[0001] 本发明涉及生物与新医药技术，特别是涉及一种红霉素混种发酵方法。

[0002] 红霉素(erythromycin，Er)是一类大环内酯类抗生素，主要包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)和红霉素C(ErC)，其中以红霉素A的抗菌活力最强，B、C抗菌活力较低。现有技术中，红霉素的发酵生产通常都是采用红色链霉菌进行纯种发酵，通过种子培养、发酵过程控制等手段使菌体产生红霉素，该方法红霉素发酵单位低，发酵水平提高难度大，发酵工艺改变空间小。目前，我国已成为红霉素生产的第一大国，发酵水平的提高问题亟待解决，进一步提高其工业发酵水平、节能降耗是当前提高该产品的国际竞争力的迫切需求。

[0003] 本发明的目的在于提供一种有效改善红霉素发酵中红霉素A组分的含量，提高发酵水平的红霉素混菌发酵方法。

[0004] 为实现上述发明目的所采取的技术方案为：一种红霉素混种发酵方法，其特征是：在以红霉素链霉菌为发酵菌种生产红霉素的发酵过程中接入培养好的芽孢状态的巨大芽孢杆菌继续发酵。

[0005] 以红色链霉菌为菌种发酵至70～90hr后接入巨大芽孢杆菌。

[0006] 所述巨大芽孢杆菌接种量为0.05-0.1%。

[0007] 所述巨大芽孢杆菌菌液的制备：将巨大芽孢杆菌菌液接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床150～200转，温度29～33℃下培养8～15hr，镜检菌体成芽孢状即可，所述摇瓶培养基组成为：葡萄糖1.0～1.5%，玉米浆：0.8～1.2%，尿素0.1～0.4%，硫酸镁0.05～0.1%，碳酸钙0.05～0.1%，豆油适量。

[0008] 上述发酵过程的控制以现有公开的红霉素发酵生产工艺为基础进行工艺控制。

[0009] 本发明利用巨大芽孢杆菌与红色链霉菌混合发酵生产红霉素，巨大芽孢杆菌和红色链霉菌在发酵体系中混合培养，其代谢酶系和代谢中间体共用，对红霉素的合成有明显的促进作用，从而有效提高发酵水平，改善发酵液组分。通过本发明的方法，可使红霉素的发酵周期控制在160～170hr，发酵单位较原工艺提高10%以上，发酵液中红霉素A效价提高10%以上，对发酵液过滤无影响。

[0010] 下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

[0011] 下述实施例中摇瓶培养基组成为：葡萄糖1.0～1.5%，玉米浆：0.8～1.2%，尿素0.1～0.4%，硫酸镁0.05～0.1%，碳酸钙0.05～0.1%，豆油适量。

[0012] 下述实施例中发酵过程及发酵过程控制与目前现有的以红色链霉菌为发酵菌种生产红霉素的工艺控制一致。

[0013] 实施例11、巨大芽孢杆菌菌液的制备：
巨大芽孢杆菌培养基：葡萄糖1.2%，玉米浆：1.0%，尿素0.3%，硫酸镁0.1%，碳酸钙
0.08%，消沫剂适量。灭菌温度118～121℃，保温15～18分钟，降温待种。

[0014] 将保存的巨大芽孢杆菌菌液挑取一环接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床180转，温度30℃培养12hr，镜检菌体成芽孢状，放置4℃冰箱备用。

[0015] 2、将巨大芽孢杆菌菌液接入红霉素发酵液混种培养以红色链霉菌为发酵菌种，按照常规发酵方法进行发酵（即红色链霉菌孢子经一级二级种子培养，再将二级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，控制培养温度32-34℃，通气量1：1.1-1.4v/v/min，搅拌发酵，发酵过程中根据pH补入葡萄糖和豆油，根据正丙醇残留补入正丙醇），待发酵至90hr后接入培养好的芽孢状态的巨大芽孢杆菌，接种量0.05-0.1%，此时发酵培养基中的营养物质浓度较低，总糖1.0-1.5%，红霉素含量4000-
4500u/ml，芽孢杆菌接入后对红霉素发酵有明显促进作用，红霉素产生速率提高10%以上，放罐效价9082u/ml较对照提高13.5%，红霉素A效价7468u/ml,提高14.5%以上。

[0016] 实施例21、巨大芽孢杆菌菌液的制备：
巨大芽孢杆菌培养基：葡萄糖1.0%，玉米浆：0.8%，尿素0.1%，硫酸镁0.05%，碳酸钙
0.05%，消沫剂适量。灭菌温度118～121℃，保温15分钟，降温待种。

[0017] 将保存的巨大芽孢杆菌菌液挑取一环接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床150转，温度29℃培养10hr，镜检菌体成芽孢状，接入如下发酵液中。

[0018] 2、将巨大芽孢杆菌菌液接入红霉素发酵液混种培养按实施例1进行红霉素发酵，生长70hr将培养好的芽孢杆菌菌悬液按接种量0.1%接入发酵体系，生长165hr放罐，放罐效价9295u/ml，较对照提高16.9%，发酵液A效价7584u/ml，较对照提高16.3%。

[0019] 实施例31、巨大芽孢杆菌菌液的制备：
巨大芽孢杆菌培养基：葡萄糖:1.5%，玉米浆：1.2%，尿素0.4%，硫酸镁0.1%，碳酸钙
0.1%，消沫剂适量。灭菌温度118～121℃，保温18分钟，降温待种。

[0020] 将保存的巨大芽孢杆菌菌液挑取一环接种到灭菌好的摇瓶培养基中，置摇床200转，温度29℃培养15hr，镜检菌体成芽孢状，接入如下发酵液中。

[0021] 2、将巨大芽孢杆菌菌液接入红霉素发酵液混种培养按实施例1进行红霉素发酵，生长80hr将培养好的芽孢杆菌菌悬液按接种量0.05%接入发酵体系，生长165hr放罐，放罐效价9528u/ml，较对照提高16.04%，发酵液A效价7625u/ml，较对照提高16.95%。

[0022] 对比实施例红霉素发酵菌种为放线菌中的红色链霉菌，红色链霉菌孢子经一级、二级种子培养，再将二级种子液按20%接种量接种于灭菌好的发酵培养基中培养，培养温度32-34℃，通气量
1：1.1-1.4v/v/min，搅拌，发酵过程溶氧30%以上，根据PH补入碳源、豆油，根据正丙醇残留