[0001] 本发明涉及一种原油降解肠杆菌及其应用，并提供了一种利用原油降解菌快速降解原油的方法，属于环境污染技术领域。

[0002] 表面活性剂是一种既有亲水基团又有亲油基团的物质，其具有润湿或抗粘、乳化或破乳、起泡或消泡以及增溶、分散、洗涤、防腐、抗静电等作用，是一种用途非常广泛的精细化工产品。表面活性剂除了在日常生活中作为洗涤剂，其他应用几乎可以覆盖所有的精细化工领域。

[0003] 然而化学表面活性剂的大量使用可能引起土壤或者水体的二次污染，并且大多数化学表面活性剂都难以被再次利用因而会在环境中滞留。因此，对环境友好的生物表面活性剂越来越受到人们的关注。

[0004] 生物表面活性剂是天然表面活性剂的一种，主要是指微生物在一定培养条件下产生的一些具有明显降低表面张力的代谢产物。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外，还具有一般化学表面活性剂所不具备的环境友好特性，如无毒、可自然生物降解、生态安全等优点。另外生物表面活性剂也常比化学表面活性剂具有更高的表面活性，乳化能力也更强，在医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业方面具有潜在的应用价值。特别是在难降解疏水性有机物如多环芳烃、多氯联苯、石油烃的修复中，生物表面活性剂发挥着重要的作用，它使疏水性有机物乳化并明显增溶，使得降解菌更容易降解这些物质。

[0005] 另外，生物表面活性剂在极端环境中依然能发挥作用，其不受温度等外界环境的影响，而一般的化学表面活性剂对环境条件要求严格，在极端环境下得不到应有的效果。而且，生物表面活性剂可以被微生物利用，不会在环境中长期残留，对环境不会产生有害影响。然而，生物表面活性剂目前还是难以商业化利用，主要是因为其产率低以及底物成本高，纯化过程投资大。获得能大量代谢的生物表面活性剂的菌种是解决目前生物表面活性剂成本高的一种途径。

[0006] 公开号为CN 102978135A的中国专利公开了一种产脂类生物表面活性剂的原油降解菌及应用。该原油降解菌的名称为铜绿假单胞菌MZ01，于2012年7月12日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6354。该菌株主要产脂类，其CMC值为0.1g/l，并能将水的表面张力从72.0mN/m降至29.9mN/m，其对疏水性有机物具有明显的乳化和增溶作用，而且作用持久；其于25℃、pH值为7，转速为150rpm的条件下5d可将原油从200mg/l降至约92mg/l左右，石油总去除率为达52％以上，其中该菌株对原油的降解率在30％以上。

[0007] 公开号为CN 102911892A的中国专利公开了一株石油降解菌及其在三元采油污水处理中的应用。属于石油微生物领域。它解决了目前缺少可应用到三元采油污水处理技术中的微生物菌种的问题。本发明石油降解菌为假单胞菌(Pseudomonassp.)JNS01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012021。本发明假单胞菌JNS01能够在浓度高达1800mg/L、pH值为10.5的聚丙烯酰胺碱性溶液中生长良好，经过假单胞菌JNS01处理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可达到92％。

[0008] 公开号为CN 103160452A的中国专利公开了一种快速从油污土壤中分离并筛选产表面活性剂石油烃降解纯菌株的方法。首先从油田采集油污土壤，按5％的量添加至原油为唯一碳源并且含量逐渐提高的烃降解培养基中，在恒温摇床上进行富集培养。富集后的菌液稀释到一定程度后在血平板上涂布培养，30℃培养1-3d，取血平板上透明圈边缘清晰而大的菌落，液体肉胨培养基培养后用灭菌牙签钝头蘸取菌液点种于油平板上，30℃培养3d，取噬油斑明显且较大的菌落接种于肉胨斜面并保存备用并用肉胨培养基培养后，先后接种烃降解培养基和产表面活性剂培养基中，30℃培养7d和3d，测定烃降解能力和产表面活性剂的能力，获得产表面活性剂的石油烃降解菌株。

[0009] 公开号为CN 102839124A的中国专利公开了一种极端环境原油降解菌的分离筛选方法，解决了现有原油降解菌分离筛选方法存在的操作过程复杂、分离效率低、分离所得微生物效果差的缺点。其技术特点是一、采用无机盐培养基从极端环境污染土壤中富集原油降解菌；二、将所得富集菌液梯度稀释后，进行间歇试验考察原油降解情况；三、采用DGGE技术分析各稀释度菌液的群落组成，从而得到原油去除效果与富集菌液相类似、组成最为简单的菌液，即为高效原油降解 功能菌。该方法具有简单、高效、快速的特点，分离所得原油降解菌通常具有较高的去除效果。

[0010] 公开号为CN 101607120的中国专利公开了一种用芽孢杆菌降解原油的方法，按80～150ml原油培养液接种0.8～1.5ml芽孢杆菌菌液的比例配制降解液，将降解液在
30～37℃温度，150～200r/min的摇动条件下，降解10～30天，芽孢杆菌菌液的浓度为
107～109个/ml，原油培养液的质量浓度为0.5～5％；本发明是利用单一种类的芽孢杆菌，省去了目前要由两种及以上菌种配制降解菌液的麻烦，操作更加方便，本发明也不需要另外配制营养液，也不用附加表面活性剂，降解成本可以更低，本发明对原油降解的效果较好，20天左右基本可以将原油完全降解。因此本发明是一种操作方便，成本较低，降解效率较好的用芽孢杆菌降解原油的方法。

[0011] 公开号为CN 103436464A的中国专利公开了一种耐低温石油降解菌株、培养方法、及其应用。本发明的耐低温菌芽孢杆菌的培养方法包括：将石油污染土样利用生理盐水溶解，摇床振荡后静置分层，将菌悬液接入原油无机盐液体培养基中，摇床培养后取液体培养基中适量下层发酵液，接种至新鲜无机盐液体培养基中继续培养，如此反复进行5次。对所得菌液进行梯度稀释，涂布至原油无机盐固体培养基上培养，观察培养基菌落数量，选择数量适中的培养基，进行划线培养；反复驯化、划线培养，直至得到多株纯菌。本发明的耐低温菌芽孢杆菌优先降解原油组分中的中长链饱和烷烃，该菌可应用于石油烃降解和土壤或水体石油污染的生物修复中，尤其可用于低温环境。

[0012] 公开号为CN 101947544A的中国专利公开了一种石油污染土壤修复的生物刺激方法。该方法在不投加石油污染物生物降解菌剂的前提下，通过添加土壤调理剂，改良土壤环境，降低土壤粘性，增加土壤通透性，调节土壤保水能力，同时调节本土微生物生长所必需的无机及有机营养成分，维持土壤pH值在中性附近，促进土壤中石油污染物降解微生物的生长和繁殖，提高本土微生物对石油污染物的降解效率；通过种植植物，改善植物根系附近的土壤微环境，植物通过向根系分泌氨基酸等低分子有机物而刺激本土微生物的大量繁殖，间接促进石油污染物的根系微生物降解；加速原油污染土壤的修复、恢复土壤原来状态。

[0013] 土壤作为环境中最大的受体，是一种有机和无机的结合体，含有多种石油烃类污染物降解微生物，因此对污染有着强大的缓冲与自我修复能力。土壤在没有 受石油污染前，其自然群落结构或微生物种群并不适合石油污染；当土壤环境被石油污染后，微生物群落结构会发生变化，能适应石油污染的种群继续发展或可以更好地发展种群，这些本土微生物在利用土壤中的石油及其衍生物中的碳氢化合物作为其碳源和能源生长繁殖的同时实现了石油污染物的降解。大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生物数量急剧增长，Atlas报道在正常环境下降解菌一般只占微生物群落的1％，而当环境受到石油污染时，降解菌比例则提高到10％。

[0014] 利用土壤中本土石油烃降解微生物能够进行石油污染土壤的修复，但由于土壤颗粒与石油污染物结合后，油土分离难度大，在不投加外源石油烃降解菌剂的前提下，环境因素的影响更加显著，从而减缓了这些污染物的降解速度。这些环境影响因素主要包括以下几种：环境温度、土壤湿度、土壤中营养物质水平、电子受体供应情况、土壤中氧气浓度、土壤pH值和土壤渗透能力等。因此，改善石油污染土壤的性质，调控这些影响修复效率的外部影响因素对于提高修复效果具有极其重要的作用。通过采取工程措施改良土壤环境，增加石油污染物的生物可利用性，提供更加适宜本土石油烃降解微生物的土壤环境条件，能够刺激本土石油烃降解微生物的生长和繁殖，提高本土石油烃降解微生物自身的降解能力，从而加速石油污染物的降解，提高石油污染土壤的修复效率。

[0015] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种产脂类生物表面活性剂的原油降解肠杆菌。

[0016] 本发明的另一目的在于提供所述产脂类生物表面活性剂的原油降解肠杆菌的应用。

[0017] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种产脂类生物表面活性剂的原油降解菌，名称为肠杆菌(Enterobacter sp.)ODB01，于2014年12月23日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10233。

[0018] 所述的肠杆菌ODB01的形态为：菌落光滑、球型，边缘平整，呈淡黄色，属革兰氏阴性菌，电子显微镜下观察该菌体的形态为短杆菌；

[0019] 所述的肠杆菌ODB01的16S rDNA如SEQ ID NO.3所示；

[0020] 所述的产脂类生物表面活性剂的原油降解菌在制备生物表面活性剂以及石油 降解中的应用。

[0021] 其中，所述的肠杆菌的筛选过程：首先将原油污染的水和土壤等样品混合物样品-5稀释至10 涂布于固体分离培养平板上，30℃恒温培养，分离得到单菌落共453个，挑取单菌落于盛有3mL液体分离培养基的10mL的试管中，30℃恒温摇床培养12h后，转接至含有
5mL原油液体培养基的试管中，30℃，150rpm条件下进行培养，实时观察培养液中原油的变化情况，通过原油降解的能力为主要指标进行选择，得到原油降解能力较高的菌株，并进行菌种鉴定，其16S rDNA基因序列测定结果见SEQ ID NO.3。选育菌种的培养特征、显微特征、rRNA基因序列等数据分析其鉴定结论为肠杆菌(Enterobacter sp.)。

[0022] 固体分离培养的配方为硫酸铜0.5mg、硫酸亚铁5mg、氯化锌5mg、硫酸锰5mg、氯化钙20mg、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾0.5g硫酸镁1g、氯化钠1g、硝酸铵2g、原油1mL、琼脂10g，用蒸馏水定容1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0023] 液体分离培养基的配方为硫酸铜0.5mg、硫酸亚铁5mg、氯化锌5mg、硫酸锰5mg、氯化钙20mg、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾0.5g硫酸镁1g、氯化钠1g、硝酸铵2g、原油1mL，用蒸馏水定容1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0024] 原油液体培养基的配方为硫酸铜0.5mg、硫酸亚铁5mg、氯化锌5mg、硫酸锰5mg、氯化钙20mg、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾0.5g硫酸镁1g、氯化钠1g、硝酸铵2g、原油5mL，用蒸馏水定容1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

[0025] 发明内容之二.提供所述肠杆菌(Enterobacter sp.)，CGMCC No.10233发酵制备的胞外酶。所述菌株胞外酶是一组复合酶，其中包括脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、凝乳酶等。

[0026] 在一个具体实施方案中，所述的肠杆菌发酵液还包括：该菌培养基质及该菌代谢产物。

[0027] 本发明第二个发明目的是肠杆菌在原油污染地区中用于快速清洁的用途。

[0028] 其中所述的用途包括：用肠杆菌发酵剂(固态制剂)喷洒原油污染土壤的处理工艺。

[0029] 在一个具体实施方案中，使用上述的肠杆菌发酵剂(固体粉剂)适量无菌水稀释喷雾原油污染土壤的处理工艺，可快速处理原油污染问题，与传统清洁工艺比较，可以缩短清洁处理时间，同时减少了污染机会，提高原油污染后的清洁度。

[0030] 其中，用肠杆菌发酵液拌料(原油污染土壤)发酵工艺：采用肠杆菌(固体粉剂)，10
每克含微生物数量1×10 cfu以上，先用无菌水将粉剂稀释，喷雾接种在原油污染土壤上，接种后进行发酵清洁。采用肠杆菌固态粉剂利用一定无菌水调成接种液(液体制剂)，每毫
7
升含微生物数量1×10cfu以上，将发酵液接种在原油污染土壤上，进行发酵。用量是每亩污染土壤用肠杆菌0.5kg～1.0kg/亩。

[0031] 另外，直接使用肠杆菌发酵液，缩短了清洁原油污染土壤周期10-15天，减少原油污染风险。附图说明

[0032] 图1：筛选得到的具有降解原油作用的主要微生物菌株。左1为对照；左2-9为不同的菌株在含有原油的无机盐培养基中培养，左2为ODB01菌株。

[0033] 图2：肠杆菌(Enterobacter sp.)ODB01的药敏性试验结果图。1-11分别代表氯霉素、阿米卡星、新霉素、链霉素、多黏霉素B、萘啶酸、氨苄西林、红霉素、青霉素、新生霉素和四环素等抗生素处理的结果图。

[0034] 技术效果

[0035] (1)本发明提供的菌株主要产脂类，对疏水性有机物具有明显的乳化和增溶作用，而且作用持久。

[0036] (2)本发明提供的菌株25℃、pH值为7，转速为150rpm的条件下5d可将原油从50g/L降至约20g/L左右，石油总去除率为达80％以上，其中该菌株对原油的降解率在60％以上。

[0037] 下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

[0038] 实施例1：肠杆菌ODB01菌株分离

[0039] 首先将原油污染的水和土壤等样品混合物样品稀释至10-5涂布于固体分离培养平板上，30℃恒温培养，分离得到单菌落共453个，挑取单菌落于盛有3mL液体分离培养基的10mL的试管中，30℃恒温摇床培养12h后，转接至含有5mL原油液体培养基的试管中，30℃，150rpm条件下进行培养，实时观察培养液中原油的变化情况，从中筛选出49株具有原油降解能力的菌株，通过多次重复筛选确定109菌株(即为肠杆菌ODB01)为这些菌株中原油降解能力最强的菌株， 进一步采用重量法得知109菌株在150rpm，30℃摇床培养7后对原油的降解率达到45％。

[0040] 实施例2：菌株鉴定

[0041] 一、形态和生化鉴定

[0042] 1、形态为肠杆菌，根据细菌鉴定手册对其进行生理生化鉴定，结果如下：

[0043]

[0044] “+”表示阳性；“-”表示阴性

[0045] 2、药敏性试验结果表明：肠杆菌(Enterobacter sp.)ODB01对氯霉素最敏感，其次为阿米卡星、新霉素、链霉素、多黏霉素B和萘啶酸，但对氨苄西林、红霉素、青霉素、新生霉素和四环素等不敏感。

[0046] 二、分子鉴定

[0047] 1、设计并选择合适引物

[0048] 根据细菌的16S rDNA基因序列，设计PCR引物，分别为：

[0049]SEQ ID No：1 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3(SEQ ID No：1)
SEQ ID No：2 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3(SEQ ID No：2)

[0050] 相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。

[0051] 2、通用引物扩增

[0052] 对肠杆菌的DNA，使用ABI 9700型PCR仪，进行生物学实验操作。

[0053] (1)PCR的反应体系为：

[0054]PCR反应缓冲液(10x PCR Buffer with 20mM MgCl2) 2.5μL
dNTP mix(25mM each) 1μL
高保真Taq酶(PCR Enzyme，5U/μL) 1μL
SEQ ID No：1(1μM) 1μL
SEQ ID No：2(1μM) 1μL
细菌DNA 1μL
超纯水 17.5μL

[0055] 以上试剂，除细菌DNA、超纯水、引物外，均来自于美国Sequenom公司。

[0056] (2)PCR的循环参数为：95℃，4分钟，1个循环，95℃，20秒，56℃，30秒，72℃，60秒，45个循环，72℃，3分钟，1个循环，4℃，保存。

[0057] 3、PCR扩增产物经生工生物工程(上海)有限公司进行测序，获得肠杆菌ODB01的16S rDNA测序结果：见SEQ ID No：3。

[0058] 实施例3：肠杆菌ODB01的降解原油特性

[0059] 配制培养基的配方为硫酸铜0.5mg、硫酸亚铁5mg、氯化锌5mg、硫酸锰5mg、氯化钙20mg、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾0.5g硫酸镁1g、氯化钠1g、硝酸铵2g、原油10g，用蒸馏水定容1000mL，pH自然，每瓶装400mL，121℃灭菌20min。接种1mL的ODB01菌液，30℃，
200rpm条件下进行摇床培养7天后，将400mL发酵液在8000rpm离心10min后，去除肠杆菌体后用石油醚抽提，取石油醚萃取液，减压浓缩去除石油醚称重。结果发现经过7d处理Enterobacter sp.ODB01可将原油从10g/L降至约2g/L左右，原油总去除率达80％左右。

[0060] 实施例4：肠杆菌ODB01修复原油污染土壤作用

[0061] 配制肠杆菌ODB01的液体培养基成份为蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠10g，氯化铵60mg，葡萄糖300mg，磷酸二氢钾60mg，原油1g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。接种1mL的ODB01菌液，30℃，150rpm条件下进行摇床培养2天后，肠杆菌ODB01发酵液备用。用10L营养钵装入果园地的土壤，分为三组，第一组和第二组中每钵加入200g原油，第三组每钵加入200g蒸馏水作为对照，第一组加入200ml肠杆菌ODB01菌液，第二组加入200ml培养液(蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠10g，氯化铵60mg，葡萄糖300mg，磷酸二氢钾60mg，原油1g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min)。各处理分别置于30℃的温室中培养。每天定量补充水分，30d后将各个钵中土壤取出，加入60℃水进行浸泡30min，静置10min后在8000rpm离心10min后，去沉淀，用石油醚抽提，取石油醚萃取液，减压浓缩去除石油醚后，各组称重。第一组平均重量为99g、第二组平均重量为197g、第三组平均重量为0.2g，原油总去除率达50％左右，修复效果非常显著。

[0062] 肠杆菌ODB0116S rDNA的SEQ ID No：3序列如下：

[0063] GTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGG GGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAAGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCCTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCTGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。