细菌及其应用 |
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| 申请号 | CN201180011767.9 | 申请日 | 2011-03-02 | 公开(公告)号 | CN102884175A | 公开(公告)日 | 2013-01-16 |
| 申请人 | 德诺芙公司; | 发明人 | 让-米歇尔·卡拉维利; 雅克·比顿; 让-保罗·里奥奈蒂; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及新的细菌及其应用。具体来说，本发明涉及异常球菌属（Deinococcus）细菌及其在制药和 农用化学品 工业中的应用，例如用于降解 生物 质 和/或生产工业上重要的代谢产物或药物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.分离的细菌，其中所述细菌具有大于3.9兆碱基的基因组大小，并且其中所述细菌（i）包含16S rDNA，所述16S rDNA在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA和 |
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| 说明书全文 | 细菌及其应用技术领域背景技术[0002] 自从20世纪70年代以来，木质纤维生物质的转化已成为大量研究工作的主题（Blumer-Schuette等，2008，“用于生物质转化的极端嗜热微生物：现状和展望”（Extremely thermophilic microorganisms for biomass conversion:status and prospects），Curr Opinion Biotechnol 19,pp.210-217；Perez等，2002,Int Microbiol 5,pp 53-63）。然而，据信未来的生物燃料或生物能产品将源自于原始木质纤维生物质而不是农业原材料。 [0003] WO2009/063079描述了使用抗胁迫细菌例如异常球菌属（Deinococcus）细菌，通过生物质的降解和发酵来生产生物能产品和代谢产物。在本申请的优先权日尚未公布的WO2010081899，公开了细菌例如异常球菌属（Deinococcus）细菌生产有价值药物、包括抗生素的能力。 [0004] 通过从事以鉴定具有改进性质的细菌为目的的研究，本发明人鉴定并分离到被称为M1-3H的异常球菌属（Deinococcus）物种的特定细菌。该细菌由本发明人根据它降解生物质组分并产生代谢产物的显著能力而分离和选择。通过对该细菌进行更详细分析，本发明人惊奇地发现它的基因组与经典异常球菌属（Deinococcus）细菌的基因组大小相比非常大，即长度超过4兆碱基（Mb）。事实上，异常球菌属（Deinococcus）细菌的基因组的平均大小在3.0Mb左右。此外，本发明人还惊奇地发现，该细菌的基因组含有显著程度的基因组多样性，即显著水平的通过遗传转移从多种其他物种获得的遗传物质。 [0005] 异常球菌属（Deinococcus）的几种细菌已被测序：耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）（White O 等，Science 1999Nov 19;286（5444）:1571-7）,Deinococcus geothermalis（Makarova KS等，PLoS One.2007Sep 26;2（9）:e955）和沙漠异常球菌（Deinococcus deserti）（DeGroot A.等，PLoS Genet.2009Mar;5（3）:e1000434）。这些细菌都未显示出M1-3H的性质。 [0006] 因此，本发明第一次描述了与异常球菌属（Deinococcus）相关的具有下述出人意料的性质的细菌的存在：（1）显示出明显大于已知异常球菌属（Deinococcus）物种的基因组，以及（2）已从多种其他物种获得遗传多样性。本发明还第一次描述了与异常球菌属（Deinococcus）相关的具有下述出人意料的性质的细菌的存在：（1）显示出明显小于已知异常球菌属（Deinococcus）物种的基因组，以及（2）已从多种其他物种获得遗传多样性。这些细菌以及它们的应用，代表了本发明的主题内容。 [0007] 发明概述 [0008] 本发明涉及新的细菌、它们的分离和培养方法以及它们的应用，特别是在制药和农用化学品工业中，例如用于将木质纤维生物质或其衍生物转化成有价值产品、包括可发酵糖类和生物能产品，用于生产药物或作为解毒剂。 [0009] 本发明的一个目的是一种分离的细菌，其中所述细菌具有大于3.9兆碱基或小于2.9兆碱基的基因组大小，并且其中所述细菌（i）所包含的16S rDNA在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA扩增后产生约158碱基对的片段，2 和/或（ii）抵抗4mJ/cm 的UV处理。 [0010] 本发明的另一个目的是一种分离的细菌，其中所述细菌所包含的16SrDNA在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA扩增后产生约158碱基对的片段，并且其中所述细菌的基因组具有超过15%、优选超过25%、更优选超过50%的得自于基因转移的基因组多样性。 [0011] 本发明的细菌的其他具体特征包括下列任一项、几项或全部： [0012] -所述细菌还包含重组核酸分子， [0013] -所述细菌对胁迫有抗性， [0014] -所述细菌是嗜中温细菌或嗜热细菌， [0015] -所述细菌能够在4至9之间的pH下生存， [0016] -所述细菌能够在2%乙醇存在下生存， [0019] 所述细菌优选为异常球菌属（Deinococcus）细菌，或其基因组包含能够与耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）或Deinococcus geothermalis的基因组杂交（在严紧条件下）并代表全基因组的至少60%、优选至少65、70、75、80或85%的部分的细菌。在特定实施方案中，所述细菌是具有在序列上与异常球菌属（Deinococcus）的16SrDNA序列至少70%、优选至少80%一致的16S rDNA分子的细菌。 [0020] 本发明还涉及如上定义的细菌的应用，特别是在制药或农用化学品工业中。 [0021] 在特定实施方案中，本发明涉及如上定义的细菌的应用，用于生产代谢产物。 [0022] 本发明还涉及用于代谢产物生产的方法，所述方法包括选择产生所述代谢产物的本发明的细菌，培养所述细菌，以及从培养基收集所述代谢产物。 [0023] 在另一个特定实施方案中，本发明涉及如上定义的细菌的应用，用于药物、疫苗或佐剂的生产。 [0024] 本发明还涉及用于生产药物、疫苗或佐剂的方法，所述方法包括选择产生所述药物、疫苗或佐剂的本发明的细菌，培养所述细菌，以及从培养基收集所述药物。 [0025] 在另一个特定实施方案中，本发明涉及如上定义的细菌的应用，用于重组蛋白的生产。 [0026] 在另一个特定实施方案中，本发明涉及如上定义的细菌的应用，用于酶的生产。 [0027] 本发明还涉及用于生产蛋白质或酶的方法，所述方法包括选择产生所述蛋白质或酶的本发明的细菌，培养所述细菌，以及从培养基收集所述蛋白质或酶。 [0028] 在另一个特定实施方案中，本发明涉及如上定义的细菌的应用，用于生物质的改性。 [0029] 在另一个特定实施方案中，本发明涉及如上定义的细菌的应用，用于脱毒。 [0030] 本发明的另一个目的是用于生物质改性的方法，所述方法包括将生物质暴露于本发明的细菌或其提取物。 [0031] 本发明还涉及用于分离本发明的细菌的方法，所述方法包括： [0032] a）提供样品； [0033] b）将所述样品暴露于辐射处理； [0034] c）从所述暴露的样品选择活细菌；以及 [0035] d）从所述活细菌选择基因组大小大于3.9兆碱基的细菌。 [0036] 本发明还涉及用于分离本发明的细菌的方法，所述方法包括： [0037] a）提供含有异常球菌属（Deinococcus）细菌的样品； [0038] b）测试所述样品中细菌的基因组大小；以及 [0039] c）从所述样品选择基因组大小大于3.9兆碱基的异常球菌属（Deinococcus）细菌。 [0040] 本发明还涉及用于分离本发明的细菌的方法，所述方法包括： [0041] a）提供含有异常球菌属（Deinococcus）细菌的样品； [0042] b）测试所述样品中细菌的基因组多样性水平；以及 [0043] c）从所述样品选择基因组多样性水平超过15%的异常球菌属（Deinococcus）细菌。 [0045] 图1：使用引物DeinoF1和DeinoR3执行的PCR。第4、5、10、11、14和15道是异常球菌属（Deinococcus）菌株，第1至3、6至9、12和13道不是异常球菌属（Deinococcus）菌株。 [0046] 发明详述 [0047] 本发明描述了具有降解生物质和/或生产生物能产品、药物或有价值代谢产物的显著能力的新细菌的分离和表征。 [0048] 定义 [0049] 基因组大小 [0050] 基因组大小是基因组的一个拷贝内包含的DNA的总量。它典型地被测量为核苷酸碱基对的总数，典型以兆碱基（百万碱基对，缩写为Mb或Mbp）为单位。测量基因组大小的方法本身在本技术领域中是公知的。它们包括但不限于测序技术（例如www.illumina.com/Documents/.../technote_denovo_assembly_ecoli.pdf）、全基因组杂交和Cot1/2计算(Chakrabarti SK等，Cellular and Molecular life science,198440:1290-1291）或脉冲场电泳（Chen H等，Journal of bacteriology 1990,190:4206-4213）。 [0051] 基因组多样性 [0052] 基因组多样性是指生物体不作为另一个生物体的后代而从其获得的遗传物质的水平。基因组多样性可能起因于通过进化，遗传物质经过基因转移、例如水平基因转移（HGT）、又称侧向基因转移（LGT）而掺合。当来自于特定生物体的基因或蛋白质序列与来自于非常远缘的生物体的同源物的序列相似性比它与明显更近亲缘物所具有的序列相似性更强时，发生或检测到HGT或基因组多样性。遗传物质从细菌物种向另一个细菌物种的转移可以通过几种过程发生，包括转化、接合和/或转导： [0053] 转化是指裸露DNA的摄入。它是常见的并可以介导染色体任何部分的交换；该过程主要发生在可天然转化的细菌中。 [0054] 接合是由接合性质粒或接合性转座子介导的DNA转移。它需要细胞与细胞的接触，但是可以在远缘细菌或甚至细菌与真核细胞之间发生。 [0055] 转导是指通过噬菌体的DNA转移。它要求供体和受体共有用于噬菌体结合的细胞表面受体，因此通常限于近缘细菌；被转移的DNA的长度受到噬菌体头部大小的限制。 [0056] 基因组多样性水平被计算为基因组中通过遗传转移从不同生物体获得的遗传物质的百分比。用于确定百分比基因组多样性或%HGT的预测技术包括但不限于（i）密码子测定，（ii）BLAST，（iii）基因分布，和（iv）系统发育学（Whitake JW等，Biochemical Society Transactions2009,37:792-795）。 [0057] 分离的 [0058] 就细菌而言，术语“分离的”是指所述细菌被或已被培养、富集、生长、扩增、选择和/或定性，或源自于已被培养、富集、生长、扩增、选择和/或定性的细菌。可以将分离的细菌或其后代置于不同条件或培养基中，与多种底物混合。 [0059] 代谢产物 [0060] 术语“代谢产物”是指在发酵过程期间产生的所有可能的中间体分子，包括但不限于工业上重要的化学产品，例如有机酸、醇类和结构单元。 [0062] 醇类的具体实例更优选包括乙醇、丁醇、丙醇、甲醇、异丙醇、丙二醇、甘油或2,3-丁二醇，优选为乙醇。 [0064] 药物 [0065] 术语“药物”总的来说是指具有生物活性的任何化合物。该术语包括可用于人类或兽医制药工业的具有生物活性的任何蛋白质、多肽、肽、化学药物、脂类、糖类等。这样的药物的实例包括但不限于抗生素、激素、抑菌化合物、抗代谢物剂、化疗化合物、抗真菌剂、抗病毒化合物、细胞因子活性化合物、细胞生长因子、疫苗和佐剂。 [0066] 生物质 [0067] 在本发明的情形中，术语“生物质”是指可以用作燃料或用于工业生产的活的或最近死去的生物材料。最常见情况下，生物质是指种植用于产生电力或生产生物燃料的植物物质，但是它也包括用于生产纤维、化学品或热量的植物或动物物质。生物质也可以包括可以作为燃料燃烧的生物可降解废物。术语生物质不包括已通过地质过程转化成诸如煤或石油的物质的有机材料。 [0069] 本发明的生物质包含原始生物质和/或二次生物质。原始生物质是来自于生物物质的未处理过的材料。实例包括林业产品例如不适合用于生产木材和纸的成材的树，农业产品例如草、作物和畜肥，以及水产品例如海藻和海草。二次生物质是最初源自于原始生物质的任何材料，其已经历显著的化学和物理变化。实例包括纸张、皮革、棉、麻、天然橡胶产品、食品加工副产物和用过的烹调油。 [0070] 本发明的术语木质纤维生物质是指含有木质素、纤维素和/或木聚糖的原始生物质。因此，术语木质纤维生物质主要是指生物来源的未加工材料，例如林业产品包括不适合用于生产木材和纸的成材的树，农业产品例如草、作物和动物粪尿，以及水产品例如海藻和海草。生物质的具体来源包括但不限于硬木或软木树干、玉米芯、麦秸、草、叶、种子、纸张等（参见例如Sun等，Bioresource Technology 83（2002）1–11）。术语木质纤维生物质应该与转化的生物质或二次生物质区分开，后者基本上包含水解的预处理过的生物质产品。 [0071] 木质纤维生物质的实例包括源自于众多类型的植物的木质或植物材料，所述植物包括芒草、柳枝稷、麻类植物、甜菜、小麦、谷物、杨树、柳树、高粱、甘蔗和从桉树到油棕的多种树种。 [0072] 当在本文中使用时，术语“生物质衍生物”是指源自于如上定义的原始生物质和/或二次生物质的所有分子，特别是最初源自于原始生物质、已经历显著化学和物理变化的任何材料，例如淀粉、纤维素、半纤维素和木质素。 [0073] 抗胁迫性 [0074] 在本发明的情形中，术语“抗胁迫细菌”是指当被胁迫破坏时具有完全或部分重新组装其基因组的能力的细菌。所述胁迫可以是任何细胞破坏性DNA损伤性处理，即在大肠杆菌（E.coli）细菌培养物中足以引起90%或以上细胞死亡的处理。更优选情况下，所述细胞破坏性DNA损伤性处理是在大肠杆菌（E.coli）培养物中足以使细菌滴度降低至少2log的处理。这样的处理的实例包括辐射，优选为重复的辐射，例如重复和连续的UV辐射，和/或使用基因毒性剂。优选的胁迫处理是在约5”至5’的时间长度中施加的0.5至400mJ/2 2 2 cm 之间、更优选1至200mJ/cm 之间、典型为1至100mJ/cm 之间的UV处理。优选的UV处 2 理是30秒4mJ/cm，其可以以1至8小时之间、优选3至5小时之间、更优选约4小时的时间间隔重复。 [0075] 现在，本发明提供了具有出人意料的性质和优点的新细菌。这些细菌具有惊人地大的基因组和/或惊人地高的基因组多样性水平，并显示出在制药和农用化学品工业中用于化合物生产的有利性质或活性。 [0076] 更具体来说，本发明的目的在于一种分离的细菌，其中所述细菌具有大于3.9兆碱基的基因组大小，并且其中所述细菌（i）所包含的16SrDNA在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA（SEQ ID NO:1）和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA（SEQ ID NO:2）2 扩增后产生约158碱基对的片段，和/或（ii）抵抗4mJ/cm 的UV处理。 [0077] 更优选情况下，所述细菌的基因组具有大于4.0兆碱基、大于4.2Mb、大于4.5Mb或甚至大于5Mb的大小。考虑到相关菌株例如异常球菌属（Deinococcus）菌株的平均基因组约为3.0Mb，这种细菌的发现是完全出乎意料的。 [0078] 此外，本发明人发现了具有异常高的基因组多样性、即从多种生物体获得的遗传物质的水平的细菌。更具体来说，本发明的细菌优选具有超过15%、更优选25%、30%、40%或甚至超过50%的基因组多样性。这种性质是特别引人注目的，因为多种多样遗传物质的存在为细菌提供了广范围的性质和活性。 [0079] 本发明的具体目的是一种分离的细菌，其中所述细菌所包含的16SrDNA在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA扩增后产生约158碱基对的片段，并且其中所述细菌的基因组包含由基因转移产生的超过15%、优选超过25%、更优选超过50%的基因组多样性。 [0080] 上面提到的158pb片段的存在对于与异常球菌属（Deinococcus）相关的细菌来说是特征性的。如上所述的这种抵抗特定辐射条件的特点或能力，是本发明的细菌的另一个特点。 [0081] 在其他实施方案中，细菌可以进一步包含重组核酸分子，即导入到所述细菌或其原种中的重组核酸分子。这样的重组核酸典型是人造的，被工程化改造以包含特定基因或基因簇，并包含DNA或RNA。 [0082] 更具体来说，除了上述性质之外，细菌表现出下列性质中的一种或多种或全部： [0083] -它是嗜中温细菌，即能够在约30℃至35℃之间的温度下生活、生长并表现出功能性质， [0084] -它能够在4至9之间的pH下生存， [0085] -它能够在2%乙醇存在下生存， [0086] -它可以在好氧生活或厌氧生活中生长，和/或 [0087] -它能够利用纤维素或其衍生物作为碳源。 [0089] 可以将细菌培养和/或维持在任何适合的培养基和装置中。这样的培养基的实例包括实施例中所公开的复合葡萄糖培养基或限定成分培养基。适合的培养基也可商购。 [0090] 本发明的细菌的具体实例是异常球菌属（Deinococcus）菌株M1-3H和M23r-2A，或所述细菌的衍生株、突变株、转化株或后代。 [0091] 正如在实施例中所公开的，这些菌株能够在5至9之间的pH下生长，并具有非常大的基因组。此外，这些菌株具有显著的基因组多样性，当用%HGT度量时高于15或25%。 [0092] 本发明的细菌的另一个实例是异常球菌属（Deinococcus）菌株DRH048，或所述细菌的衍生株、突变株、转化株或后代。 [0093] 正如在实施例中所公开的，这种菌株能够在5至9之间的pH下生长，并具有大于5.9Mb的基因组。此外，这种菌株具有非常高的基因组多样性水平，当用%HGT度量时高于 60%，并且是甲哌力复霉素抗性的。 [0094] 这些大型异常球菌属（megaDeinococcus）细菌能够在所有测试的复合碳源、包括作为原始和复合碳源的菊粉和纤维纤维素上生长。应该指出，所测试的具有常规基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌都不能够利用所有这些碳源。所测试的具有常规基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌都不能利用菊粉和纤维素。 [0095] 所测试的大型异常球菌属细菌也能使用所有测试的氮源，包括复合氮源例如NaNO2。 [0096] 应该指出，所测试的大型异常球菌属细菌不表现出对维生素的任何营养缺陷性，并且能够在不含生物素、烟酸、吡哆醇、硫胺素和/或维生素B12的培养基上生长。DRH048甚至能够在不含维生素的培养基上生长。 [0097] 令人吃惊并且有利的是，本发明人还发现大型异常球菌属细菌表现出数量更多和多样化的参与能量代谢的基因。与具有常规基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌相比，优选的大型异常球菌属细菌表现出多至少15%、更优选至少25%、40%或甚至至少50%的参与能量代谢的基因，即参与对细胞中产生或储存能量产物或代谢产物有贡献的生物途径和反应的蛋白质的编码基因。这包括但不限于如生物质加工的途径和反应，例如生物质聚合物降解成可发酵糖类，以及糖类发酵成有价值的代谢物或产物。 [0098] 因此，这些本发明的细菌表现出在底物利用、代谢物产生和基因组多样性方面的显著和出人意料的性质的组合，所述性质对于工业目的来说特别有用。 [0099] 应该理解，使用本发明的教导和例如在实验部分中所描述的下述实验步骤，可以选择或分离到具有本发明的性质的其他细菌，例如异常球菌属（Deinococcus）细菌。具体来说，既然本发明人已经证实了某些异常球菌属（Deinococcus）或相关细菌表现出大基因组和高基因组多样性的能力，专业技术人员按照实验部分中提供的流程方案，能够分离到具有这样的性质的其他菌株。 [0100] 就此而言，本发明的另一个目的是分离细菌的方法，所述方法包括： [0101] -提供可能含有细菌的样品， [0102] -对所述样品进行辐射处理， [0103] -从所述处理过的样品分离生长的或活的细菌，以及 [0104] -从所述生长的或活的细菌选择基因组大于3.9兆碱基的细菌。 [0105] 方法可以使用包含未定性细菌的多种样品，特别是使用是或源自于环境样品的样品来进行。在本发明的情形中，环境样品包括含有（多种）未定性（微）生物，特别是未培养微生物（例如尚未以分离的形式有目的地培养和繁殖的微生物）的任何样品。样品可以获自或源自于天然环境或人造或特别产生的环境。 [0106] 正如指出的，样品可以是任何环境样品，例如获自或源自于土壤、水、植物提取物、生物材料、沉积物、泥炭田、工业废水或场所、矿物提取物、沙土等的环境样品。样品可以从多种地区或条件收集，例如但不限于热带地区、火山地区、森林、农田、工业区域等。样品通常含有多种（未定性的、未培养的）微生物物种，例如陆生微生物、海洋微生物、淡水微生物、共栖微生物等。这些环境微生物的物种包括细菌、藻类、真菌、酵母、霉菌、病毒等。微生物可以包括嗜极微生物，例如嗜热微生物。样品典型地包含多种这样的（未培养的）微生物物种及其各种不同的量。此外，样品还可以包含已知和/或可培养微生物（例如原核或真核微生物）。 [0107] 应该理解，本发明不限于任何特定类型的样品或环境微生物，而是可以使用包含未培养微生物的任何样品来执行。 [0109] 对于在本发明中的使用来说，样品可以是湿润的、可溶的、干燥的，采取悬液、糊状物等的形式。此外，在方法的步骤b）之前，可以对样品进行处理以改进方法，例如通过如过滤、洗涤、浓缩、稀释、导引、干燥等来富集微生物。 [0110] 在特定实施方案中，样品采取过滤过的悬液形式。更具体来说，在处理步骤b）之前，可以将样品除菌过滤和/或置于无菌水中。 [0111] 方法的步骤b）包括对样品（即样品中包含的微生物）进行细胞破坏性DNA损伤性处理，优选为辐射处理，特别是重复的辐射处理。 [0112] 细胞破坏性DNA损伤性处理是指在样品中引起显著细胞死亡的处理，与引入DNA修饰的纯粹的诱变处理相反。具体来说，细胞破坏性DNA损伤性处理是在大肠杆菌（E.coli）细菌培养物中足以引起90%或以上细胞死亡的处理。更优选情况下，细胞破坏性DNA损伤性处理是在大肠杆菌（E.coli）培养物中足以使细菌滴度降低至少2log的处理。本发明人事实上已证实，细胞破坏性DNA损伤性处理的使用允许以高效率分离和选择产生有价值代谢产物的比例偏低的细菌。 [0113] 处理优选包括对样品进行辐射，其时间长度足以在样品中存在的微生物中诱导显著的细胞死亡。 [0114] 在优选实施方案中，处理包括对样品进行一次或几次辐射。优选的处理包括对样品（即样品中的微生物）进行重复的（例如连续的）辐射处理。 [0115] 辐射可以选自单独或组合的UV、γ-和/或X-射线辐射，最优选为UV辐射。辐射处理典型地包括对微生物进行一次或几次连续辐射（例如1至5次），所述辐射可以具有相同或不同性质，优选具有相同性质。重复的辐射处理典型地以1至8小时之间、优选3至5小时之间、最优选约4小时的时间间隔执行。 [0116] 特别优选的处理包括对样品进行UV辐射。事实上，本发明显示，这样的处理允许以高效率从环境（例如土壤或水）样品分离产生代谢产物的比例偏低的细菌物种。辐射处理2 2 2 典型在0.5至400mJ/cm 之间、更优选1至200mJ/cm 之间，典型在1在100mJ/cm 之间，其 2 施加约5”至5’的时间长度。优选的（UV）辐射处理为4mJ/cm。 [0117] 在特定实施方案中，处理包括对样品进行至少2次、优选至少3次UV处理，每次在2 2 0.5至400mJ/cm 之间、优选每次约4mJ/cm，以1至8小时之间、优选3至5小时之间、最优选约4小时的时间间隔执行。 [0118] 在处理期间，优选将样品置于适合的培养基中，例如但不限于PGY（细菌蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L）或LB（细菌蛋白胨10g/L，酵母提取物2.5g/L，氯化钠10g/L）。应该理解，其他适合的培养基对于专业技术人员来说是公知的（Buchanan等， 1974,Difco,1995），或者可以由专业技术人员从这样的已知培养基来制备。 [0119] 处理步骤b）典型地在固体或半固体培养基中、例如在凝胶（例如琼脂）存在下执行。最优选的处理培养基包括琼脂培养基，例如软琼脂培养基。在特定实施方案中，使用TGY琼脂培养基来生长细菌。然而，也可以使用含有碳源、氮源和无机盐的不同固体培养基。也可以按照Schoenborn等2004使用连续稀释技术。 [0120] 在步骤c）中，从处理过的样品鉴定或分离活的或生长的细菌。活的或生长的细菌可以通过本身在本技术领域中已知的不同手段来鉴定。在特定实施方案中，鉴定在培养基中形成的菌落。可以将活的或生长的细菌分离并置于新鲜培养基中，用于进一步培养或扩增。 [0121] 步骤d）包括选择具有所需基因组大小的一种或多种细菌。这种选择可以使用本身在本技术领域中已知的各种技术来进行，例如脉冲场电泳、DNA杂交和Cot1/2计算，或基因组测序。 [0122] 在特定实施方案中，本发明涉及用于分离本发明的细菌的方法，所述方法包括： [0123] a）提供含有异常球菌属（Deinococcus）细菌的样品； [0124] b）测试所述样品中细菌的基因组大小；以及 [0125] c）从所述样品选择基因组大小大于3.9兆碱基、优选大于4.0兆碱基、大于4.2Mb、大于4.5Mb或甚至大于5Mb的一种或几种异常球菌属（Deinococcus）细菌。 [0126] 考虑到异常球菌属（Deinococcus）菌株的平均基因组在3.0Mb左右，发现存在这样的细菌是完全差出乎意料的。 [0127] 在本发明的特定实施方案中，上述方法还包括测定所述细菌中的基因组多样性水平，并选择基因组多样性超过15%、更优选25%、30%、40%或甚至超过50%的细菌的步骤。这样性质是特别引人注目的，因为多样化遗传物质的存在为细菌提供了广范围的性质和活性。 [0128] 就此而言，本发明还涉及用于分离本发明的细菌的方法，所述方法包括： [0129] a）提供含有异常球菌属（Deinococcus）细菌的样品； [0130] b）测试所述样品中细菌的基因组多样性；以及 [0131] c）从所述样品选择基因组多样性高于15%、更优选高于25%、30%、40%或甚至高于50%的一种或几种异常球菌属（Deinococcus）细菌。 [0132] 细菌还可以被选择或工程化改造以获得上面提到的其他性质，即代谢产物、药物、酶的生产，生物质的改性等。 [0133] 生产所选代谢产物的细菌的选择或鉴定可以按照本身在本技术领域中已知的技术来进行。在特定实施方案中，可以将鉴定或分离到的细菌暴露于一种或几种指示细胞，然后选择影响至少一种所述指示细胞的生存能力、生长、代谢、移动性、RNA表达、蛋白质表达、蛋白质分泌或病毒产生的细菌。 [0134] 在抗生素或抑菌剂的情形中，指示细胞典型是参比细菌菌株，并选择抑制或杀死所述参比菌株的测试细菌。 [0135] 在例如抗病毒化合物的情形中，指示细胞典型是产病毒细胞，并选择影响病毒感染的细胞的病毒产生或生存能力的细菌。 [0136] 在本发明的特定情况下，将细菌在特定温度条件下培养，以便鉴定或分离能够在约4至70℃的温度范围内生存或生长的细菌。更具体来说，在步骤b）、c）和/或d）期间和/或额外的步骤e）期间将细菌维持在所选温度下，以便鉴定或分离能够在所需温度下生存或生长的细菌。 [0137] 在本发明的另一种特定情况下，将细菌在特定盐度条件下培养，以便鉴定或分离能够在可能达到约5%重量/体积的NaCl或等同盐类的浓度条件下生存或生长的细菌。更具体来说，在步骤b）、c）和/或d）期间和/或额外的步骤e）期间将细菌维持在所选盐度下，以便鉴定或分离能够在所需盐度下生存或生长的细菌。 [0138] 在本发明的另一个特定和优选实施方案中，将细菌在特定pH条件下培养，以便鉴定或分离能够在约3至9.5之间、优选4至8之间的pH范围内生存或生长的细菌。更具体来说，在步骤b）、c）和/或d）期间和/或额外的步骤e）期间将细菌维持在所选pH下，以便鉴定或分离能够在所需pH下生存或生长的细菌。 [0139] 在本发明的另一个特定实施方案中，将细菌在特定的充氧条件下培养，以鉴定或分离能够在好氧和/或厌氧条件下生存或生长的细菌。更具体来说，在步骤b）、c）和/或d）期间和/或额外的步骤e）期间将细菌维持在所选充氧条件下，以便鉴定或分离能够在所需条件下生存或生长的细菌。 [0140] 在本发明的另一个特定实施方案中，将细菌在特定的培养基中培养，以鉴定或分离能够在所选碳源存在下生存或生长的细菌。更具体来说，在步骤b）、c）和/或d）期间和/或额外的步骤e）期间将细菌维持在所述培养基中，以便鉴定或分离能够使用所需碳源生存或生长的细菌。 [0141] 应该理解，对上述特征可以单独或以任何组合进行选择。例如，方法可用于鉴定能够在所需温度和盐度下，或所需温度和pH下，或所需温度、pH和充氧条件下生存或生长的细菌。 [0142] 此外，本发明的方法可以包括通过本身在本技术领域中已知的任何方法对细菌或其DNA进行生物、遗传和/或化学修饰的其他步骤，所述修饰旨在例如提高所述细菌的生存能力、生长或功能，以便例如提高抗生素活性。这样的修饰步骤包括但不限于细胞融合、加速进化、DNA改组、诱变、插入来自于另一个菌株的真核、原核或合成的核酸（例如DNA），或任何遗传工程技术。修饰也可以包括在所述细菌中导入标记基因（例如卡那霉素抗性）的步骤。 [0143] 具有生物质改性能力的细菌的选择，可以通过将细菌暴露于生物质并选择降解生物质的细胞，和/或通过选择能够利用特定碳源例如木质素、木聚糖、纤维素等的细胞来进行。 [0144] 本发明的另一个目的是如上定义的细菌的提取物。“细菌的提取物”是指从细菌获得的任何级份，例如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制备物，或通过化学、物理和/或酶处理从细菌得到的任何制备物，其基本上不含活细菌。 [0145] 本发明还涉及如上定义的细菌的衍生株、转化株、突变株或后代。术语“转化株”是指含有重组核酸（即不是天然存在于所述细菌中或已被改变或复制的核酸）的菌株。术语突变株是指从诱变处理得到的菌株。衍生株是指通过例如选择从本发明的菌株获得的任何菌株，其保留了具有大基因组和/或显著的基因组多样性的性质。 [0146] 本发明的另一个目的涉及使用如上定义的细菌生产有机酸或醇。 [0147] 本发明的另一个目的涉及使用如上定义的细菌生产生物醇，优选为乙醇。 [0148] 本发明还涉及生产醇、优选为乙醇的方法，所述方法包括将如上定义的细菌在适合的底物存在下进行培养，以及收集所述醇。 [0149] 底物可以是任何培养基或多种类型的生物质或从其衍生的产物。具体来说，所述酸和醇类可以从可再生资源、特别是植物或动物生物质或市政和工业废物来生产。 [0150] 本发明的特定目的涉及生产生物醇的方法，所述方法包括将生物质暴露于本发明的细菌或其提取物，以及任选收集所述生物醇。 [0151] 生物醇优选为乙醇。 [0152] 本发明的方法可以在转化反应器中执行。“反应器”是指常规发酵罐或为执行本发明而特殊设计的用于生物质转化的任何装置或系统，因此具体来说包括生物反应器、生物滤池、旋转生物接触器和其他气相和/或液相生物反应器，特别是那些适合处理生物质或生物质衍生物的。可用于本发明的装置可以连续或以批式载样方式使用。 [0153] 在反应器中，为了执行本发明的方法，使用至少一种本发明的细菌或其细菌提取物，同时对所述反应器进行安排和供应，以便在其中建立并维持物理化学条件，使所述细菌适用于所考虑的应用，并任选使细菌在其中的生长是可能的并优选受到促进。 [0154] 取决于底物和细菌，过程可以在好氧生活、厌氧生活或微好氧生活下执行。 [0155] 本发明的其他特点和优点将公开在下面的实施例中，所述实施例应该被当作说明性的，并且不限制本申请的范围。实施例 [0156] A.材料 [0157] 培养基 [0158] 167栖热菌属（Thermus）培养基 [0159] [0160] [0161] 磷酸盐缓冲液 [0162] [0163] 基本培养基 [0164] MOPS缓冲液 [0165] [0166] 该培养基增补有适合的碳源（葡萄糖（0.1至10%），羧甲基纤维素（0.1至10%），木聚糖（0.1至10%），木糖（0.1至10%）……）。 [0167] B.从水样分离UV抗性细菌 [0168] 通过在0.22μm硝酸纤维素滤膜（Millipore，法国）上过滤来浓缩水样，然后将其置于10ml无菌水中成为悬液。然后将过滤后的溶液超声约60秒以重悬浮细菌。 [0169] 在超声后，将150μl至2ml之间的悬液铺于通过压热法（120℃20分钟）灭菌的固体PGY-琼脂富集培养基上，所述培养基含有1g/l葡萄糖（Sigma-Aldrich，法国）、10g/l蛋白胨（Fluka，法国）和5g/l酵母提取物（Fluka，法国）。然后使用BLX-E254biolink2 （Vilber-Lourmat，法国）对接种的培养基进行3次UV处理，每次4mJ/cm，以4小时的时间间隔执行。在30至50℃温育3至4天后，可以看到所需的存活菌落。 [0170] C.从木材和卵石样品分离UV抗性细菌 [0171] 将木材和卵石样品浸泡在无菌水中，然后涡旋振荡并超声约60秒。 [0172] 在超声后，将150μl至2ml之间的悬液铺于通过压热法（120℃20分钟）灭菌的固体PGY-琼脂富集培养基上，所述培养基含有1g/l葡萄糖（Sigma-Aldrich，法国）、10g/l蛋白胨（Fluka，法国）和5g/l酵母提取物（Fluka，法国）。然后使用BLX-E254biolink2 （Vilber-Lourmat，法国）对接种的培养基进行3次UV处理，每次4mJ/cm，以4小时的时间间隔执行。在30至50℃温育3至4天后，可以看到所需的存活菌落。 [0173] D.大型异常属球菌的鉴定 [0174] 在丰富培养基上在45℃生长3天后，获得2mL UV抗性的粉色细菌培养物。显微镜观察显示，培养物由球状细胞构成。对于这种类型的细胞，如下所述执行DNA提取：在将400μL培养物以8000g离心5分钟后，弃去上清液。将沉淀用100μL无菌水和40μL12.5mM的EDTA悬浮。在37℃温育1小时后，加入10μL 0.1M的NaOH。然后将制备物在 100℃加热5分钟。在以8000g离心3分钟后，收集上清液（100-150μL），并按体积比稀释在无菌水中。 [0175] 为了检测嗜热异常球菌，使用引物DeinoF1（5’GTT ACC CGG AAT CAC TGG GCG TA3’-SEQ ID NO:1）和DeinoR3（5’GGT ATC TAC GCA TTC CAC CGC TA3’-SEQ ID NO:2）扩增16S rDNA的158bp的区域。50μL-PCR混合物由2U Taq聚合酶、5μL含MgCl2的Taq缓冲液、0.5μL 10mM的dNTP、2.25μL 10μM的每种引物和0.5μL DNA构成，并用无菌H2O补足50μL。 [0176] PCR程序为95℃5分钟的初始变性步骤，94℃变性30秒、70℃退火30秒和72℃延伸45秒的循环共30个，然后进行72℃10分钟的最后延伸。 [0177] 将5μL PCR产物上样到含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上。在UV光下观察PCR条带。158bp处主要条带的存在表明PCR产物对应于异常球菌属（Deinococcus）的部分16S rDNA。 [0178] 图1中提呈的结果显示，已从处理过的样品分离到扩增158bp片段的细菌。 [0179] 使用Macherey-Nagel Tissue试剂盒提取基因组DNA。然后使用Solexa技术对基因组DNA进行测序（Solexa inc.BioTechniques,December 2006:p29）。我 6 6 们已获得100至250的覆盖度，具有5x10 至15x10 个读出序列。 [0180] 然后确定细菌的基因组大小。在下面的表1中报告了与参比细菌相比具有出人意料大的基因组的细菌。 [0181] 表1 [0182]基因组大小 Deinococcus geothermalis DSM 11300 3247018 耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1 3284088 M1-3H 4031129 M23r-2A 3619528 [0183] 对异常球菌属（Deinococcus）细菌进行4mJ/cm2的UV处理，培养在含甲哌力复霉素（10至100μg/ml）的培养基中，然后分离能够在甲哌力复霉素上生长的细菌，并如上所公开的测量它们的基因组大小。 [0184] 鉴定并选择到异常球菌属（Deinococcus）菌株DRH048，其具有约5.980Mb的基因组大小。 [0185] E.异种异常球菌（Xeno-Deinococcus）的鉴定 [0186] 近缘物种中的基因组变异不能单用垂直传递来解释，并且HGT被认为是主要的进化因素。HGT是通过转化、转导或接合通过任何基因组获得外来基因。当来自于特定生物体的基因或蛋白质序列与来自于非常远缘的生物体的同源物的序列相似性比它与明显更近亲缘物所具有的序列相似性更强时，表明存在HGT。在鉴定到的细菌菌株中的基因组多样性水平已被测定，并显示在下面的表2中： [0187] 表2： [0188] [0189] [0190] [0191] 除了高的基因组多样性水平之外，本发明人还发现大型异常球菌属细菌表现出更高数量和多样化的参与能量代谢的基因。与具有常规基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌相比，一些测试的大型异常球菌属细菌表现出多至少15%、更优选至少25%、40%或甚至至少50%的参与能量代谢的基因。这种基因数量的增加赋予细菌以有利的性质。 [0192] F.大型异常球菌属细菌的性质 [0193] 在不同条件下对本发明的具有大基因组和/或高基因多样性水平的细菌进行试验，以评估它们的功能性质。 [0194] 结果显示，这样的细菌确实具有改进的生物活性，这与它们的基因组大小和多样性相关。具体来说，将21株细菌在不同碳源存在下培养在限定成分培养基中，并测试了它们有效生长的能力。这些测试的细菌之一是大型异常球菌属细菌DRH048，而其他20株细菌具有低于3.5Mb的基因组大小。 [0195] 获得的结果显示大型异常球菌属细菌是唯一能够利用所有测试的复合物和多样化物质作为碳源的细菌，所述物质即葡萄糖、CMC、纤维二糖、木聚糖、木糖、甘油、蔗糖、淀粉、果糖、蛋白胨、菊粉和纤维纤维素。值得注意的是，DRH048是能够利用CMC的唯一细菌。 [0196] 大型异常球菌属细菌还能降解Whatman纸（纤维纤维素），而具有正常基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌中只有15%对该试验有响应。 [0197] 大型异常球菌属细菌还能使用菊粉作为碳源，而具有正常基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌中只有5%对该试验有响应。 [0198] 重要的是，大型异常球菌属细菌是唯一具有利用所有测试的复合碳源例如菊粉和纤维纤维素的能力的细菌。所测试的具有正常基因组大小的异常球菌属（Deinococcus）细菌都不对这两个试验有响应。 [0199] 大型异常球菌属细菌还能在缺少生物素、烟酸、吡哆醇、硫胺素、维生素B12的培养基中以及在无维生素的培养基中生长。 [0200] 大型异常球菌属细菌还能利用所有测试的氮源，包括NH4Cl、尿素、NaNO3、NaNO2和谷氨酸。 |
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