肠杆菌638的稳定维持似乎发挥着重要作用，推测其可在肠杆菌638和其植物宿主之间的成功相互作用中发挥作用。

[0102] 相反地，肠杆菌638的染色体仅编码三对毒素/抗毒素(Ent638_0434-0435，Ent638_0476-0477和Ent638_2066-2067)。该低数值代表与宿主相关的生物体。

[0103] 染色体编码4395个假定编码序列(CDS)，其编码密度为87.9％，质粒pENT638-1编码153个假定CDS，其编码密度为80.4％。经过人为注释，3562个CDS(78.3％)分配为假定生物学功能，而835个CDS(18.4％)注释为假定的未知功能的蛋白质。保守的假定蛋白由684个CDS(15.0％)表示，而151个CDS(3.3％)与之前报道的序列间无同源性。利用MaGe系统的COGnitor模块，3597个CDS(79.1％)可分配为一个或更多的COG功能类(见图6)。肠杆菌638的不同COG类间的CDS分配与大肠杆菌K12非常类似。当肠杆菌638和大肠杆菌K12处于需要有效吸收宿主提供养分的共生生活模式时，含量最多的三类为氨基酸(E)、碳水化合物(G)和无机铁(P)的运输和代谢，其多于全部CDS的37％。并发现7套5S、16S、23S rRNA基因和一个额外的5S rRNA基因。以及确定了具有对所有20个氨基酸特异性的总共83个tRNA基因和硒代半胱氨酸的单个tRNA。

[0104] 肠杆菌638编码8个σ因子：fliA(Ent638_2509；σ28)，3个rpoE-样σ24(Ent638_3060，Ent638_3117和Ent638_3389)，rpoS(Ent638_3212，σ38)，rpoD(Ent638_3473，σ70)，rpoN(Ent638_3638，σ54)和rpoH(Ent638_3865，σ32)。

[0105] 如DNA的Mbol和Sau3Al消化证实，肠杆菌638可编码在GATC位点参与腺嘌呤甲基化的活性dam甲基化酶，其第一个酶无法消化甲基化的肠杆菌638 DNA。

[0106] 肠杆菌638基因组上的100个回文重复(CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG)不均衡地分布于染色体上。这些发夹环形成重复(含主要为TGT/ACA或AC/TG的XX(X))一般在基因的3′末端重复两次或三次且可能地作用于转录终止。

[0107] 肠杆菌638基因组上发现了8个插入序列(IS)的元件：2个来自IS3/IS51族(1个由3个含移码的ORF(Ent638_0739、Ent638_0740、Ent638_0741)组成，另一个由单个ORF(Ent638_0060))，1个来自IS110族的IS元件(Ent638_1530)，3个来自IS481族的IS元件(Ent638_2980、Ent638_3160和Ent638_3288)组成。这些IS元件中的一些元件定界为假定的基因组岛(genomic island)(见下文)。

[0108] 质粒pENT638-l具有2个完整的IS元件和2个由后面族截短的转座酶(transposase)，其中1个元件来自由1个ORF(Ent638_4224)组成的Tn3族，另一个元件来自由两个ORF(Ent638_4320和Ent638_4321)组成的IS3/IS407族。完整的IS和源自IS3/IS407族截短的转座酶位于大的编码涉及质粒稳定性和复制的基因(sopAB，rep A)和涉及质粒接合转移的基因(tra)的区域的侧面。该75kb区域视为pENT638-l的主链(骨架)。

[0109] 将肠杆菌638的基因组与其密切相关菌株的基因组进行比较，确定致癌肠杆菌ATCC 35316为最接近基因组，其80.4％的CDS与肠杆菌638具有共线性，其次是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)342和MGH 78578(两者都是74％的CDS具有共线性)，然后是克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895(73％)和大肠杆菌(Escherichia coli)物种(63％至73％之间)。

[0110] 通过与其他植物相关的微生物和胃肠杆菌大肠杆菌K12(MG1655)的基因组比较，找出相对其植物宿主而言的具体合适的肠杆菌638。将具有最好注释的细菌基因组的生物体选作参考菌株，该菌株与肠杆菌638共享(蛋白质长度的80％具有标准的80％同一性)2938个共线的CDS(其基因组的69.2％)。在304个共线区(synton)中对该共线区域进行分组，每个共线区(synton)平均含10.5个CDS。

[0111] 在肠杆菌638基因组上确认了56个与密切相关的细菌的基因组没有共线性的区域。其中，8个区域符合推定基因组岛(表2中灰色突出部分)标准。这些基因组岛携带可编码参与糖运输(PTS系统)、附着、果胶酸盐的利用、借助铁载体受体的铁吸收、硝酸盐还原、菌毛生物合成的蛋白质以及一些其他的转运蛋白质和调节剂的基因。编号47区域是获得含参与适应内生菌生活方式的基因的基因组岛的说明性示例。该区域编码假定的果胶酸盐转运蛋白和降解蛋白，使得菌株638可在果胶酸盐(一种重要的植物合成化合物)上生长，果胶酸盐作其碳源。该基因组岛侧面为整合酶基因且该基因组岛插入tRNA-Gly位点。

[0112] 在染色体上发现了八个噬菌体和一个假定整合质粒。确定了总共302个噬菌体蛋白质，其包括18个假定整合酶基因。

[0113] 另外，肠杆菌638染色体包含具有成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)的区域，该序列靠近六个编码CRISPR相关序列(Cas)的基因(Ent638_1401-1406)。CRISPR可能提供了获得的耐噬菌体性。八个噬菌体中的六个噬菌体的侧面为缺乏与密切相关细菌如大肠杆菌K12、0157-H7和UTI89、肺炎克雷伯氏菌MGH 78578或克氏柠檬酸杆菌BAA-895中的相应区域共线的区域且这些区域通过噬菌体转导获得。这些区域包含了在细菌/植物相互作用中起重要作用的基因，如氨基酸和铁/铁载体转运蛋白、溶血素(HCP)以及血凝素蛋白和转运蛋白(表2)。迄今，基因组岛、噬菌体和IS元件的细胞内和细胞外的活动性都没有进行实验验证。

[0114] 实施例9：在植物根际中生存：肠杆菌638代谢能力的概述

[0115] 通常地，杨树通过插条繁殖，且由于插条中的内生菌非常少，许多物种的内生细菌在定殖杨树前不得不存活于土壤中。由于肠杆菌638编码许多参与碳水化合物、氨基酸和铁吸收的转运蛋白以及一些重金属抗性基因，所以其非常适合在植物根际生存。下述的大多数代谢途径都通过在选择生长条件(Taghavi等，2009)下培养菌株638来证实。

[0116] 碳水化合物的代谢

[0117] 肠杆菌638基因组编码所有中间代谢途径，包括三羧酸循环、Entner-Doudoroff、EmbdenMeyerhof-Parnas和磷酸戊糖途径。虽然菌株不能进行自养生长，但可利用多种化合物作为碳源：D-甘露糖醇、乳糖、蔗糖、熊果苷、水杨苷、海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、葡萄糖酸盐和葡萄糖(Taghavi等，2009)。肠杆菌638具有乳糖酶(lacZ，Ent638_0928)、木糖异构酶(Ent638_0156)和木酮糖激酶(Ent638_0157)。利用乳糖作为唯一碳源是肠杆菌的特点。肠杆菌638具有可在丙二酸上生长的遗传能力，其基因组包含参与催化丙二酸转化成乙酸的丙二酸脱羧基的9基因(mdcABCDEFGHR，Ent638_3779-Ent638_3772)群簇。

[0118] 糖利用的多样性与糖苷水解酶的多样性有关。肠杆菌638基因组携带代表24个不同家族的编码假定糖苷水解酶的55个基因(CAZy数据库)。相比之下，还应提及的是，人类病菌坂崎肠杆菌具有63个糖苷水解酶(CAZy数据库)。

[0119] 通过利用包括纤维素酶/内切葡聚糖酶(包括糖苷水解酶家族GH5、GH9、GH44、GH48和GH74的成员)、苔聚糖酶(GH16)、木聚糖酶(GH10、GH11)的糖苷水解酶有效降解植物细胞壁化合物，植物病原细菌和真菌得以进入(access)。肠杆菌638基因组未编码代表假定的通常用于分解植物细胞壁聚合物的内、外纤维素酶和半纤维素酶家族成员的糖苷水解酶。该发现与肠杆菌638的非植物病原行为一致。然而，应该注意两个内切-1，4-D-葡聚糖酶(GH8)(bcsZ：Ent638_3928，Ent638_3936)被发现作为部分细菌纤维素合成场所。

[0120] 植物养分的吸收

[0121] 以共生关系生存的生物，例如肠杆菌638和其杨树宿主，需要共享资源，因此，可预期肠杆菌638基因组编码可使其吸收植物释放养分的大量多样性转运蛋白。编码假定转运蛋白的总共631个ORF：其中295个编码ABC转运蛋白(包括一个磷酸盐转运蛋白)、81个编码来自主要易化子(facilitator)超家族(MFS)的转运蛋白，41个编码来自磷酸转移酶系统家族(PTS)的转运蛋白和14个编码来自耐药节结化细胞分化家族(resistance nodulation and cell division family，RND)的转运蛋白(见SOM中假定转运蛋白和其底物的完整列表)。该发现与肠杆菌638的植物相关生活方式一致，其需要有效吸收植物合成的养分，包括释放至根际的养分。

[0122] 肠杆菌638基因组编码许多PTS转运蛋白。利用系统发育分析分配肠杆菌638 PTS转运蛋白的特异性基质：7个属于α-葡糖苷(用于吸收葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、麦芽糖、葡糖胺和α-葡糖苷)，7个属于β-葡糖苷(用于吸收蔗糖、海藻糖、N-乙酰胞壁酸和β-葡糖苷)，2个为果糖PTS转运蛋白(用于吸收果糖、甘露糖醇、甘露糖、2-O-α-甘露糖基D-甘油酸盐)且6个为乳糖PTS转运蛋白(用于吸收乳糖、纤维二糖和芳香β-葡糖苷)。

[0123] 重金属抗性

[0124] 肠杆菌638基因组携带假定参与铜抗性的基因，包括其表达受CueR(Ent638_09630)调控的P型ATP酶Cop A(Ent638_0962)、铜外排操纵子cusABCF(Ent638_l 157-
1154)、多铜氧化酶CueO(Ent638_0671)以及编码假定CopC和CopD铜抗性蛋白的操纵子(Ent638_2411-12)。有趣地，在存在100μM Cu(NO3)2情况下，菌株不能在284葡糖基本培养基上生长。

[0125] 肠杆菌638基因组还可编码发现于紧邻质粒pENT638-l复制起点处的砷/砷酸盐抗性簇(arsHRBC，Ent638_4254-Ent638_4257)，且发现在存在200μM砷酸盐(作为Na2HAsO4)情况下，菌株638可成功地生长于284葡萄糖基本培养基。

[0126] 可预期存在砷酸盐和假定铜抗性基因，因为肠杆菌638分离自生长在Tacoma，WA的受ASARCO冶炼厂排放物影响的地区的杨树，且从1905至1982年营运的铜冶炼厂被认为是美国最大的砷排放源之一。

[0127] 位于染色体的其他重金属抗性基因包括假定的铬酸盐还原酶(YieF或ChrR，Ent638_4144)和参与锌/镉/钴抗性的P型外排ATP酶ZntA(Ent638_3873)。菌株638可在存在500μM ZnSO4、500μM CdCl2、100μM CoCl2和50μM NiCl2的情况下，在284葡萄糖基本培养基上生长。虽然可认为这些基因还存在于其他的大肠杆菌物种，但是其存在可足够提供相比其他细菌生存于根际的选择性优势，尤其是当存在这些金属时。

[0128] 重金属还是重要的辅因子，且肠杆菌638基因组编码多个参与重金属吸收和外排的基因。发现了有关参与锌(znuACB，Ent638_2426-2428)和镍(nikABCDE，Ent638_1834-Ent638_1838)吸收的ABC转运蛋白的基因。镍为尿素酶的基本辅因子(Dosanjh等，2007)，相异的大肠杆菌K12和变形斑沙雷氏菌(S.proteamaculans)568、肠杆菌638可将尿素转化成氨(ureABC，Ent638_3464-Ent638_3466)。

[0129] 氧化应激，对抗植物的防御机制

[0130] 植物利用不同的防御机制对抗细菌、病毒和真菌感染，包括产生活性氧物质(ROS)(过氧化物、过氧氢自由基、过氧化氢和羟基自由基物质)、氧化氮和植物抗毒素。在根定殖前，菌株638生存于氧化的根际环境中。肠杆菌638染色体编码三种超氧化物歧化酶：SodA，一种Mn超氧化物歧化酶(Ent638_4063)；SodB，一种铁超氧化物歧化酶(Ent638_l 191)；SodC，一种铜/锌超氧化物歧化酶(Ent638_1801)。它还包括三种催化酶：KatE(Ent638_
1712)，KatN(Ent638_3129)和KatG(Ent638_4032)；三种氢过氧化物还原酶：ahpC(Ent638_
0872和Ent638_l 145)和ahpF(Ent638l 146)；两种额外的氢过氧化物还原酶(假定的具有AhpD域的ahpC Ent638_3391和Ent638_0498)；一个氯过氧化物酶(Ent638_l 149)以及两种硫醇过氧化物酶(Ent638_2151和Ent638_2976)。

[0131] 我们还确定了位于紧邻其有机过氧化物传感蛋白/调节蛋白处的假定有机过氧化物抗性蛋白(ohr，Ent638_0518)。

[0132] 肠杆菌638在黄色血红素蛋白一氧化氮加双氧酶(Ent638_3037)和厌氧硝酸盐还原操纵子(norRVW，Ent638_3181-3183)存在时，可解毒自由基一氧化氮。通过复杂的调控网络控制氧化应激反应系统的表达。关键的调节蛋白为过氧化氢传感蛋白OxyR(Ent638_4025)，其可激活过氧化氢诱导基因的调节子表达，如katG、gor(谷胱甘肽还原酶，Ent638_
3913)、ahpC、ahpF、oxyS(调控RNA，Ent638_misc_RNA_29)、dpsA(饥饿期间DNA保护蛋白，Ent638_1299)、fur(铁载体生物合成和转运的DNA结合转录的双重调节蛋白，Ent638_l 
198)和grxA(谷氧还蛋白，Ent638_1364)，所有这些都存在于肠杆菌638。在肠杆菌638基因组上发现三种谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因(Ent638_0139，Ent638_0268和Ent638_1329)，一个谷胱甘肽ABC转运蛋白(GsiABCD，Ent638_1323-1326)，两种谷胱甘肽过氧化物酶(Ent638_1732和Ent638_2699)，一个γ-谷氨酸盐-半胱氨酸连接酶(GshA，Ent638_3168)，谷胱甘肽合成酶(GshB，Ent638_3351)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT，Ent638_3850)。还在肠杆菌
638基因组上确认了属于转运蛋白RND家族的AcrAB(Ent638_0943-0944)位点。

[0133] 实施例10：宿主植物内的内生菌定殖和构建

[0134] 植物宿主的内生菌定殖可以分为四个步骤(van der Lelie等，2009)。

[0135] 步骤1：移至杨树根部：活动性/向化性

[0136] 肠杆菌638配备良好，可有效移至植物根部，其为内生菌定殖优选部位。其基因组包含三种鞭毛生物合成操纵子(flgNMABCDEFGHIJKL，flhEAB fimA yraIJ IpfD cheZYBR tap tar csuEDCAB int cheWA motBA flhCD fliYZA fliCDSTEFGHJKLMNOPQR，Ent638_2445-2541和fliEFHIJKLMNOPQR)。

[0137] 然而，肠杆菌638的flh操纵子包含两种菌毛生物合成基因的插入。这些区域的其中一个区域(csu)侧面为指向后面捕获的整合酶。肠杆菌638还具有大量菌毛/纤毛生物合成基因(至少60个基因)。在肠杆菌638中，菌毛/纤毛生物合成基因归类于10个不同区域。在鞭毛生物合成基因簇内还发现了有关向化性(che)的决定因子。

[0138] 步骤2和3：根部表面的粘附和定殖

[0139] 在肠杆菌638中，确定了编码参与假定粘附至根部的蛋白的多个基因。许多位于基因组岛上或质粒pENT638-l上，在植物根部定殖步骤，其表示该质粒的特定作用。具体地，质粒pENT638-l包含一个23kb的假定基因组岛(侧面为整合酶基因且其GC％为56.2，显著高于剩余质粒的GC％)，以及假定的srfABC操纵子。虽然srfABC操纵子的确切功能尚不清楚，但相信其参与宿主定殖。

[0140] 质粒pENT638-l上存在参与植物入侵的许多其他基因，包括含自主转运蛋白结构域(分泌类型V)和毒性/粘附结构域(血凝素(Ent638_4267)、百日咳杆菌粘附素(pertactin)(Ent638_4201和Ent638_4206)和粘附(Ent638_4317))的假定蛋白。

[0141] 血凝素：肠杆菌638染色体编码两种假定的血凝素蛋白(Ent638_0148，Ent638_3119)，以及由五个编码丝状血凝素(Ent638_0052-0057)的基因组成的基因簇。

[0142] 此外，在肠杆菌638染色体上发现多个编码含果胶裂合酶/百日咳杆菌粘附素结构域(Ent638_1775，Ent638_0318，Ent638_0501)或粘附结构域(Ent638_1867，Ent638_3408)的自主转运蛋白。

[0143] 两种肠杆菌638 yadA基因(Ent638_1867和Ent638_4317)都编码含自主转运蛋白结构域和侵染素/粘附结构域的蛋白。YadA蛋白虽然可促进植物定殖/入侵，但还可代表已往肠生活方式的残迹。

[0144] pENT638-l上的血凝素基因(Ent638_4267)被两种RelB/E毒素/抗毒素体系包围。假定地，Ent638_4267血凝素对用于以这种方式稳定在pENT638-l上的根部粘附发挥重要作用。且确定了血凝素基因Ent638_4267、两个编码含三四氨基酸(tetratricopeptide)(TPR-
2)重复结构域的蛋白的基因(Ent638_4265-4266)，其假定地参与蛋白质-蛋白质相互作用和粘附装置的正确装配。

[0145] 类型为I和IV的菌毛：在肠杆菌638基因组上发现六个假定的前驱蛋白(usher protein)(Ent638_0084，Ent638_0403，Ent638_0990，Ent638_1071，Ent638_2450和Ent638_2459)。该值显著高于其他植物相关细菌类中发现的前驱蛋白的平均值。

[0146] 在肠杆菌638的染色体上，确定了56个参与菌毛/卷曲菌毛/纤毛生物合成的基因，包括6个I型菌毛生物合成基因的基因簇(Ent638_0074-0086，Ent638_0401-0409，Ent638_0987-0994，Ent638_1068-1072，Ent638_2448-2451，Ent638_2458-2462)。最后两个基因簇侧面为参与向化性和活动性(鞭毛生物合成)(见活动性部分)且可能地参与非生物表面上的生物薄膜形成的基因，且该基因将两个基因簇分开。该区域(Ent638_2445-2541)很好示例了参与植物根部定殖不同方面(向化性、活动性和粘附)的基因簇。

[0147] 类型为IV的菌毛：在肠杆菌638的基因组上，确定了两个IV型菌毛生物合成基因的基因簇(Ent638_0650-0652和Ent638_3266-3268)，以及一个可能参与DNA摄取的假定的未表征菌毛生物合成基因的基因簇(Ent638_3804 and Ent638_3808)。

[0148] 卷曲菌毛纤维(curli fiber)：就结构和生化而言，卷曲菌毛属于通称为淀粉体的生长类纤维。在肠杆菌638的基因组上，确认了一个用于卷曲菌毛生物合成的基因簇(Ent638_1553-1559)。

[0149] 纤维素生物合成

[0150] 与非病原行为一致，肠杆菌638基因组不编码参与纤维素降解的蛋白。但在其上确定了负责纤维素生物合成的操纵子(Ent638_3927-3940)。

[0151] 毒性

[0152] 微观研究表明肠杆菌638定殖皮孔腔间的根木质部；且未发现细胞内定殖(Taghavi等，2009)。

[0153] 虽然在植物定殖研究中从未发现肠杆菌638可作为机会致病菌(opportunistic pathogen)，但是其基因组编码多个假定地参与毒性的蛋白。应该注意毒性还需要细菌和其宿主之间进行密切相互作用，如同内生菌定殖所需要的密切相互作用。其上还确定了一种编码内膜溶血素(家族III)的基因(yqfA，Ent638_3317)，包含假定溶血素结构域的部分CDS(Ent638_0251)和三种编码毒性因子的hep基因(Ent638_0829，Ent638_2912和Ent638_3004)。

[0154] 其他的假定毒性因子包括为巨噬细胞内的毒性和生存所需的pagC(Ent638_3136)和msgA(Ent638_1656)，以及在细菌细胞表面其产物为VirG(Ent638_3560)的表达和正确膜定位所需的假定virK基因(Ent638_1394和Ent638_2409)。

[0155] 然而，在肠杆菌638基因组上，确认不存在编码III型分泌体系的基因，其为典型对于病原体如Erwinia和丁香假单胞菌(P.Syringae)的有效毒性生活方式的前提。

[0156] 最后，类似于pENT638-l质粒，在肠杆菌638基因组上发现了srfABC操纵子(Ent638_2108-Ent638_2110)。这些基因在内生菌行为中的功能尚不明确。

[0157] 步骤4：根入侵以及通过有效定殖的植物中构建(planta establishment)

[0158] 肠杆菌638可在组织损伤部位进入植物根部，因为其基因组序列不编码可通过有效分解植物细胞壁进行内生菌定殖的内/外纤维素酶或半纤维素酶。

[0159] 果胶/果胶酸盐的降解

[0160] 虽然肠杆菌638不能在作为唯一碳源的果胶(聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酯))上生长，但其基因组包含编码参与果胶酸盐降解、果胶去甲基化主链和植物细胞壁组成的基因的基因组岛。肠杆菌638降解果胶酸盐的能力可对定殖植物细胞间的层际空间区域发挥作用。

[0161] 发现参与将果胶酸盐裂解成在非还原性末端含4-脱氧-α-D-半乳糖-4-硬脂酸基团的低聚糖的分泌果胶酸盐裂解酶PelB紧邻寡聚半乳糖醛酸盐特异性孔蛋白KdgM，其参与将寡聚半乳糖醛酸摄取至周质。由基因组不同区域编码的周质果胶酶PelX参与周质的寡聚半乳糖醛酸降解。

[0162] 在另一个区域，确定了参与穿过内膜的寡聚半乳糖醛酸转移的碳水化合物摄取ABC转运蛋白TogMNAB和多个参与将寡聚半乳糖醛酸降解成2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸盐的额外蛋白Ogl、Kdul和KduD。参与D-葡糖醛酸代谢的KdgK和KdgA进一步将2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸盐降解成都为一般细胞代谢化合物的丙酮酸盐和3-磷酸甘油醛。该区域侧面为来自IS481家族的转座酶，该区域通过水平基因转移获得。蛋白质UxaA、UxaB和UxaC是将半乳糖醛酸盐降解成2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸盐的替代途径所必需的，其也由肠杆菌638染色体编码。果胶酸盐的降解需很好调节，以避免致病作用。

[0163] 质粒pENT638-l携带两个邻近基因(Ent638_4201，Ent638_4206)，其编码含果胶裂解酶结构域的自主转运蛋白。这些蛋白可参与将肠杆菌638粘附至杨树根部或作为部分定殖机制，参与能裂解根部细胞的细胞壁的酶的输出。在这两个基因之间，确定了严谨性调控的双组分转录调控蛋白，以及参与荚膜多糖生物合成(Ent638_4207)和参与编码糖基转移酶(Ent638_4208)的两种额外基因。细胞表面脂多糖(LPS)假定参与了宿主特异性，且这些基因的邻近在肠杆菌638植物入侵中起协同作用。

[0164] pENT638-l质粒的纤维二糖磷酸化酶

[0165] 在质粒pENT638-l上，位于质粒复制起始点邻近处的ndvB基因(8532bp)编码参与产生β-(1-＞2)-葡聚糖的蛋白。膜结合的NdvB蛋白催化三种酶活性：起始(蛋白质糖基化)、延伸和在β-(1-＞2)-葡聚糖原位的环化，然后其释放至周质(periplasm)中。

[0166] 实施例11：与宿主植物的协同作用：植物生长促进和健康

[0167] 间接植物生长促进作用

[0168] 氮的固定和代谢

[0169] 肠杆菌638不能固氮且缺少所需的nif基因。然而，它包含异化和同化硝酸盐还原途径所需的基因。硝酸盐运输和硝酸盐/亚硝酸盐还原基因存在于两个被整合酶和假定的粘附/入侵基因分开的操纵子(narIJHGKXL和nasAB ntrCBA nasR，Ent638_2312-Ent638_2326)中。在其染色体上还发现参与亚硝酸盐运输和还原(nirBDC，Ent638_3793-3795)、硝酸盐运输和还原(narUZYWV，Ent638_2061-Ent638_2065)和铵吸收转运蛋白(amtB，Ent638_
0919)及其调节蛋白(Ent638_0918)以及硝酸盐/亚硝酸盐传感蛋白的其他的区域。

[0170] 铁载体

[0171] 肠杆菌638发展中间方案处理铁的吸收。它的基因组包含两个二价铁吸收系统(FeoAB，EfeUOB)和九个铁ABC转运蛋白。

[0172] 肠杆菌638可以合成铁载体肠菌素(EntD，EntF，EntC，EntE，EntB和EntA)，分泌其(EntS)，利用三价铁铁载体吸收系统(ExbDB)重新获得铁-肠菌素复合物，然后在铁-肠菌素复合物内化后，利用肠菌素酯酶(Fes)获得铁。参与该肠菌素生物合成的基因，连同编码两个参与铁吸收(sitABCD和fepCGDB)的ABC转运蛋白基因均归类于含17个基因(Ent638_l 111-1128)的大基因簇中。此外，肠杆菌638具有12个外膜三价铁和三价铁相关的铁载体受体(TonB依赖)，其几乎是大肠杆菌K12(其仅有7个铁载体受体)中所发现数量的两倍。该发现与需要竞争铁的细菌一致。因此，存在有效铁吸收系统可有助于保护宿主植物免受真菌感染。

[0173] 抗微生物化合物

[0174] 肠杆菌638表明可构成地(组成型)产生苯乙醇。该分子通常用于香料(perfumery)中，其可赋予肠杆菌638一种宜人的花香，但是更有趣地其具有抗微生物特性。两个候选基因(Ent638_1306和Ent638_1876)编码假定参与将苯乙醛转变成苯乙醇的酶。这两个基因位于不与其他密切相关菌株共线的区域。

[0175] 虽然4-羟基苯甲酸酯(4-hydroxybenzoate)为重要电子载体辅酶Q的前体，但是还已知其具有抗微生物活性。肠杆菌638具有编码假定可执行该反应的蛋白的ubiC(Ent638_0243)基因。

[0176] 肠杆菌638基因组编码参与氯霉素抗性的氯霉素乙酰转移酶(cat，Ent638_1533)，其可帮助细菌对抗由其他的内生菌或根际生物产生的抗菌化合物生存。

[0177] 实施例12：借助肠杆菌638的直接植物生长促进

[0178] 1-氨基环丙烷-1-羧酸盐脱氨酶

[0179] 肠杆菌638基因组上缺乏1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶(acd)(EC：3.5.99.7)，其证实了之前该菌株不能代谢ACC的研究(Taghavi等，2009)。然而，却发现了氨基酸脱氨酶，但是它们都缺乏特定氨基酸E296和L323(分别被T或S和T替代)，因此在活性位点中加入PLP吡啶氮原子。

[0180] 根生长促进激素乙偶姻和2，3-丁二醇的产生

[0181] 肠杆菌638基因组携带编码丙酮酸盐脱氢酶的基因poxB(Ent638_1387)。虽然PoxB的主要功能是将丙酮酸盐转换成乙醛，但是一小部分的丙酮酸盐被转换成乙偶姻，其为羟乙基-硫胺二磷酸(盐)反应中间体的副产物。

[0182] 肠杆菌638基因组编码参与将丙酮酸盐转化成乙酰乳酸的乙酰乳酸合成酶(budB，Ent638_2027)。乙偶姻脱羧酶(budA，Ent638_2026)催化乙酰乳酸转化成乙偶姻。乙偶姻可由细菌释放或随后通过肠杆菌638或通过杨树借助乙偶姻还原酶(budA，Ent638_2026)转化成2，3-丁二醇。在有氧条件下，乙酰乳酸自发地转化成双乙酰，其转而可由乙偶姻脱氢酶蛋白(Ent638_2737)转化成乙偶姻。

[0183] 通过质谱法研究肠杆菌638生物合成不稳定(挥发，volatile)化合物及其由添加杨树树叶提取物的诱导(induction)。包含肠杆菌638和杨树树叶提取物的样品在诱导后12小时发现开始产生2，3-丁二醇和乙偶姻(图5)。应该注意虽然无法证实双乙酰的合成，但其可能在基于存在的三种化合物的完整代谢途径下发生。实验样品和对照样品(6∶42，9∶45和14∶01)都出现了额外峰，当前正在进行这些化合物的鉴定。

[0184] 肠杆菌638基因组缺乏参与将乙偶姻和2，3-丁二醇代谢转化成中间代谢产物的基因(acoABCX adh)。因此，借助肠杆菌638的这些植物生长激素的产生和降解之间没有拮抗作用。

[0185] 植物生长促进激素IAA的产生

[0186] 已通过实验论证肠杆菌638可产生吲哚乙酸(IAA)(Taghavi等，2009)。其可能借助色氨酸降解途径VII(芳香氨基酸氨基转移酶，Ent638_1447)通过产生作为中间分子的吲哚丙酮酸生物合成IAA。吲哚丙酮酸脱酸酶IpdC(Ent638_2923)和假定的吲哚-3-乙醛脱氢酶(Ent638_0143)进一步催化IAA合成。

[0187] 虽然已描述了目前认为的本发明优选实施例，但是本领域内的技术人员应该意识到可在不偏离本发明的精神下对其进行改变和修改，且其旨在要求所有的这些改变和修改同样完全涵盖在如权利要求所述的本发明的实际范围内。

[0188] 表1

[0189]

[0190]

[0191]

[0192]

[0193]

[0194]

[0195]

[0196]

[0197]

[0198]

[0199]

[0200]

[0201]

[0202]

[0203]

[0204]

[0205] 表S1(引物)

[0206]位点 基因 序列 Tm
Ent638_2025 budRf TATTCCCGCAGGAGATTGCT 58
Ent638_2025 budRr AAGCTGTGACGACTGCAACATATT 59
Ent638_2026 budAf GGCGAAATGATTGCCTTCAG 59
Ent638_2026 budAr CCAGGTCATTACTGCGAAAGGT 59
Ent638_2027 budBf ACAGCCCCGTTGAATACGAA 59
Ent638_2027 budBr GGGCACATAGTTGCGTTCTTC 58
Ent638_2028 budCf TTTGCGGCAGTGGAGAAAG 59
Ent638_2028 budCr TGGCGTGATCGACTCAATTG 59
Ent638_4249 repAf TAGCAAGAAAACAGGCGACAAGT 59
Ent638_4249 repAr GCAGTCGCTCATCAGCTTGA 59
Ent638_R0104 16Sf AGTGATTGACGTTACTCGCAGAAG 59
Ent638_R0104 16Sr TTTACGCCCAGTAATTCCGATT 59

[0207] 表S4微阵列

[0208]

[0209]

[0210]

[0211]

[0212]

[0213]

[0214]

[0215]

[0216]

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[0218]

[0219]

[0220]

[0221]

[0222]

[0223]

[0224]

[0225]