来自丝状真菌的β葡聚糖

本发明涉及生产β葡聚糖的方法；利用非病原腐生丝状真菌或包含它 的组合物提供β-葡聚糖，且由此改善食物结构，构造，稳定性或其组合； 利用非病原腐生丝状真菌产生β-葡聚糖并由此提供营养；将一种真菌或含 所述真菌的组合物用于制造用以预防或治疗免疫疾病、肿瘤或细菌感染的 药物或营养组合物。

在本发明说明书的上下文中，词语“包含”是指“包含……同时也包 含其他物质”。并非是指“仅由……组成”。

在最近十年中人们对来自微生物的生物聚合物产生了极大的兴趣，目 的在于替换营养组合物中传统的来自植物和动物的胶。新的生物聚合物可 以带来新的、具有所需特性的、更容易生产和纯化的材料的发展。因此， 已在生化和遗传水平对外多糖(EPS)的产物鉴定进行了研究。EPS的优势 在于其能够在发酵过程中由食品微生物分泌，但使用微生物产生的EPS 带来了产量过低(50-500mg/l)的问题，并且一旦EPS被提取出来即破坏了 其构造。

EPS的一个实例是β-葡聚糖。β-葡聚糖由1-3或1-6键连接的β-葡 萄糖组成，其下述特性使其在食品工业中倍受关注：粘性，乳浊性，稳定 性，低温防护性和免疫刺激活性。

引人注目地是已发现真菌可以产生大量(20g/l)的生物多聚体，如β- 葡聚糖。一个例子是硬化葡聚糖，一种由某种丝状真菌(例如核盘菌，伏 革菌和座盘菌)产生的多糖，根据其物理特性已在炼油中用作润滑剂和压 力补偿材料(Wang，Y.，和B.Mc Neil.1996.Scleroglucan.Critical Reviews in Biotechnology 16：185-215)。

硬化葡聚糖是由β(1-3)连接的葡萄糖骨架和不同程度的β(1-6)葡萄糖 侧链基团组成。这些侧链基团的存在提高了溶解性并阻止三股螺旋的形 成，而形成三股螺旋可能导致其形成凝胶能力降低。硬化葡聚糖溶液的粘 性表明其对pH(pH1-11)，温度(在10-90℃范围为常数)和电解质变化 (例如5％NaCl，5％CaCl2)的高度耐性。而且，有提议将其在食品工业中 用作增稠，悬浮，包衣，胶化的试剂，也有其强烈免疫刺激性，抗肿瘤和 抗微生物活性的报道(Kulicke，W.-M.，A.1.Lettau，和H.Thielking.1997， Correlation between immunological activity，molar mass，和molecular structure of different(1→3)-β-D-glucans.Carbohydr.Res.297：135-143)。

引人注目的是，目前已鉴定并分离出了一类能产生在食品工业中引人 注目的真菌外多糖的丝状真菌。EPS的两个引人注意的方面是(a)其良好 的构造和(b)在体外和体内的免疫分析中促进免疫刺激作用的能力。所 述的真菌EPS可以掺入健康食品中(例如EPS作为低卡路里产品或新的免 疫刺激产品的构造脂肪替代品)或单独作为食品添加剂。

令人惊讶的是，已发现这些真菌能够产生很高得率的β-葡聚糖。

因此本发明的第一方面是提供生产β-葡聚糖的方法，其包括发酵含非 病原腐生丝状真菌的悬浮液，从悬浮液中提取β-葡聚糖。

本发明的第二方面提供非病原腐生丝状真菌或包含它的组合物在提 供β-葡聚糖并由此改善食品结构，构造，稳定性或其组合中的用途。

本发明的第三方面是提供非病原腐生丝状真菌或包含它的组合物在 提供β-葡聚糖的来源并由此提供营养物质中的用途。

本发明的第四方面是提供非病原腐生丝状真菌或包含它的组合物制 造用以预防或治疗免疫疾病、肿瘤或细菌感染的药物或营养组合物中的用 途。

优选地，生产β-葡聚糖的方法的实施方案包括发酵选自下组的非病原 腐生丝状真菌：鲜红青霉(Penicillium chermesinum)，赭色青霉(Penicillium ochrochloron)，丝核菌(Rhizoctonia sp.)，茎点霉(Phoma sp.)，或其组合。 更优选将这些真菌中的至少三种一起发酵，更优选将所有这些真菌一起发 酵。

优选的，生产β-葡聚糖的方法的实施方式包括至少约50小时的发酵 步骤，更优选约80小时到约120小时，再更优选约96小时。显然，目前 已发现如果按这一时间进行发酵，其有益之处在于可以获得高产率的β- 葡聚糖。

优选地，一种生产β-葡聚糖的方法的实施方案包括在含有选自下述组 中的成分的培养基中发酵悬浮液的步骤，所述的组由NaNO3，KH2PO4， MgSO4，KCl和酵母抽提物组成。更优选其至少包含上述成分中的三种。 最优选其包含所有的上述成分。已发现含有这些成分的培养基的有益之处 在于可以生产高得率的β-葡聚糖。

优选地，一种生产β-葡聚糖的方法的实施方案包括在基本培养基中培 养所述真菌的步骤。优选地，所述的培养基仅包含葡萄糖和盐，其有益之 处在于在损害产率的情况下能够分离到高纯度的多糖。这是由于酵母抽提 物包含不易与EPS相分离的多糖。最优选地，所述培养基含NaNO3(10 mM)，KH2PO4(1.5g/l)，MgSO4(0.5g/l)，KCl(0.5)，C4H12N2O6(10mM)葡 萄糖(60)调pH至4.7。

优选地，依照本发明的一方面有关真菌用途的实施方案包含利用下述 的真菌：鲜红青霉(Penicillium chermesinum)，赭色青霉(Penicillium ochrochloron)，丝核菌(Rhizoctonia sp.)，茎点霉(Phoma sp.)或其组合。

本发明下述的优选实施方案中描述并明显体现了本发明的其他特点 和有益之处。

在一个实施方案中，生产β-葡聚糖的方法包括发酵包含在下述培养基 中的真菌的悬浮液，所述的培养基为(g/l)NaNO3(3)，KH2PO4(1)，MgSO4(0. 5)，KCl(0.5)，酵母抽提物(1.0)，葡萄糖(30)调pH为4.7。上述发酵在 约28℃下进行约96小时并伴随18rpm的振荡。在一种可替代的实施方案 中，将开始可能不产生多糖的菌株培养168小时。

下面给出的实施例只是借以阐述本发明并不作为对本发明的限制。

实施例1： 真菌β-葡聚糖产物： 下述真菌分离物已经分离并分类： 实验室分离物 “意大利语”公开名称 CBS鉴定 P28 鲜红青霉(Penicillium chermesinum) 平滑青霉(Penicillium glabrum) (teleomorph*) P45 赭色青霉(Penicillium ochrochloron) Eupenicillium euglaucum (anamorph**) P82 丝核菌(Rhizoctonia sp.) Botryosphaeria rhodina (teleomorph)/肉桂枝枯病 (Lasiodiplodia theobromae)(anamorph) P98 茎点霉(Phoma sp.) N/A  VT13 茎点霉(Phoma sp.) N/A  VT14 茎点霉(Phoma sp.) N/A **anamorph＝无性形式，teleomorph＝有性形式 N/A＝未获得。

实施例2 标准多糖产物

所用的TB1(g/l)培养基如下：NaNO3(3)，KH2PO4(1)，MgSO4(0. 5)，KCl(0.5)，酵母抽提物(1.0)，葡萄糖(30)调pH至4.7。

发酵时间为28℃下96小时伴随180rpm的振荡。对于起初可能不产 生多糖的菌株培养时间延长到168小时。

多糖的产量结果如下： 真菌菌株                     生物量           多糖       pH    特定产量

                          (g/l)           (g/l)     (g/g) Slerotium glucanicum        9.06±2.06    11.20±0.71   3.79     1.24 NRRL3006 灰色葡萄孢                   2.64±0.10    5.90±0.57    4.35     2.23 (Botritis cinerea)P3 油菜核盘菌                   1.16+0.16     1.61±0.13    2.50     1.38 (Sclerotinia sclerotiorum)P4 大刀镰孢                     6.51±1.05    0.82±0.13    7.70     0.13 (Fusarium culmorum)P8 未鉴定的P9                   5.43±0.53    1.32±0.02    4.00     0.24 鲜红青霉                    4.08±1.17    0.68±0.11    3.30     0.17 (Penicillium chermesinum)P28 赭色青霉                    10.53±2.87   0.45±0.07    3.50     0.04 (Penicillium ochrochloron)P45 镰孢                         8.60±2.12    1.25±0 35    7.44     0.15 (Fusariiii sp.)P58 油菜核盘菌                   2.10±0.00    0.86±0.00    3.80     0.41 (Sclerotinia sclerotiorum)P62 油菜核盘菌                     4.08±0.54     1.33±0.04    3.30     0.33 (Sclerotinia sclerotiorum)P63 Botritisfabae                  19.70±0.00    0.50±0.00    4.94     0.03 (Botritisfabae)P65 大豆黑痣病菌                   12.52±0.40    1.55±0.07    8.60     0.12 (Rhizoctonia fragariae)P70 草莓黑斑病菌                   6.01±0.89     1.05±0.07    7.00     0.17 (Colletotrichum acutatum)P72 盘多毛孢.                      8.70±0.28     1.90±0.28    6.30     0.22 (Pestalotia sp.)P75 刺盘孢                         12.00±1.95    0.65±0 07    6.50     0.05 (Colletotrichum sp)P80 刺盘孢                         5.10±0.71     0.80±0.00    5.70     0.16 (Colletotrichum sp.)P81 丝核菌                         5.70±0.28     8.90±1.56    6.50     1.56 (Rhizoctonia sp.)P82 支顶孢.                        4.69±0.62     1.45±0.07    7.20     0.31 (Acrernonium sp.)P83 支顶孢.                        5.50±0.00     1.30±0.00    7.20     0.24 (Acrernonium sp.)P84 支顶孢.                        3.90±0.71     1.00±0.14    5.85     0.26 (Acrernonium sp.)P86 支顶孢.                        8.08±0.01     0.73±0.18    4.40     0.09 (Acrernonium sp.)P90 未鉴定的P91                    10.50±0.14    1.28±0.31    6.83     0.12 毛壳霉                         8.30±1.43     1.00±0.28    7.40     0.12 (Chaetomium sp.)P94 草茎点霉                       13.61±2.34    0.98±0.22    7.50     0.07 (Phoma herbarum)P97 茎点霉                         11.01±1.07    2.89±0.01    8.00     0.26 (Phoma sp.)P98 茎点霉                11.76±1.66   0.66±0.04    6.45      0.06 (Phoma sp.)P99

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是两次独立实验的平均值± 标准偏差。

实施例3 理想的多糖产量

研究了丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82，茎点霉(Phoma sp.)P98和鲜红 青霉(Penicillium chermesinum)P28的多糖产量。结果如下：在TB1上 培养的碳源的作用：

I.丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82的EPS产量 碳源**      生物量         多糖         pH    特定产量

         (g/l)          (g/l)               (g/g) 葡萄糖      3.74±0.80    18.55±0.57    5.48    4.96 果糖        4.20±0.58    21.10±0.89    5.60    5.02 半乳糖      4.21±0.19    16.67±1.20    6.52    3.96 木糖        3.45±0.53    15.94±2.42    6.07    4.63 山梨醇      5.19±0.80    4.70±0.21     6.16    0.91 甘油        5.25±0.60    1.54±0.42     6.15    0.29 蔗糖        4.03±0.59    14.07±0.64    5.61    3.49 麦芽糖      4.07±0.32    12.22±0.34    5.28    3.00 乳糖        4.63±0.47    8.78±0.59     6.34    1.90 淀粉        5.77±0.95    17.36±0.69    6.26    3.01

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是三次独立实验的平均值± 标准偏差。

**将碳源以30g/l加到培养基。

II.茎点霉(Phoma sp.)P98的EPS产量 碳源**       生物量         多糖        pH       特定产量

          (g/l)         (g/l)                  (g/g) 葡萄糖      11.99±0.64    1.97±1.22    7.31      0.16 果糖        11.11±0.76    1.22±0.45    7.35      0.11 半乳糖    10.35±0.78       4.12±0.03    7.44       0.40 木糖      11.47±1.40       2.57±0.27    7.35       0.22 山梨醇    11.17±0.69       7.54±1.10    7.10.      0.68 甘油      11.00±0.37       0.63±0.05    7.29       0.06 蔗糖      12.93±0.44       2.91±0.55    7.36       0.23 麦芽糖    12.50±0.18       2.65±0.98    6.92       0.21 乳糖      9.77±0.01        1.06±0.14    7.05       0.11 淀粉      13.51±1.65       2.28±0.11    7.43       0.17

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是三次独立实验的平均值 ±标准偏差。

**将碳源以30g/l加到培养基。

III.鲜红青霉(Penicillium chermesinum)P28*的EPS产量 碳源**         生物量         多糖        pH    特定产量(g/g)

             (g/l)        (g/l) 葡萄糖        11.69±0.04    0.59±0.13    3.51      0.05 果糖          12.91±1.20    0.46±0.06    3.64      0.04 半乳糖        8.64±2.09     0.00±0.00    5.23      0.00 木糖          10.68±0.06    0.41±0.13    3.57      0.04 山梨醇        8.58±1.67     109±0.01     5.07      0.13 甘油          13.06±1.05    0.18±0.04    3.57      0.01 蔗糖          13.11±0.80    0.59±0.11    3.44      0.05 麦芽糖        10.90±11.1    0.61±0.16    3.53      0.06 乳糖          9.38±0.34     0.00±0.00    4.69      0.00 淀粉          9.92±2.04     0.50±0.05    3.58      0.05

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是三次独立实验的平均值± 标准偏差。

**将碳源以30g/l加到培养基。

B葡萄糖培养浓度对TB1的作用：

I.丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82*的EPS产量 葡萄糖    生物量         多糖        pH    特定产量 (g/l)      (g/l)         (g/l)              (g/g) 30      3.74±0.80    18.55±0.57    5.85    4.96 40      7.29±0.42    21.40±0.89    6.03    2.94 50      8.30±0.74    30.20±1.47    5.67    3.64 60      8.17±1.34    35.26±1.64    6.13    4.32

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是三次独立实验的平均值± 标准偏差。

II.茎点霉(Phoma sp.)P98*的EPS产量 山梨醇       生物量       多糖          pH      特定产量 (g/l)         (g/l)       (g/l)                  (g/g) 30         8.60±0.88    5.78±0.61    7.22       0.67 40         12.08±0.71   8.76±0.40    7.12       0.73 50         13.22±1.43   10.70±0.48   7.13       0.81 60         16.47±0.21   13.11±0.33   7.56       0.80

令人惊奇的是，从这些结果中可以看出，如果增加碳源(对于丝核菌 (Rhizoctonia sp.)P82和茎点霉(Phoma sp.)P98分别为葡萄糖和山梨 醇)的浓度，则每种菌株的EPS产量显著增加(大约增加100％)，分别达到 35.2和13.1g/l的最高值。

C.氮源培养浓度对TB1的作用：

I.丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82*的EPS产量 氮源            生物量         多糖          pH      特定产量

            (g/l)          (g/l)                  (g/g) NaNO3         3.74±0.80    18.55±0.57    5.53      4.96 NH4NO3       4.05±0.29    13.07±1.87    2.58      3.23 尿素            5.54±0.35    21.20±0.14    5.43      3.82 (NH4)2HPO4  3.09±0.81    14.26±0.52    2.44      4.61 (NH4)2SO4   2.39±0.49    8.91±0.58     2.23      3.73

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是三次独立实验的平均值± 标准偏差。

II.茎点霉(Phoma sp.)P98.的EPS产量 氮源            生物量        多糖        pH    特定产量

            (g/l)        (g/l)               (g/g) NaNO3        11.46±0.85  3.24±0.63    7.22    0.28 NH4NO3      6.12±0.33   1.17±0.43    2.33    0.19 尿素           8.09±1.01   3.57±0.97    6.18    0.44 (NH4)2HPO4 6.53±0.44   0.00±0.00    2.43    0.00

*当EPS产量最大时给出的值。给出的数据是三次独立实验的平均值± 标准偏差。

除了硝酸钠以外，使用其它氮源如尿素、硝酸铵、磷酸铵和硫酸铵。 明显地，使用尿素时，丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82和茎点霉(Phoma sp.) P98的EPS产量达到相同的水平

实施例4

EPS产量和表征

将丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82、茎点霉(Phoma sp.)P98和鲜红青 霉(Penicillium chermesinum)P28产生的EPS纯化。多糖仅由糖构成，因 此表明意外高水平的纯度。薄层层析(TLC)和气相色谱(GC)分析表明 来自丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82和茎点霉(Phoma sp.)P98的EPS 仅由葡萄糖构成。作为对照，来自chermesinum P28的EPS由半乳糖和痕 量的葡萄糖构成。

通过凝胶渗透色谱法，使用100×1cm SepharoseCL4B凝胶(Sigma)柱估 计来处自丝核菌(Rhizoctonia sp.)和Phoma sp的EPS的分子量(MW)， 它们均大约为2.106Da。

在甲基化、全部水解、还原和酰化之后通过GCms和GC法测定来自 丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82和茎点霉(Phoma sp.)P98的EPS中的糖 苷键的位置。通过GCms分析鉴定主要产物为2，4-二-O-甲基-四乙酰化葡 萄糖醇、2，4，6-三-O-甲基-三乙酰化葡萄糖醇和2，3，4，6-四-O-甲基-二乙 酰化葡萄糖醇，表明这二种EPS的特征均在于β-1，3和β-1，6键连接的单 糖。对于来自茎点霉的EPS的情况，GC分析表现出三个定量比率的典型 葡聚糖峰和许多分枝；除了以上的反应产物之外，相同类型的分析表明来 自丝核菌的EPS产生清楚地表明为一种未完全甲基化的其它反应产物如 五-和esa-O-甲基-乙酰化化合物。

令人惊奇的是，NMR分析证明这两种多糖均是纯的，仅由葡萄糖构 成，并且它们的特征在于β-1，3和β-1，6键。

实施例5 EPS的免疫刺激作用

将来自丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82和茎点霉(Phoma sp.)P98的 EPS进行体外和体内实验。将得自S.glucanicum NRRL 3006的经纯化硬 化葡聚糖用作对照。通过声波振荡将纯化的EPS随机断裂为不同分子量 (1·106-1·104Da)的片断。声波振荡的样品的自由葡萄糖浓度没有增加，因 此表明没有分枝破裂。用高MW的EPS(HMW，天然EPS)、中等MW(MMW， 大约5·105Da)和低MW(LMW，大约5·104Da)完成实验。

通过测定对TNF-α产量、噬菌作用诱导、淋巴细胞增殖和IL2产量对 免疫刺激作用进行体外评价。

所有EPS刺激单核细胞产生TNF-α因子；它们的含量随多糖浓度的增 加而增加，并在使用中等和低MW时最大。

为了评价EPS对噬菌作用的效果，使用两种方法(吞噬试验 (Phagotest)和显微荧光吞噬试验)。结果很好地表明高浓度EPS改进噬 菌作用。

相反，当将EPS单独或与植物凝集素(PHA)一起加入时，没有观察到 对淋巴细胞增殖和IL-2产量的显著效果。此外，没有观察到细胞毒素作 用。

使用来自丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82的MMW(大约5·105Da)葡聚 糖进行体内研究以完成对EPS免疫刺激活性的评价。

将雌性小鼠经皮下(SC)接种三次和/或在1、8、28天后口服(ORF) MMW EPS(2mg/100g重量)和嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)(1 细胞/100g重量)。13和33天后取血。通过ELISA试验比较抗体产量， 来评价体内免疫刺激作用。

无论接种的葡聚糖的浓度如何，所有接受OR细菌的小鼠(3、4和5 组)的抗体浓度均没有增加。但是，SC接种了细菌的小鼠中观察到抗体产 量的差异。而且，仅SC接受细菌的小鼠的抗体水平明显高于(P＜0.01， Tukey试验)接受葡聚糖和细菌均经SC以及葡聚糖经OR和细菌经SC的 小鼠。

有趣的是，结果表明来自丝核菌的EPS引起抗体浓度的降低。从这个 结果可以明显看出，来自丝核菌的葡聚糖导致单核细胞抗菌活性的活化 (见上述关于TNF-α产量和吞噬作用诱导所述的效果)，从而降低细菌数， 进而导致抗体产量同时降低。

总之，三种丝状真菌丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82，茎点霉(Phoma sp.)P98和鲜红青霉(Penicillium chermesinum)P28具有良好潜在价值的细 胞外多糖的能力。具体而言，丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82有用之处在 于发酵时间短，EPS产量水平高及其在EPS生产阶段不存在葡聚糖酶活 性。而且，它的EPS和来自茎点霉(Phoma sp.)P98的EPS者是以β-1，3 和β-1，6键为特征的葡聚糖。此外，与由丝核菌(Rhizoctonia sp.)P82 产生的葡聚糖的免疫刺激作用相关的结果表现出良好刺激活性的可能 性。

应该理解，本文所述的优选的实施方案的各种改变和修正对本领域技 术人员来说是显而易见的。这些改变和修正可以在不背离本发明的构思和 范围，且不消除本发明附带的优点的情况下作出。因此，这些改变和修正 意欲被所附的权利要求覆盖。