改进的硫化矿石和精矿石的细菌

申请号 CN200480041721.1 申请日 2004-11-18 公开(公告)号 CN1918309A 公开(公告)日 2007-02-21
申请人 比奥希普有限公司; 发明人 科林·J·亨特; 塔姆辛·L·威廉斯;
摘要 用于硫化 矿石 和精矿石的细菌 氧 化的细菌培养物,该细菌培养物是由AGAL保藏登记号NM99/07541所标识的或由之适应而来的,并还同时含有硫化杆菌属和热原体属的一种或多种菌株。本 发明 进一步提供硫化矿石和精矿石的细菌氧化工艺,其特征在于用这样的细菌培养物 浸出 该矿石或精矿石。
权利要求

1.用于硫化矿石或精矿石的细菌化的细菌培养物,该细菌培养物是 由AGAL保藏登记号NM99/07541所标识的或已经由之适应而来的,该细 菌培养物还同时含有硫化杆菌属和热原体属的一种或多种菌株。
2.硫化矿石和精矿石的细菌氧化工艺,其特征在于用由AGAL保藏登 记号NM99/07541所标识的细菌培养物或由之而适应而来的细菌培养物浸 出该矿石或精矿石,该细菌培养物还同时含有硫化杆菌属和热原体属的一 种或多种菌株。
3.根据权利要求2的工艺,其特征在于所述硫化矿石或精矿石含有黄 矿。
4.根据权利要求2或3的工艺,其特征在于浸出进行的形式选自由下 列组成的组:
堆浸
槽浸出,
桶式浸出,和
废石堆浸出。
5.根据权利要求2到4的任一项的工艺,其特征在于该细菌培养物对 于要被氧化的矿石或精矿石是非土著的。
6.根据权利要求2到5的任一项的工艺,其特征在于被提供的矿石或 精矿石具有等于或大于P8575μm的研磨粉碎粒度。
7.根据权利要求2到5的任一项的工艺,其特征在于被提供的矿石或 精矿石具有等于或大于P8090μm的研磨或粉碎粒度。
8.根据前述权利要求的任一项的细菌培养物,其特征在于该培养物在 45℃到90℃的温度范围内可以在硫化矿石和精矿石的氧化中工作。
9.根据权利要求1到7的任一项的细菌培养物,其特征在于该培养物 在45℃到65℃的温度范围内可以在硫化矿石和精矿石的氧化中工作。

说明书全文

发明领域

本发明涉及使用细菌培养物的改进的硫化矿石(sulphide ores)和精矿石 (concentrates)的细菌化。

本发明的细菌氧化工艺具体应用于含有矿的矿石和精矿石的细菌 氧化。

背景技术

细菌氧化多年来被成功地用于砷黄矿(arsenopyrite)、黄铁矿(pyrite)、 磁黄铁矿(pyrrhotite)、铜蓝(covellite)和辉铜矿(chalcocite)矿石和精矿石的加 工,但这种加工并不包括黄铜矿(CuFeS2)矿石和精矿石的氧化。
现有技术中的细菌混合物被用于帮助除了黄铜矿矿石和精矿石以外的 硫化矿石和精矿石的氧化,这些细菌混合物使用多种细菌组合。例如,南 非Gencor Limited使用的混合细菌培养物主要包含氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillus ferrooxidans)、氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)和 铁氧化钩端螺菌(Leptospirillum ferrooxidans)。Gencor培养物由嗜中温细 菌的混合菌群组成,这些细菌在35℃到45℃的温度范围内工作(Dew和 Miller,1997)。
而且,Gencor Limited的芬兰专利申请953488公开了使用氧化亚铁硫杆 菌、氧化硫硫杆菌和铁氧化钩端螺菌在优选的pH 3下对优选地破碎到6mm 以下的矿石实现了氧化。
BacTech(澳大利亚)Pty Ltd所使用的细菌培养物,参见例如美国专利 5429659,是一种中等嗜热的细菌培养物,其在46℃到50℃的温度范围内 工作。该培养物已被Barrett等命名为“M4”(1998)并被Nobar等(1988) 所描述(Brierley和Brans 1994)。
由位于南非Randburg的Mintek-Anglo American Corporation所开发的 MINBAC工艺利用了一种嗜中温细菌混合培养物,该培养物包括氧化亚铁 硫杆菌/铁氧化钩端螺菌(Brierley和Brans 1994)。
目前使用的细菌培养物,如果不将矿石或精矿石超细粉碎(P80<20μm) 以帮助细菌氧化,或者使用很长的浸出时间(leach times)来实现氧化的话, 就不能产生商业上可接受的效果。超过100天的浸出时间都并不罕见。
目前的趋势倾向于使用更高的温度来促进铁氧化。但是,所用的高温使 得在氧化以后需要冷却,而且需要提供特定材料例如外科手术级的不锈 制作的反应器。这两种情形都会增加操作的成本。
在用于从更易于氧化的次级铜材料例如铜蓝和辉铜矿中回收铜的细菌 工艺中,堆浸(heap leach)最为常用。该工艺包括将粉碎的矿石堆放在特 制的非透性的垫层(pad)上,该垫层的设计使得从堆上排下的母液聚集于 一点,再从此点排入收集池中。通过沉淀、溶剂萃取和/或电解提取来从母 液(pregnant liquor)里回收金属。
为了成功地进行堆浸出,保持堆的完整是关键的。决定堆的稳定性的主 要因素是矿石的粉碎粒度(crush size)。矿石的粉碎必须达到这样的程度, 即矿石足够细,使得浸出剂可以很好地渗透穿过堆而不发生过多的沟流 (channeling),而同时保持空隙空间,空隙空间对于良好的空气扩散和浸 出剂排出是关键的。如果矿石粉碎得过细,穿过堆渗透就会非常慢。空隙 空间将会不足,并且会发生堆排不足,造成堆上形成水池(pooling)及 高地下水头(phreatic head)。另一方面,如果矿石的粒度太粗,则堆排水 的速度快,溶液中金属的水平低,而且由于矿石经过生物和化学过程被破 坏,堆结构会毁坏。在很多情况下,堆积之前用粘合剂硫酸和水将粉碎 的矿石聚团,使得堆中的粒度和酸分布更均匀。
在堆积前通常将排水层置于垫层上,排水层一般由非反应性岩石例如 石英岩构成,保证母液充分地排出。用酸化的细菌液浇灌堆,酸化的细菌 液充当浸出剂将铜从矿石中浸出。堆浸中使用的细菌一般是好氧的,因此 需要氧气。氧气可以通过低压送机压入堆中,或者,由于当细菌氧化矿 石并产热时所发生的烟囱效应(chimney effect),空气可以被吸入堆中。
Geocoat方法(参见WO 96/38381)是堆浸的一种变化形式,并且已被 美国Geobiotics公司市场化。该方法包括从硫化矿石产生精矿石,使其覆盖 在粉碎的、大小一定的岩石上形成可以进行细菌氧化的堆。重要的是,该 方法的发明看来是一项旨在保证堆中充分的空气和流体流动及散热的努
废石堆浸出(damp leach)和堆浸非常相似,一般仅用于品位较低的矿 石。废石堆浸出经常被看作堆浸的伴随过程,而其本身并不足以作为一个 独立的工程。关键的是,当不得不开采并堆积废矿石或者低品位矿石,而 事先几乎没有作地面准备时,可以从这些物料里提取一些价值物(value)。堆 中存在有土著细菌(indigenous bacteria),需要的仅仅是提高它们的活性。这 可以通过在浇灌溶液中加入酸和营养物来实现,就像堆浸那样。区别在于 成本。
在堆积以前很少或不进行破碎。只需要进行最少的垫层制备,而且也没 有强迫通气。
从成本、复杂程度和效率上看,桶式浸出(vat leach)可以看作堆浸和 槽式浸出(tank leach)的中间形式。在桶式浸出过程中,要处理的材料被 完全浸没在浸出溶液中,但不被搅动,至少不被明显地搅动,尽管因为空 气和/或溶液的流动可能会发生一些搅动。该方法优于堆浸或废石堆浸出之 处在于可以实现矿物的完全润湿而避免沟流。较细的粉碎粒度在桶中也可 以得到更好地处理,虽然由于空气和溶液的透过性的需要细度还是有限度 的。超过该限度时,就需要将材料悬浮在溶液中。如果桶仅作单次使用, 可以把它们建成有衬砌的坝(lined dams),向一个倾斜以允许浸出液的 循环和回收。作多次使用的桶则需要更坚固的构建,例如混凝土或者砖。 通气可以借助潜(submerged)管实现,或者也可以通过间歇性地将桶放水, 使空气被后退的浸出液吸到矿石中。
槽式浸出,顾名思义,包括在搅动的槽中对通气的矿浆进行细菌浸出。 设想该技术可能和贱金属的生物浸出是非常相似的,但是迄今为止用于铜 的商业化的系统还没有建立。
可得的数据显示,对精矿石超细磨粉(ultra-fine milling)(P80<30μm) 所涉及的费用可以预见会使资金和运行成本过高。
本发明的目的之一是克服现有技术相关的上述问题,或者至少为现有技 术提供一个有用的替代方案。
前面背景技术的讨论仅仅是为了帮助理解本发明。应当理解上述讨论并 不意味着认可或者承认任何被提及的材料构成了本发明优先权日之前一般 公共知识的一部分。
在整个说明书中,除非上下文另有要求,词语“构成”(comprise), 或变化形式例如“构成”(comprises)或“构成”(comprising),应当理 解为包含所述的整体或整体的组,但并不排除其他任何整体或整体的组。
在整个说明书中,提及某种细菌时,应当理解为还包括其亚种。
在整个说明书中,矿石被理解为这样的材料:其已自地面分离,并且没 有接受任何处理以提高金属浓度。精矿石是这样产生的:通过使矿石经历 处理过程,通常为重力或者浮选,以提高所需金属的浓度并且降低物料的 体积。接下来经过处理该物料以回收所需金属。
本发明的公开
根据本发明,提供了用于硫化矿石和精矿石的细菌氧化的细菌培养物, 该细菌培养物是由AGAL保藏登记号NM99/07541所标识的或已经由之适 应而来的,该细菌培养物还同时含有硫化杆菌属(Sulfobacillus)和热原体 属(Thermoplasma)的一种或多种菌株。
根据本发明,还提供了一种硫化矿石和精矿石的细菌氧化工艺,其特征 在于用由AGAL保藏登记号NM99/07541所标识的细菌培养物或由之而适 应而来的细菌培养物浸出该矿石或精矿石,该细菌培养物还同时含有硫化 杆菌属和热原体属的一种或多种菌株。
在本发明的一种形式中,所述硫化矿石或者精矿石含有黄铜矿 (chalcopyrite)。
本发明的方法中所用的浸出(leach)可以以选自由下列组成的组的形式 进行:
堆浸(heap leach),
槽式浸出(tank leach),
桶式(vat)浸出,和
废石堆(dump)浸出。
优选地,所述细菌培养物对要氧化的矿石或精矿石是非土著的 (indigenous)。
当被提供的矿石或精矿石具有等于或大于P8090μm的研磨或粉碎粒度 时,本发明的细菌培养物和方法在硫化矿石和精矿石中的氧化是有效的。 优选地,被提供的矿石或精矿石具有等于或大于P8075μm的研磨或粉碎粒 度。
在本发明的一个形式中,该培养物在45℃到90℃的温度范围内可以在 硫化矿石和精矿石的氧化中工作。优选地,该培养物在45℃到65℃的温度 范围内可以在硫化矿石和精矿石的氧化中工作。
附图简介
下面将参照所附图来描述本发明,参照附图仅作举例之用。其中:
图1是由三种不同方法处理的6个本发明的细菌培养物的样品的变性梯 度凝胶的图示。
发明描述
为了培养能够处理黄铜矿石和精矿石的培养物,寻找了一种黄铜矿物的 土著细菌培养物。土著的细菌培养物通常优于修饰的分离培养物,因为土 著的培养物已经适应了特定矿石相关的毒素和矿物组分,从而产生更有效、 复原能力更好的细菌菌株。
培养黄铜矿石的土著细菌培养物并检测其氧化其土生矿石/精矿石和其 他黄铜矿石和精矿石的能力。在这个工作程序中,从来自加拿大New Brunswick所产贱金属矿石中所得的黄铜矿(CuFeS2)精矿石中培养了一个 细菌储用培养物。分离该细菌培养物之后,对它的土生矿石和精矿石以及 多种其他矿石和精矿石进行了试验。在试验不同的矿物的培养物时,任何 土生细菌,如果它在试验条件下可以工作,可以与引入的培养物竞争性地 工作,而且在该环境下不但能够生存而且旺盛地生长,即被加入到原先的 储用培养物中。这样,随着时间的推移,受试的矿石或精矿石中的任何土 生细菌都被并入到该培养物中。另外,该储用培养物已经在40到90℃范围 内的不同温度下和pH 0.8-2.2范围内的不同的酸度下进行了成功的培养。申 请人相信0.5到3.0的pH界限不是不合理的。储用培养物已成功地试用于 通气搅动搅拌槽式反应器中和在通气柱中帮助柱浸出。已在多种温度下及 多种矿石和精矿石中成功地试用了储用培养物。
本发明的细菌培养物由多种铁、硫化物和硫氧化细菌组成,这些细菌能 够在35℃到90℃之间的温度和0.5到3.0之间的pH范围内工作,尽管最优 的pH是0.8到2.5之间。混合的细菌培养物被认为同时包括了硫化杆菌属 和热原体属(Thermoplasma)的一个或多个代表,还可能同时具有其他种类的 细菌。这些细菌可能包括但不限于,热氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)、Thiobacillus caldus和/或氧化亚铁硫杆菌。
本发明的混合细菌培养物已经根据布达佩斯条约需要保藏在澳大利亚 政府分析实验室(Australian Government Analytical Laboratories),保藏号 为NM99/07541。
在本发明的矿石和精矿石的细菌氧化过程中,上述储用细菌培养物一般 情况下和要被浸出的矿石或者精矿石的样品组合起来,作为一个适应过程。 该储用(stock)培养物对该矿石或精矿石是非土著的。然后可以将适应的培养 物接种到其所适应的矿石或精矿石堆上。作为选择,也可使用别的浸出方 式作为使适应的培养物与矿石或精矿石接触的手段,包括桶、槽或者废石 堆。
下面将通过一些参考性的实施例来描述本发明,上面描述的本发明的一 般性并不受限制。
实施例1
在对任何材料进行试验之前,首先使如上描述的储用培养物适应于目标 材料。手段是将2700ml改进的0K培养基(1.0g/L硫酸铵,0.5g/L正磷 酸二,0.16g/L七水硫酸镁,pH 1.6-1.8)加入预热到所需温度的搅动通 气搅拌槽式反应器。改进的0K培养基中加入了粉碎的(P80<45μm)试验 材料的150g的样品,如果需要,用浓硫酸将pH调低到1.6和1.8之间。向 该浆中加入300ml储用接种物浆样品。搅动反应器以1L/min/L浆的速率通 气。根据设计,储用接种物对试验材料的矿石而言是非土著的。继续适应 过程,直到溶液溶出的(reporting to solution)相关金属的水平达到100%或 者达到平稳。使用感应耦合等离子体(ICP)分析溶液样品中的金属水平, 其中用浓硫酸调节矿浆的pH使得其pH为1.6到1.8之间。除了溶液溶出的 金属水平外,进一步根据氧化还原电位(ORP)、铁浓度和溶氧浓度(DO) 来监测适应/试验过程。
一旦培养物适应于目标矿物,它就被用作进一步进行搅动通气搅拌槽式 反应器试验的接种物,或作为堆或柱试验的接种物。通过加入含有硫酸铵、 正磷酸钾和硫酸镁的酸性基础营养液将适应的细菌接种物进一步稀释。溶 液中上述营养物的浓度在实验室试验和商业运行之间,以及不同的商业运 行之间可能有变化。在所有的情况下,氧化过程都通过溶液溶出的金属的 水平、pH、ORP、铁浓度和DO含量来监测。
本发明的细菌培养物被试用于来自全世界不同地点的多个含黄铜矿样 品。下面的表1说明了使用本发明的细菌培养物的黄铜矿精矿石和矿石的 矿物学和来源。
表1   样品   矿物学   来源   A   黄铜矿铜精矿石。   美国   B   黄铜矿中含有低水平铜的钼精矿石。   加拿大   C   主要包含黄铜矿(35%)和方黄铜矿(cubanite)(17%)及   较少量的磁黄铁矿(pyrrhotite)(10%)及少量的镍黄铁   矿(3%)和闪锌矿(sphalerite)(3%)的精矿石。   加拿大   D   红砷镍矿(Copper Nickel concentrate)精矿石,其中铜以   黄铜矿(18.5-28.5%)和方黄铜矿(15.8-30.8%)存在。   镍以镍黄铁矿(17.7-10.4%)存在,有时为紫硫镍矿   (violarite)所取代。   美国   E   三种铜精矿石,包括黄铜矿、黄铁矿和少量斑铜矿。   加拿大   F   由辉铜矿(14%)、黄铜矿(10%)、斑铜矿(1%)和黄   铁矿(1%)组成的铜精矿石   南非   G   样品i和ii为矿石样品,样品iii为精矿石样品。硫化   矿物主要是镍黄铁矿(pentlandite)、黄铜矿和磁黄铁矿。   西澳大   利亚
一般试验步骤
对矿物样品的所有操作都是在搅动通气槽式反应器中进行的。每个试验 的固体密度是10%w/v,通过1L空气每分钟每升反应器中的浆的速率鼓泡 (sparging)通气。在试验取样之前补充了因对浆加热和通气造成的蒸发损失, 这是通过添加自来水实现的。所有的浆都是在一种起始pH为1.0的专有的 营养培养基中制备。取样包括分析溶液中的铁、铜和其他相关金属离子。 另外,氧化还原电位(ORP)、pH、铁离子和溶氧水平都被监测和记录。 利用铜释放来监测试验的进行,一旦其达到平稳状态或大约达到溶液溶出 的铜的100%,则认为试验完成。一旦完成,将矿浆压滤(pressure filtered), 分析最终的浸出液,滤饼(filter cake)用酸化的水洗涤后干燥。将干燥后的滤 饼称重并分析残余,以进行金属平衡。
表2总结并显示了原矿分析、粒度分析的结果以及氧化后的结果。
表2   样品   原矿(Head)分析   T℃   浸出   天数   浸出后结果   粒度分析   Fe%   Cu%   S总%   浸出的%Cu   A   P81<90μm   28.60   29.40   32.1   48   36   96.6   B   P85<90μm   2.85   1.95   37.6   48   20   96.9   C   P80<75μm   27.30   20.97   27.37   48   22   98.0   D   P80<75μm   26.30   12.80   25.1   48   27   95.0   Ei   P84<75μm   15.00   2.87   13.9   48   28   99.3   Eiii   P78<75μm   26.6   4.62   34.4   48   28   99.3   F   P80<43μm   6.79   28.5   10.2   60   14   95.3   Gi   P80<75μm   17.8   1.18   7.88   48   14   98.8   Gii   P80<75μm*   45.1   6.82   34.8   50   10   98.0   Giii   P80<75μm   18.2   0.1   3.11   50   8   97.3   H   P80<75μm*   23.8   19.7   36.7   48   15   99.2
*“接收到的”(as received)精矿石的标称粒度。
本发明的适应的细菌培养物的多个样品已经在一般30℃到65℃的温度 范围内培养,尽管发明者提到过在高达约90℃的温度下工作。来自每个培 养物的样品已经分离并准备好进行16S rRNA测序鉴定。RNA测序之前的 样品准备是使用3种不同方法进行的。使用的方法和16S rRNA测序所得结 果如下所示。
方法
测试了6个样品(分别命名为SN45、SM45、PO45、SS 45、RH 14K和 014A)。
在手摇振荡器(hand shaker)上以最大速度将样品混合30分钟,然后作如 下处理:
A.振荡.取振荡过的样品500μl,立即通过14Krpm离心4分钟使其沉 降到1.5ml小管中的玻璃纤维滤膜上,小心地去掉上清,将沉降的材料在1 ml组织培养级的水中洗涤两次。
B.快速制备.迅速移出500μl,并用Savant BIO 101Fast Prep Machine (Biocan Scientific)以速度4匀浆20秒。如上所述将匀浆沉降并洗涤。
C.上清.振荡以后,让样品静置5分钟使颗粒物质沉降到管底。取500 μl上清如前述沉降并洗涤。
用InstaGene Matrix(BioRad Hercules,CA)按照生产商的指导从所有样 品中提取RNA。用紫外分光光度法(A260)测定RNA的浓度,然后将50ng 加入PCR反应混合物中,其终浓度为2mM镁离子,100μM dNTP,每种 引物各0.32μM,及0.625单位Taq Gold聚合酶。通用引物p515f和 p806r(Relman 1993)被用来扩增16S核糖体RNA基因的约300bp的片段。 正向引物被用40bp的富含GC的序列所修饰,该序列在变性梯度凝胶中的 不同脲/甲酰胺浓度上终止扩增产物的迁移(Sheffield等.1989;Muyzer 等.1993)。从变性凝胶上切下目标条带,并对纯化的扩增产物进行循环测 序,循环测序使用推荐的条件(PE Applied Biosystems)从反向引物起用Big Dye Terminator延伸。在310 Genetic Analyser(PE Applied Biosystems)上进 行序列测定。用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST;Altschul等,1990)。
结果
对于同一样品,三种样品处理方法的任一种都产生一种不同的特征图, 如图1所示。选取9个显著的条带用于测序。被测序的300bp片段与BLAST 结果栏中所列的细菌种类的16S rRNA基因的部分序列具有最近的匹配。为 了更精确地鉴定,可能还需要测定更大的16S rRNA片段。
表3显示了被测序的300bp 16S rRNA基因片段的BLAST搜索结果的 总结。括号中的数字表示未知序列和它们的最近的匹配之间的%同源性。
表3   条带   测序来源   迁移率相同的条带   BLAST结果   1   SM45-快速制备   SN45-振荡,C1(1998)-振荡   C/C(1998)-振荡   热氧化硫化杆菌   (98%)   2   C1(1998)-振荡   SM45-快速制备SN45-振   荡C/C(1998)-振荡   热氧化硫化杆菌   (98%)   8   RH14K(60℃)-上清   PO45-快速制备/振荡/上清   SS45-上清   未知细菌(97%)   脱氮Fe氧   化细菌(97%)   9   014A(50℃)-上清   SN45-快速制备/振荡/上清   SM45-快速制备   氧化亚铁硫杆菌   (96%)   014A振荡
设想可以从上面所列混合培养物中省去或替换掉某些细菌种类以便于 其在不同的温度下工作。
例如,在较低温度下可以用一种硫氧化细菌——氧化硫硫杆菌来取代 Thiobacillus caldus。
发明人认为对本发明的细菌培养物的特性鉴定所得的初步结果中至少 有一些是异常的。如下面实施例2所示,对本发明的细菌培养物进行了进 一步的特性鉴定工作。由于搜索引擎的改进和数据库的更新,这样的特性 鉴定工作的精确性会随着时间的推移而提高。
实施例2
方法
对本发明的细菌培养物的样品进行变性梯度凝胶电泳(“DGGE”)。这 种方法首先由Muyzer等描述(1993),它特别适用于对复杂的菌群进行特 征描绘。
将6个10mL等份的细菌培养物在~13,000g离心15分钟。使用前述 的方法(Plumb等.,2001)的改进形式,从离心沉淀中提取总样品DNA。 将样品沉淀重悬于pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水中以引发细胞裂解。通过用裂 解酶、溶菌酶和蛋白酶K以及强去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulphate)(SDS)处理细胞来进一步地裂解细胞。用酚-氯仿-异戊醇抽提 样品两次后,用异丙醇和乙酸钠将溶液中的DNA沉淀。提取的DNA进一 步用UltraCleanTM PCR Clean-up Kit(MO BIO Laboratories Inc.)纯化。在 1%w/v琼脂糖凝胶上电泳以后,用溴化乙锭染色使DNA样品可见。
从每个DNA样品中,用聚合酶链式反应(PCR)扩增全长的16S rRNA 基因。对细菌和古细菌(Archaea)特异的PCR引物与HotStarTaq聚合酶 (Qiagen)共同使用,如前人所述(Plumb等.,2002)。PCR产物用 UltraCleanTM PCR Clean-up Kit纯化,然后作为DGGE PCR反应的引物。 DGGE PCR使用前人所述的引物组(Muyzer等.,1993,vres等.,1997) 进行。还使用来自三种参考菌株:铁氧化钩端螺菌、热氧化硫化杆菌和硫 化叶菌属(Sulfolobus)的某个种的JP2株的DNA产生用于DGGE分析的 PCR片段以提供比较。DGGE使用DcodeTM通用突变检测系统(BioRad Laboratories,USA),6%w/v聚丙烯酰胺凝胶,变性梯度为30%到70% (100%的变性剂含有7M脲和40%v/v甲酰胺)。电泳在60℃、100V下 进行16h。凝胶在含有0.5mg L-1溴化乙锭的1×TAE缓冲液中染色,并使 用MultiImageTM光箱式透射器TM-26(Alpha innotech Corporation,美国) 和Chemilmage软件记录。将挑选的条带从凝胶上切下,并用DGGE引物再 次进行PCR扩增。纯化的PCR产物用自动循环测序进行序列测定,如前人 所述(Plumb等.,2002)。测序结果用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST;Altschul等,1990)分析,将序列与非 冗余核酸序列数据库中的序列数据比较,该数据库可通过 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/访问
结果
用相差显微镜观察样品发现少数小的棒状细胞。从6个10mL样品中的 每一个都成功地提取出了DNA。在DNA纯化步骤将6个样品汇集起来, 结果得到3个纯化的DNA样品。
从纯化的基因组DNA中,使用细菌特异性和古细菌特异性的引物扩增 出全长的16S rDNA。这个结果显示同时存在细菌和古细菌。将这些PCR产 物纯化,并其用作模板通过PCR扩增出用于DGGE分析的DNA片段。使 用细菌特异性和古细菌特异性的引物进行PCR,成功地扩增出了用于DGGE 分析的DNA片段。
然后用DGGE分析PCR片段,以根据DNA片段在含有渐增的变性剂浓 度的凝胶基质上的电泳迁移率来将它们分开。来自参考菌株的PCR样品显 示如预料的条带特征图。用细菌特异性的引物分析所产生的接种物样品片 段时,得到了两个暗淡但是特征性的条带。用细菌特异性的引物分析所产 生的样品片段时,在凝胶上只产生了一个特征性的条带。特征图上其他的 部分是非特征性的、外观模糊的区域。
对来自目标条带的PCR产物测序并用BLAST分析以确定这些DNA序 列的身份。表4总结了序列数据的BLAST分析的结果。条带A含有与来自 硫化杆菌属的DNA高度类似(99%)的DNA。条带B和C含有与来自热 原体属的未知菌株的DNA高度类似(98-99%)的DNA。热原体属包括古 细菌界的某些生物,其特征是:由于没有细胞壁而导致的细胞形态的多形 性,以及能够在由嗜中温到嗜热的温度范围内生长的能力。这个属的代表 是能够在有氧和无氧的条件下进行异养生长的嗜酸菌。
表4
从样品的DGGE图谱上切下的DNA条带的序列数据的BLAST分析。   条带编号   样品信息(引物)   最近的匹配(%同源性)   A   接种物(细菌)   硫化杆菌属菌种G2(99%)   B   接种物(细菌)   热原体属菌种克隆ASL1   (99%)   C   接种物(古细菌)   热原体属菌种克隆ASL1   (98%)
出乎意料的是,在前述条件下具有氧化硫化矿石和精矿石能力的细菌培 养物中同时具有硫化杆菌属和热原体属的代表,还有可能加入实施例1所 鉴定的一种或多种细菌。
根据设想,可以用本发明的混合细菌培养物来处理的材料包括贱金属矿 石和精矿石(铜、镍、钴锌等),贵金属矿石和精矿石(金和)和铂系 金属(PGM)矿石和精矿石。进一步设想,该培养物可以用于堆浸、槽式 浸出、桶式浸出或废石堆浸出氧化。
本发明的细菌培养物和方法可以在宽的温度范围内工作,这样就可以节 省冷却细菌氧化系统的相关成本。该方法还可以氧化所有形式的黄铜矿, 并且所用的粉碎粒度不会招致较大的资金和运行成本。
修改和变化,例如对本领域的技术人员而言显而易见的修改和变化,被 认为落入本发明的范围。
参考文献
Altschul,S.F.,W.Gish,W.Miller,E.W.Myers,和D.J.Lipman.1990.Basic local alignment search tool.J.Mol.Bio.215:403-410.
Brierley C.L.和R Brans,1994-Selection of BacTech’s Thermophilic Bio-Oxidation Process for Youanmi Mine,In Biomine 94,Conference Proceeding Perth Western Australia.Section 5.
Barrett,J.,Hughes,M.N.,Ewart,D.K.和Poole,R.K.,1988-The isolation and characterisation of a moderately thermophilic mixed culture of autotrophic bacteria:application of the oxidation of refractory gold concentrates.Perth Gold 88,Randol International Ltd,Golden,Colorado,pp 148 150.
Dew,D.M.and D.M.Miler,1997-The BioNIC Process;Bioleaching of Mineral Sulphide Concentrates For Recovery of Nickel,In IBS Biomine’97,Conference Proceedings,Sydney,p M7.1.0-M7.1.9.
Muyzer,G.E.C.DeWall,和A.G.Uitterlinden,1993.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amlified genes coding for the 16s rRNA.Appl. Environ.Microbiol.59:695-700.
Nobar,A.M.,Ewart,D.K.,Alsaffar,L.,Barrett,J.,Hughes M.N.和Poole,R.K., 1988-Isolation and characterisation of a mixed microbial community from an Australian mine:application to the leaching of gold from refractory ores, Biohydrometallurgy(P.R.Norris和D.P.Kelly编),Science and Technology Letters,Kew Surrey,UK,pp 530-531.
vres,L.,Forney,L.,Daae,F.l.和Torsvik,V.1997.Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Slenvannet,as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA.Applied and Environmental Microbiology,63,3367-3373.
Plumb,J.J.,Bell,J.和Stuckey,D.C.2001.Microbial populations associated with treatment of an industrial dye effluent in an anaerobic baffled reactor.Applied and Environmental Microbiology,67,3226-3235.
Plumb,J.J,Gibbs,B.,Stoll,M.B.,Robertson,W.J.,Gibson,J.A.E.,Nichols,P.D., Watling,H.R.和Franzmann,P.D.2002.Enrichment and characterisation of thermophilic aidophiles for the bioleaching of mineral sulphides.Minerals Engineering,15,787-794.
Relman,D.A.1993.Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing, p489-495.在D.H.Persing,T.F.Smith,F.C.Tenover,和J.White(编)Diagnostic Molecular Biology Principles and Applications-1993.American Society for Microbiology,Washington,DC中.
Sheffield,V.C.,D.R.Cox,L.S.Lerman,和R.M.Muyers.1989.Attachment of a 40base pair G+C rich sequence(GC-clamp)to genomic RNA fragments by polymerase chain reaction results in improved detection of single base changes. Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:232-236.
QQ群二维码
意见反馈