[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及用于治疗牙痛的红茶菌代谢产物及其制备方法。

[0002] 红茶菌虽然在我国有悠久的历史，但对它的科学研究却起步较晚。我国著名微生物学家方心芳先生于1951年《黄海》杂志第12卷第5期刊登了《海宝是什么》一文，这是我国关于红茶菌的首篇科学论文。文中认为红茶菌的微生物种类主要是醋酸菌和酵母，同时指出红茶菌中的醋酸菌不只一种，但以膜醋菌为主。20世纪70年代末期到80年代初期，红茶菌饮料在我国非常流行，一些介绍红茶菌效果及制作方法的文章大量涌现。从20世纪初期到中期，一些医生和学者纷纷报道了红茶菌在治疗各种疾病中的效果和作用。从20世纪中期开始一直到现在，有关红茶菌的微生物组成及相互作用、发酵条件、菌液成分、作用机理等方面的研究陆续有文献报道。红茶菌菌种的类型及菌种间的相互关系用于发酵培养红茶菌的菌种主要是醋酸菌和酵母菌，有的红茶菌有少量乳酸菌[主要是保加利亚乳杆菌(Lactobacterium bulagricum)]。到目前为止，人们从各种红茶菌中分离到的醋酸菌有：木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、拟木醋杆菌(Acetobacterxylinoides)、葡萄糖酸杆菌(Bacterium gluconicum)、产酮醋杆菌(Acetobacter ketogenum)、弱氧化醋酸菌(Acetobacter suboxydans)、葡萄糖醋酸菌(Gluconobacter liquefaciens)、醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)和巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，其中最主要的是木醋杆菌。酵母菌有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、不显酵母(Saccharomyces inconspicus)、路德类酵母(Saccharomycodes  ludwigii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、热带假丝酵母(Candida tropicans)、克鲁斯假丝酵母(Candidacrusei)、汉逊德巴利酵母(debaryomyces hansenii)、酒香酵母(Brettanyomyces)、克勒克酵母(Kloeckera)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)等。发酵红茶菌的菌种是由上述的一种或多种醋酸菌和上述的一种或多种酵母菌组成，有的还有乳酸菌。不同的菌种组成，其菌液中代谢产物的种类和数量也会有所不同。酵母菌和醋酸菌在红茶菌中是互惠互利的共生关系。在发酵开始阶段，由于醋酸菌不能直接利用蔗糖或利用蔗糖的速度很慢，由酵母菌将蔗糖降解为葡萄糖和果糖并进一步发酵产生乙醇，醋酸菌则在培养液中有了葡萄糖、果糖和乙醇之后开始大量生长繁殖，将葡萄糖和果糖氧化产生葡萄糖酸、乙酸等代谢产物，并将酵母产生的乙醇氧化生成乙酸。有资料表明，酵母菌产生的乙醇能刺激醋酸菌的生长，产生更多的纤维素膜和乙酸，而醋酸菌产生的乙酸又会刺激酵母菌产生乙醇，而乙酸、乙醇的存在可保护醋酸菌和酵母菌，使它们免受其它微生物的侵染。

[0003] 一些学者对红茶菌菌液中所含成分进行了分析，由于所采用的菌种、培养条件、分析方法、分析的侧重点等方面都不尽相同，因此不同的资料其结果也不同。德国的Günther W.Frank(1991)认为红茶菌中含有葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、醋酸、酒精、乳酸、氨基酸、蛋白质、叶酸、地衣酸、Vc和多种B族维生素等[14]。C.-H.Liu等人(1995)对来自台湾的两种红茶菌用HPLC进行分析，显示该红茶菌中含有甘油、乙酸和乙醇。美国的Michael R.Roussin(1996)报道了用HPLC/MS/PDAD(高效液相色谱/质谱/光电扫描)方法对来自美国和世界其他地方的19个红茶菌试样进行了化学成分分析，结果没有找到以前几乎是公认的功能因子-葡萄糖醛酸，而且各种维生素的含量很少，不过检出了许多前人没有检出的物质。他们从这19种红茶菌中检出了40多种化学物质。而这些物质进入人体后如何起作用还需进一步的科学研究。

[0004] 红茶菌健身作用的机理是非常复杂的，到目前为止，还没有完全搞清楚，需要进一步深入研究。同时，还应加强它的应用研究，使之更充分地为人类的健康事业服务。

[0005] 目前，红茶菌的培养条件和菌种的要求都非常严格，也限制了红茶菌的大量培养及其应用的进一步开展，因此，提供一种光谱性的红茶菌的培养方法是非常有必要的；且目前还没有发现有红茶菌治疗牙疼的报道。

[0006] 本发明的目的是提供一种用于治疗牙痛的红茶菌代谢产物及其制备方法，该该培养方法选择了以无菌水、酒与蜂蜜以及红茶水按照特定的比例进行混合、发酵制得母菌液，接着将母菌液与糖水制得的培养液进行混合进行发酵一定时间后将培养结束后的所述培养液进行固液分离，取下层液体即为所述红茶菌代谢产物。该制备方法中母菌液的制备过程简单，原料简单易得，且红茶菌的培养条件易控制、培养的菌种污染率小。且用该制备方法制得的红茶菌代谢产物能够有效用于治疗牙痛，且作为治疗牙痛的药物副作用小，可以广泛使用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一种用于治疗牙痛的红茶菌代谢产物的制备方法，其中，所述培养方法由以下步骤组成：

[0008] 1)将水煮沸后加入糖，待糖溶化后制得糖水，接着将所述糖水冷却至20-35℃，即制得所述培养液；

[0009] 2)接种培养：先将培养器消毒、润洗，接着将所述母菌液和所述培养液按照1：20-50的体积比放入到所述培养器中，并用纱布封口，将所述培养器放置于光照强度为0.1万-
0.8万Lx的弱光环境、通风且温度为30-35℃的条件下发酵培养7-14天；

[0010] 3)将培养结束后的所述培养液进行固液分离，取下层液体即为所述红茶菌代谢产物。

[0011] 通过上述技术方案，本发明中选择了以无菌水、酒与蜂蜜以及红茶水按照特定的比例进行混合、发酵制得母菌液，接着将母菌液与糖水制得的培养液进行混合进行发酵一定时间后将培养结束后的所述培养液进行固液分离，取下层液体即为所述红茶菌代谢产物。该制备方法中母菌液的制备过程简单，原料简单易得，且红茶菌代谢产物的培养条件易控制、培养的菌种污染率小；该培养方法可以推广使用大量培养红茶菌代谢产物，且制得的红茶菌代谢产物对于治疗牙痛具有很好的治疗效果。

[0012] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

[0013] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0014] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0015] 本发明提供了一种用于治疗牙痛的红茶菌代谢产物的制备方法，其中，所述培养方法由以下步骤组成：

[0016] 1)将水煮沸后加入糖，待糖溶化后制得糖水，接着将所述糖水冷却至20-35℃，即制得所述培养液；

[0017] 2)接种培养：先将培养器消毒、润洗，接着将所述母菌液和所述培养液按照1：20-50的体积比放入到所述培养器中，并用纱布封口，将所述培养器放置于光照强度为0.1万-
0.8万Lx的弱光环境、通风且温度为30-35℃的条件下发酵培养7-14天；

[0018] 3)将培养结束后的所述培养液进行固液分离，取下层液体即为所述红茶菌代谢产物。

[0019] 上述技术方案中，所述母菌液可以选择醋酸菌、酵母菌的单独菌液或者多种组合的菌液进行发酵，但是为了提高培养的成功率，以及考虑降低成本，优选地，所述母菌液是由下述方法制得：将无菌水、酒与蜂蜜按照100：10-20：10-20的重量比进行混合制得混合液，将所述混合液置于15-30℃的敞口、阴暗条件下发酵10-15天，发酵结束后分离出所述混合液表面漂浮的一层薄膜即为母菌种；再将所述母菌种、红茶水、所述糖水按照1：40-50：30-40的重量比混合、于15-30℃的敞口、阴暗条件下培养3-5天即制得所述母菌液。

[0020] 在上述技术方案中，所述无菌水的温度可以控制在较宽的范围内，但是为了促进母菌种的发酵生长，优选地，所述无菌水的温度为40-60℃。

[0021] 另外，在上述技术方案中，所用的酒的种类及其酒精度均可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高菌种的培养效率以减少污染的概率，优选地，所述酒为白酒或米酒，且所述白酒或米酒的酒精度为30％-50％。

[0022] 在本发明中所用糖的种类可以在宽的范围内选择，为了促进红茶菌的发酵培养，优选地，所述糖选自单糖、二糖或多糖；所述单糖为葡萄糖，所述二糖为麦芽糖、蔗糖或乳糖，所述多糖为淀粉；更优选地，所述步骤1)中糖与水的重量比为1：20-30。

[0023] 在上述技术方案中，所述培养器的材质可以在宽的范围内选择，但是为减少材质对红茶菌培养过程中的污染，优选地，所述培养器的材质为玻璃瓶或陶瓷。所述润洗的过程可以是用无菌水多次冲洗，或者直接用培养液冲洗几次，但是为了提高润洗效果进而促进红茶菌的培养，优选地，所述润洗的过程为：用母菌液冲洗所述培养器2-3次。

[0024] 另外，为了在本发明步骤2)中，消毒的方法可以有多种选择，但是为了减少操作过程给培养器带来新的污染源进而污染菌种，优选地，在步骤2)中，所述消毒的过程是将培养器放置于沸水中煮10-30min。

[0025] 在发明中，所述的所述固液分离的过程可以是过滤、离心等，但是为了提高制备效率，且为了避免破坏菌种、污染代谢产物，优选地，所述固液分离的方法为：直接用过滤的方式将培养液的表面漂浮的红褐色絮状物或块状物分离出，或者直接用滤网兜或纱布将所述红褐色絮状物或块状物捞出后取下层液体即为所述红茶菌代谢产物。

[0026] 本发明还提供了一种如上述培养方法所制得的用于治疗牙痛的红茶菌代谢产物。

[0027] 本发明中所述红茶菌代谢产物的使用要点为：单次治疗时，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续治疗3-4周。

[0028] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0029] 制备例1

[0030] 将无菌水(40℃)、白酒(酒精度30体积％)与蜂蜜按照100：10：10的重量比进行混合制得混合液，将所述混合液置于15℃的敞口、阴暗条件下发酵15天，发酵结束后分离出所述混合液表面漂浮的一层薄膜即为母菌种；再将所述母菌种、红茶水、所述糖水按照1：40：30的重量比混合、于15℃的敞口、阴暗条件下培养3天即制得所述母菌液；记作W1。

[0031] 制备例2

[0032] 将无菌水(60℃)、米酒(酒精度50体积％)与蜂蜜按照100：20：20的重量比进行混合制得混合液，将所述混合液置于30℃的敞口、阴暗条件下发酵10天，发酵结束后分离出所述混合液表面漂浮的一层薄膜即为母菌种；再将所述母菌种、红茶水、所述糖水按照1：50：40的重量比混合、于30℃的敞口、阴暗条件下培养5天即制得所述母菌液；记作W2。

[0033] 制备例3

[0034] 按照制备例1的方法制得制得所述母菌液；记作W3，不同的是所用酒为酒精度为50体积％的白酒。

[0035] 制备例4

[0036] 按照制备例1的方法制得所述母菌液；记作W4，不同的是所用酒为市售的雪花啤酒。

[0037] 制备例5

[0038] 按照制备例1的方法制得所述母菌液；记作W5，不同的是所用酒为市售的长城葡萄酒。

[0039] 制备例6

[0040] 按照制备例1的方法制得所述母菌液；记作W5，不同的是所述无菌水的温度为10℃。

[0041] 实施例1

[0042] 1)制备培养液：将水煮沸后加入糖(糖与水重量比为1：20)，待糖溶化后制得糖水，接着将所述糖水冷却至35℃，即制得所述培养液；

[0043] 2)接种培养：先将陶瓷培养器放置于沸水中煮15min进行消毒、用母菌液(W1)进行润洗3次，接着将所述母菌液(W1)和所述培养液按照1：20的体积比放入到所述培养器中，并用纱布封口，将所述陶瓷培养器放置于光照强度为0.1万Lx的弱光环境、通风且温度为30℃的条件下发酵培养14天，最后用滤网兜捞出培养结束后的培养液的表面漂浮的红褐色絮状物或块状物，取下层液体即为制得的所述红茶菌代谢产物；记作A1。

[0044] 实施例2

[0045] 1)制备培养液：将水煮沸后加入糖(糖与水重量比为1：25)，待糖溶化后制得糖水，接着将所述糖水冷却至25℃，即制得所述培养液；

[0046] 2)接种培养：先将陶瓷培养器放置于沸水中煮30min进行消毒、用母菌液(W2)进行润洗3次，接着将所述母菌液(W2)和所述培养液按照1：35的体积比放入到所述培养器中，并用纱布封口，将所述陶瓷培养器放置于光照强度为0.5万Lx的弱光环境、通风且温度为35℃的条件下发酵培养10天，最后用滤网兜捞出培养结束后的培养液的表面漂浮的红褐色絮状物或块状物，取下层液体即为制得的所述红茶菌代谢产物；记作A2。

[0047] 实施例3

[0048] 1)制备培养液：将水煮沸后加入糖(糖与水重量比为1：30)，待糖溶化后制得糖水，接着将所述糖水冷却至25℃，即制得所述培养液；

[0049] 2)接种培养：先将玻璃培养器放置于沸水中煮25min进行消毒、用母菌液(W3)进行润洗3次，接着将所述母菌液(W3)和所述培养液按照1：50的体积比放入到所述培养器中，并用纱布封口，将所述玻璃培养器放置于光照强度为0.8万Lx的弱光环境、通风且温度为35℃的条件下发酵培养7天，最后用滤网兜捞出培养结束后的培养液的表面漂浮的红褐色絮状物或块状物，取下层液体即为制得的所述红茶菌代谢产物；记作A3。

[0050] 对比例1

[0051] 按照实施例1的方法制得所述红茶菌代谢产物，记作B1，不同的是所用母菌液为W4。

[0052] 对比例2

[0053] 按照实施例1的方法制得所述红茶菌代谢产物，记作B2，不同的是所用母菌液为W5。

[0054] 对比例3

[0055] 按照实施例1的方法制得所述红茶菌代谢产物，记作B3，不同的是所用母菌液为W6。

[0056] 对比例4

[0057] 按照实施例1的方法制得所述红茶菌代谢产物，记作B4，不同的是所用母菌液为纯醋酸菌液。

[0058] 对比例5

[0059] 按照实施例1的方法制得所述红茶菌代谢产物，记作B5，不同的是所用培养器为铝制得培养器。

[0060] 检测例1

[0061] 按照上述实施例1-3以及对比例1-5的方法各自独立重复100组培养实验，并统计A1-A3以及B1-B5的红茶菌代谢产物的被污染情况、计算其对应的培养成功率；当红茶菌颜色为灰色或灰绿色则证明红茶菌及其代谢产物被污染了，即视为培养不成功；具体结果见表1。

[0062] 表1

[0063]  A1 A2 A3 B1 B2 B3 B4 B5
成功率 98％ 96％ 97％ 80％ 82％ 80％ 76％ 79％

[0064] 通过上述实施例和对比例的检测结果来看，本发明提供的制备方法培养红茶菌的被污染率较小，且培养成功率高达97％左右；而在本发明提供的培养方法范围以外的培养条件都会明显降低了其培育的成功率。

[0065] 应用例1

[0066] 选择8位患有牙痛的患者分别服用A1-A3及B1-B5进行治疗，并记录治疗后患者的牙痛缓解情况，具体结果见表2：

[0067] 患者1：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物A1含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0068] 患者2：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物A2含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0069] 患者3：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物A3含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0070] 患者4：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物B1含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0071] 患者5：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物B2含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0072] 患者6：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物B3含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0073] 患者7：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物B4含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0074] 患者8：单次治疗，将5-8毫升所述红茶菌代谢产物B5含于牙痛部30-60秒，然后吐出或咽下，反复3-5次；每周治疗1-2次，连续3周。

[0075] 表2

[0076]  治疗一周 治疗两周 治疗三周
患者1 明显缓解 完全缓解 完全缓解
患者2 明显缓解 明显缓解 完全缓解
患者3 完全缓解 完全缓解 完全缓解
患者4 轻微缓解 轻微缓解 轻微缓解
患者5 未缓解 未缓解 轻微缓解
患者6 未缓解 未缓解 轻微缓解
患者7 未缓解 未缓解 未缓解
患者8 未缓解 未缓解 未缓解

[0077] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0078] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0079] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。