生产高级醇的方法 |
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| 申请号 | CN201610054149.7 | 申请日 | 2016-01-27 | 公开(公告)号 | CN105820971A | 公开(公告)日 | 2016-08-03 |
| 申请人 | 赢创德固赛有限公司; | 发明人 | T.哈斯; T.比尔特; M.德姆勒; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及生产高级醇的方法，本发明还涉及反应混合物和生产至少一种高级醇的方法，所述方法包括反应混合物，所述反应混合物包含在含有一 氧 化 碳 气体的含 水 培养基中的第一和第二 微 生物 的混合培养物，其中-所述第一微生物是能够将碳源转 化成 乙酸和/或 乙醇 的产乙酸微生物；和-所述第二微生物选自能够转化乙酸和/或乙醇以形成酸的克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和C. carboxidivorans；其中所述第一微生物进一步能够将所述酸转化成相应的高级醇，且所述高级醇包含至少6个碳 原子 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.反应混合物，其包含在含有一氧化碳气体的含水培养基中的第一和第二微生物的混合培养物，其中 |
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| 说明书全文 | 生产高级醇的方法技术领域背景技术[0003] 庚醇例如用于心脏电生理实验以阻断间隙连接和增加肌细胞之间的轴电阻。增加轴电阻会减小传导速度，并增加心脏对折返激动（re-entrant excitation）和持续性心律失常的易感性。而且，1-庚醇具有愉快的气味并由于其芳香用在化妆品中。 [0005] 目前，高级醇主要从石油中制造。这些化合物通过裂化汽油或石油获得，这对于环境是有害的。另外，由于对这些原材料的成本将与石油的价格联系，随着在将来石油价格的预期增加，高级醇的价格也可以相对于增加的石油价格而增加。 [0006] Alfol®醇方法是用于使用有机铝催化剂从乙烯生产高级醇的方法。该反应产生线性长链伯醇(C2-C28)。该方法使用铝催化剂使乙烯低聚，并允许得到的烷基被氧化。然而，这种方法产生宽范围的醇并且维持该分布模式。这种恒定模式限制了生产者仅制造在最高需求或具有最佳经济价值的特定醇范围的能力。并且，反应中所需的气体必须非常干净而且对于成功进行该反应需要不同的气体组成。 [0007] WO2009100434也描述了从碳水化合物生产丁醇和己醇的间接方法。该方法包括同型产乙酸发酵以生产乙酸中间体，所述中间体然后化学转化成乙醇。乙醇和乙酸中间体的剩余部分然后在产酸发酵中用作底物，以生产丁酸和己酸中间体，其然后化学转化成丁醇和己醇。但是，该方法使用昂贵的原材料碳水化合物并具有两个额外的方法步骤，酯形成和酯的化学氢化，这使该方法不仅更长，而且导致沿途有用材料的损失。 [0008] Perez, J.M., 2012公开了使用扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）在合成气的存在下，将短链羧酸转化成其相应醇的方法。但是，短链羧酸必须作为底物添加，用于转化为相应的高级醇。 [0009] 因此目前可用的高级醇生产方法具有在气体底物进入发酵液的传质中的限制、更低生产率和更低终产物浓度，对于产物纯化导致更高的能源成本。 [0010] 因此，理想的是找到除了纯基于石油或基于玉米来源之外的更可持续的原材料，作为起始材料用于通过生物技术手段的高级醇的生产，其也对环境造成较小的损伤。特别是，对于从可持续原材料的高级醇的简单和有效的一罐法(one-pot)生物技术生产存在需求。 发明内容[0011]本发明提供了在一氧化碳（CO）的存在下，至少两种微生物的反应混合物，其中第一微生物可以是能够将CO转化成乙酸和/或乙醇并且第二微生物可以是能够将乙酸和/或乙醇转化成至少一种酸，并且所述第一微生物可以是随后能够将酸转化为相应的高级醇，其中所有的步骤可以在CO的存在下进行并且所述高级醇包含至少6个碳原子或更多。具体是，CO作为气体底物存在于反应混合物中，并且CO以2%和/或更多的浓度存在于气体底物中。 [0012] 在本发明的一个方面，提供了包含在含有一氧化碳气体的含水培养基中的第一和第二微生物的混合培养物的反应混合物，其中- 所述第一微生物是能够将碳源转化成乙酸和/或乙醇的产乙酸微生物；和 - 所述第二微生物选自能够转化乙酸和/或乙醇以形成酸的克氏梭菌（Clostridium kluyveri）和C. carboxidivorans； 其中所述第一微生物进一步能够将酸转化成相应的高级醇，其中所述高级醇包含至少 6个碳原子。 [0013] 根据本发明的另一方面，提供了在包含第一和第二微生物的培养物的含水培养基中生产至少一种高级醇的方法，其中，-所述第一微生物是能够将包含一氧化碳的碳源转化成乙酸和/或乙醇的产乙酸微生物；和 -所述第二微生物选自能够转化乙酸和/或乙醇以形成酸的克氏梭菌和C. carboxidivorans； 其中所述第一微生物进一步能够将酸转化成相应的高级醇，并且所述高级醇包含至少 6个碳原子。 [0014] 根据本发明的进一步的方面，所述在含水培养基中生产至少一种高级醇的方法包括下列步骤：（a）将能够将包含一氧化碳的碳源转化成乙酸和/或乙醇的第一产乙酸微生物添加到含水培养基中；和 （b）添加选自能够转化乙酸和/或乙醇以形成酸的克氏梭菌、C. carboxidivorans的第二微生物； 其中所述第一微生物进一步能够将酸转化成相应的高级醇，并且所述高级醇包含至少 6个碳原子。 [0015] 在一个实例中，步骤（a）和（b）同时进行。在另一个实例中，步骤（a）和（b）先后进行。第一和第二微生物的浓度可以持续地维持以保持反应进行。在一个实例中，在进行步骤（b）之前，测量乙醇和/或乙酸的浓度以保证对于第二微生物达到最佳浓度。具体是，乙酸和/或乙醇浓度可以是在对于在含水培养基中存在对于第二生物体足够底物以形成至少一种高级酸的最佳的水平。本领域技术人员将能够容易确定合适的时间以将第二生物体包括到含水培养基中。 [0016] 在另一个实例中，步骤（a）和（b）同时进行。在此实例中，所述第二微生物可以是直至由第一微生物的活性可以制造出足量的乙酸和/或乙醇时才是有活性的（即可以是保持潜伏的(latent)）。在含水培养基中存在任一种微生物都不会破坏或者阻碍另一种的活性和/或效率。 [0017] 本发明的一个优点可在于可以使用远更有利的原材料的CO2/CO混合物。这些不同来源包括天然气、生物气、煤炭、油、植物残渣等。所述方法的另一个优点可以是高碳产量。这通过所形成的CO2的返回而成为可能。即，CO2可以在第一阶段中发生反应回到乙酸。另一优点可能在于关于所用的发酵条件更大的灵活性，因为任何产乙酸和任何能够进行乙醇羧酸发酵途径的微生物都可以组合使用，用于高级醇的实际生产。本发明的另一个优点可以是，由于第二微生物可以在CO的存在下起作用和/或从乙酸和/或乙醇生产酸，所以第一和第二微生物都可以存在于均匀混合物中，用于从包含CO的碳源生产高级醇。第二微生物的这个特点使得从碳源像CO生产高级醇成为一步法，使方法更有效和产量更高。令人惊奇的是，因为第二微生物的这个优点，用于制造高级醇的一步法可以在单个发酵罐中进行而无需中间分离步骤。使用此一步法也可以有浓度增加的终产物。这是令人惊奇的，因为Baffert C., 2011和Thauer, R.K., 1973均教导氢化酶在CO的存在下被抑制。对于此原因和更多，WO2013/167663在（a）在产乙酸生物体的存在下从CO和/或CO2形成乙酸和/或乙醇的步骤和（b）在第二微生物的存在下形成包含至少一个氧原子的烃（例如己酸）的步骤之间包括分离步骤。在一罐法合成中根据本发明的任何方面从CO生产高级醇特别是包含至少6个碳原子的高级醇的能力因此是令人惊奇的结果。在任何情况下，即使步骤（a）和（b）在两个分开的步骤（即，两个分开的容器）中进行，对于去除所有痕量CO以使第一和第二微生物发挥作用的特定提取方法都可以不存在需求。 [0018] 如在实例中可见，CO的存在允许在根据本发明的任一方面的方法中生产己醇，其中所述碳源包含至少CO。 [0019] 在至少一种产乙酸微生物和能够进行乙醇-羧酸发酵途径的第二微生物的存在下，包含CO的碳源可以转化成至少一种酸。具体是，所述酸可以包含6个或更多个碳原子。更具体的是，所形成的酸可以选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等。具体是，在至少一种产乙酸菌的存在下，包含CO的碳源可以导致乙醇和/或乙酸的产生。 [0020] 如本文所用术语“产乙酸菌”指能够进行Wood-Ljungdahl途径并因此能够转化CO、CO2和/或氢气(hydrogen)成乙酸的微生物。这些微生物包括在其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径，但由于遗传修饰已获得此性状的微生物。这些微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。这些微生物还可以称为一氧化碳营养菌。目前，产乙酸菌的21个不同的属是现有技术(Drake等, 2006)已知的，并且这些还可以包括一些梭菌(Drake & Kusel, 2005)。这些细菌能够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源和氢气(hydrogen)作为能源（Wood，1991）。此外，醇、醛、羧酸以及很多己糖也可以用作碳源(Drake等, 2004)。导致形成乙酸的还原途径称为乙酰CoA或Wood-Ljungdahl途径。 [0021] 具体而言，产乙酸菌可选自潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum) (DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum) (DSM 4132)、醋酸杆菌属第446号种(Acetobacterium species no. 446)(Morinaga 等人, 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950, 之前的产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus), 之前的Peptostreptococcus productus)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum) (DSM 1496)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans(DSM 15243)、Clostridium coskatii(ATCC编号 PTA-10522)、Clostridium drakei(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、扬氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、扬氏梭菌ERI-2 (ATCC 55380)、扬氏梭菌O-52 (ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei) (DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌属种ATCC 29797 (Schmidt 等人, 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚种(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum) (DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆尔氏菌属种HUC22-1(Moorella sp. HUC22-1) (Sakai 等人, 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) (DSM 521, 之前的 Clostridium thermoaceticum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、Oxobacter pfennigii (DSM 322)、Sporomusa aerivorans (DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata )(DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030, 之前的凯伍产醋菌 (Acetogenium kivui)。更具体而言，可以使用Clostridium carboxidivorans的菌株ATCC BAA-624。甚至更具体而言，可以使用例如描述于U.S. 2007/0275447和U.S. 2008/0057554的Clostridium carboxidivorans的标记为“P7”和“P11”的细菌菌株。 [0022] 另一特别合适的细菌可以是扬氏梭菌。具体而言，可以使用选自扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌COL和扬氏梭菌O-52的菌株来转化合成气为己酸。这些菌株例如描述于WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988 和ATCC 55989。在另一个实例中，对于第一生物体所选产乙酸菌可以是产乙醇梭菌。 [0023] 产乙酸菌可以与可能能够进行乙醇-羧酸发酵途径的第二微生物结合使用。在一个实例中，可以使用产乙酸菌和可能能够进行乙醇-羧酸发酵途径的第二微生物两者从包含CO的碳源生产高级酸。酸可以被转化成相应的选自己醇、辛醇、壬醇、癸醇等的高级醇。在一个实例中，所述高级醇可以选自1-己醇、2-己醇、3-己醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、辛醇、壬醇、癸醇等。 [0024] 在一个实例中，所述乙醇和/或乙酸可以在能够进行乙醇-羧酸发酵途径的第二微生物的存在下转化成相应的高级酸。所述乙醇-羧酸发酵途径至少详细描述于Seedorf, H., 等, 2008。具体是，所述第二生物体可以选自克氏梭菌、C.Carboxidivorans等。这些第二微生物包括在其野生型形式不具有乙醇-羧酸发酵途径，但由于遗传修饰已获得此性状的微生物。具体是，所述第二微生物可以是克氏梭菌。 [0025] 在另一个实例中，所述第二微生物可以是野生型生物体，其表达选自E1至E11的至少一种酶，其中E1为醇脱氢酶（adh），E2是乙醛脱氢酶（ald），E3是乙酰乙酰辅酶A硫解酶（thl），E4是3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶（hbd），E5是3-羟基丁酰辅酶A脱水酶（crt），E6是丁酰辅酶A脱氢酶（bcd），E7是电子传递黄素蛋白亚基（etf），E8是辅酶A转移酶（cat），E9是乙酸激酶（ack），E10是磷酸转乙酰酶（pta）和E11是转氢酶。具体是，根据本发明任一方面的所述野生型第二微生物可以表达至少E2、E3和E4。甚至更具体的是，根据本发明任一方面的所述野生型第二微生物可以表达至少E4。 [0026] 在另一个实例中，根据本发明任一方面的所述第二微生物可以是遗传修饰的生物体，其相对野生型微生物具有表达增加的选自E1至E11的至少一种酶，其中E1是醇脱氢酶（adh），E2是乙醛脱氢酶（ald），E3是乙酰乙酰辅酶A硫解酶（thl），E4是3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶（hbd），E5是3-羟基丁酰辅酶A脱水酶（crt），E6是丁酰辅酶A脱氢酶（bcd），E7是电子传递黄素蛋白亚基（etf），E8是辅酶A转移酶（cat），E9是乙酸激酶（ack），E10是磷酸转乙酰酶（pta）和E11是转氢酶。具体是，根据本发明任一方面的所述遗传修饰的第二微生物可以表达至少酶E2、E3和E4。甚至更具体的是，根据本发明任一方面的所述遗传修饰的第二微生物可以表达至少E4。酶E1至E11可以分离自克氏梭菌。本领域技术人员可以能够使用本领域已知方法测量这些酶的每一种的活性。具体是，酶E1和E2的活性可以使用至少在Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979中教导的测定法测量；酶E2的活性也可以使用Smith L.T., 1980中教导的测定法测量；酶E3和E4的活性可以使用至少在Sliwkowski M.X., 1984中教导的测定法测量；E4的活性也可以使用Madan, V.K., 1972中教导的测定法测量；E5的活性也可以使用Bartsch, R.G., 1961中教导的测定法测量；酶E6和E7的活性可以使用在Li, F., 2008中教导的测定法测量；E7的活性也可以使用Chowdhury, 2013中教导的测定法测量；E8的活性可以使用Stadman, 1953中教导的测定法测量；E9的活性可以使用Winzer, K., 1997中教导的测定法测量；E10的活性可以使用Smith L.T., 1976中教导的测定法测量；并且E11的活性可以使用Wang S, 2010中教导的测定法测量。 [0027] 根据本发明的任一方面，所述第一和/或第二微生物可以是遗传修饰的微生物。遗传修饰的细胞或微生物可以与野生型细胞或微生物是遗传上不同的。根据本发明的任一方面的遗传修饰的微生物和野生型微生物之间的遗传差异可以是存在于遗传修饰的微生物中完整基因、氨基酸、核苷酸等，其在野生型微生物中可以是不存在的。在一个实例中，根据本发明任一方面的遗传修饰的微生物可以包含使微生物能够产生至少一种羧酸的酶。相对根据本发明任一方面的遗传修饰的微生物的野生型微生物可以不具有或无可检测的使得遗传修饰的微生物能够产生至少一种羧酸的酶活性。如本文所用术语“遗传修饰的微生物”可以与术语“遗传修饰的细胞”互换使用。根据本发明任一方面的遗传修饰可以在微生物的细胞上进行。 [0028] 如本文所用关于细胞或微生物的短语“野生型”可以指具有以如野外天然所见形式的基因组组成的细胞。该术语可以应用于全细胞和个别基因两者。术语“野生型”因此不包括这样的细胞或这样的基因，其中的基因序列已经至少部分被人使用重组方法进行改变。 [0029] 本领域技术人员将能够使用任何本领域已知方法遗传修饰细胞或微生物。根据本发明的任一方面，所述遗传修饰的细胞可以是被遗传修饰以便在一个限定的时间间隔内，在2小时内，特别是8小时或24小时内，其形成比野生型细胞多至少两倍，特别是至少10倍，至少100倍，至少1000倍或至少10000倍的羧酸和/或相应的羧酸酯。产物形成的增加可以如下确定，例如通过各自分开地在相同条件下（相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件）培养根据本发明任一方面的细胞和野生型细胞，在合适的营养培养基中特定时间间隔，并然后确定营养培养基中目标产物（羧酸）的量。 [0030] 在另一个实例中，可以通过任何公开于Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, Ding H.等, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T., 等, 1948等的方法，从包含CO的碳源生产酸。甚至更具体的是，所述酸可以在至少克氏梭菌的存在下从包含CO的碳源生产。 [0031] 甚至更具体地，根据本发明任一方面，所述酸在至少一种产乙酸微生物和克氏梭菌的存在下产生。在一个实例中，所述产乙酸微生物可以是扬氏梭菌或Clostridium ragsdahlei。 [0032] 在从包含CO的碳源的酸的生产中，可以使用细菌的组合。可以存在超过一种的产乙酸菌，其组合有一种或多种第二微生物。在另一个实例中，可以存在超过一种类型的产乙酸菌和仅一种类型的第二微生物。在又另一个实例中，可以存在超过一种的第二微生物，其组合有仅一种产乙酸菌。 [0033] 反应混合物可以在均匀的混合物中包含两种微生物。如本文所用术语“均匀的混合物”指在培养基中空间上均匀分布的微生物的混合物。具体是，所述混合物可以在含水培养基中包含均匀分布的至少两种微生物，产乙酸微生物和第二微生物。在一个实例中，在混合物中可以存在大约相等数目的产乙酸微生物和第二微生物。在另一个实例中，在混合物中可以存在相比第二微生物更多的产乙酸微生物。在又另一个实例中，在混合物中可以存在相比产乙酸微生物更多的第二微生物。在所有可能的实例中，微生物在单一均匀混合物中，其中它们均匀分布于整个混合物中。如本文所用“含水培养基”可以与术语“反应混合物”互换使用。 [0034] 如本文所用术语“乙酸”指乙酸和其盐两者，这是不可避免的结果，因为如本领域已知的，由于微生物在含水环境中工作，并且在存在的盐和酸之间总是存在平衡。 [0035] 根据本发明的任一方面，术语“第二微生物”指不同于“第一微生物”的微生物。 [0036] 在另一个实例中，步骤（a）和步骤（b）可以在两个不同容器中进行。在一个实例中，步骤（a）可以在发酵罐1中进行，其中所述第一微生物与包含CO的碳源接触以产生乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以然后在发酵罐2中与第二微生物接触以产生至少一种酸。所述酸然后可以进料回发酵罐1中以将酸转化为所希望的高级醇。可以建立循环，其中在发酵罐1中产生的乙酸和/或乙醇可以定期进料入发酵罐2，在发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以转化成至少一种酸并且发酵罐2中的酸进料回发酵罐1。进料入发酵罐1的CO可以与乙酸和/或乙醇一起转移到发酵罐2。不需要专门的提取方法，因为已经令人惊奇地发现第二微生物在CO的存在下将乙酸和/或乙醇转化成至少一种酸。 [0037] 在另一个实例中，培养基在发酵罐1和2之间循环。因此，发酵罐1中产生的乙醇和/或乙酸可以进料入发酵罐2并且在发酵罐2中产生的酸可以进料回发酵罐1。在循环培养基的过程中，来自发酵罐1的CO可以导入发酵罐2。并且，在发酵罐2中产生的酸可以后续地再次导入发酵罐1。发酵罐2中的第二微生物可以能够在从发酵罐1循环到发酵罐2中的CO的存在下继续从乙酸和乙醇产生酸。在发酵罐1和2中积累的醇可以然后通过本领域已知方法提取。 [0038] 在进一步的实例中，可以存在三个容器进行根据本发明任一方面的方法。第一微生物可以存在于第一发酵罐中，第二微生物在第二发酵罐中，并且第三发酵罐又具有第一微生物。在发酵罐1中，第一微生物与碳源接触以产生乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以然后在发酵罐2中与第二微生物接触以产生至少一种酸。酸然后进料入发酵罐3以产生至少一种醇。 [0039] 具体是，CO可以在连续气流中提供到含水培养基中。气流中的CO浓度可以按体积计以气流中气体总量的体积的至少2%存在。具体是，CO可以以如下浓度存在：按体积计2-99%的范围，按体积计2-95%的范围，按体积计5-95%的范围，按体积计10-90%的范围，按体积计15-85%的范围，特别是按体积计20-80%的范围。更具体的是，CO的浓度可以是按体积计约 7%、24%。碳源中一氧化碳的气相浓度至少可以使用具有热导检测器的Agilent Technologies Inc.的气相色谱仪GC 6890N来测量。 [0040] 如本文所用术语“约”指在20%内的变化。具体是，如本文所用术语“约”指给定测量值或值的+/- 20%，更具体+/- 10%，甚至更具体+/- 5%。 [0041] 除非另有说明，所有百分比（%）都是体积百分比。 [0042] 根据本发明任一方面使用的碳源包含二氧化碳和/或一氧化碳。本领域技术人员将理解存在很多可能的来源，用于提供CO和/或CO2作为碳源。可以看出，实践中，作为根据本发明任一方面的碳源，可以使用任何气体或任何气体混合物，其能够为微生物提供足量的碳，以便可以从CO和/或CO2的来源形成乙酸和/或乙醇。 [0043] 通常，对于根据本发明任一方面的混合的培养物，碳源包含按体积计至少50%，按体积计至少70%，特别是按体积计至少90%的CO和/或CO2，其中按体积计的百分比-%相对于在混合培养物中第一微生物可用的所有碳源。 [0044] 在根据本发明的任一方面的混合培养物中，可以提供碳材料来源。以气体形式的碳源的实例包括废气如合成气、烟道气和和酵母发酵或梭菌发酵产生的石油炼厂气(petroleum refinery gas)。这些废气从含有纤维素材料的气化或煤气化形成。在一个实例中，这些废气不一定作为其它方法的副产物产生，但是可以特异性产生，用于与根据本发明任一方面的混合培养物一起使用。 [0045] 根据本发明任一方面，所述碳源可以是合成气。合成气可以例如作为煤气化的副产物产生。相应地，根据本发明任一方面的混合培养物的微生物可以能够将作为废品的物质转化成有价值的资源。在另一个实例中，合成气可以是广泛使用的、低成本的农业原材料的气化的副产物，用于与本发明的混合培养物一起使用，以生产至少一种高级醇。 [0046] 存在很多可以转化成合成气的原材料的实例，因为几乎所有的植物都可以用于此目的。具体是，原材料选自多年生草诸如芒草，玉米残渣，加工废料如锯末等。 [0047] 通常，合成气可以在干燥的生物质的气化装置中获得，主要是通过热解，部分氧化和蒸汽重整，其中合成气的主要产物是CO、H2和CO2。合成气还可以是CO2电解的产物。本领域技术人员将会理解进行CO2的电解的合适条件，以产生包含所需量的CO的合成气。 [0048] 通常，从气化方法获得的一部分合成气首先被加工以优化产品产量并避免形成焦油。不希望的焦油和合成气中的CO的裂化可以使用石灰和/或白云石进行。这些方法详细描述于例如Reed，1981。 [0049] 来源的混合物可以被用作碳源。 [0050] 根据本发明任一方面，可以与碳源一起提供还原剂例如氢气(hydrogen)。具体是，当提供和/或使用C和/或CO2时，可以提供此氢气。在一个实例中，氢气是根据本发明的任一方面存在的合成气的一部分。在另一个实例中，其中合成气中氢气不足以用于本发明的方法，可以提供额外的氢气。 [0051] 本领域技术人员将理解进行根据本发明任一方面的方法所需的其它条件。具体是，容器（例如，发酵罐）中的条件可以取决于所使用的第一和第二微生物而变化。适合微生物的最佳功能的条件的变化在本领域技术人员的知识范围内。 [0052] 在一个实例中，根据本发明任一方面的方法可以在具有5-8，5.5-7的pH的含水培养基中进行。压力可以在1和10 bar之间。 [0053] 具体是，所述含水培养基可以包含含有CO和/或CO2的碳源。更具体的是，包含CO和/或CO2的碳源在连续气流中提供到含水培养基。甚至更具体的是，所述连续气流包含合成气。在一个实例中，气体是相同流(flow/stream)的一部分。在另一个实例中，每种气体是提供到含水培养基的分开的流(flow/stream)。这些气体可以例如使用在含水培养基中打开的单独的喷嘴、过滤器板(frit)、在将气体提供入含水培养基的管内的膜等来分开。 [0054] 具体是，根据本发明任一方面的反应混合物（即，第一微生物——产乙酸生物体、第二微生物、和包含一氧化碳的碳源的混合物）可以在任何已知生物反应器或发酵罐中使用，以进行本发明的任一方面。 [0055] 如本文所用“高级醇”指包含6-10个碳原子的醇并且可以有些粘稠或油腻，并具有更重的水果味。高级醇可以包括但不限于己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇等。更具体地，所述高级醇可以选自1-己醇、1-辛醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇以及它们的组合。 [0056] 根据本发明的任一方面，“相应的高级醇”指具有与这样的酸相同碳原子数的醇，相应的高级醇从所述酸形成。例如，己酸可以转化成相应的醇——己醇；庚酸可以转化成相应的醇——庚醇；辛酸可以转化成相应的醇——辛醇；壬酸可以转化成相应的醇——壬醇；癸酸可以转化成相应的醇——癸醇等。 [0057] 在一个实例中，根据本发明任一方面的方法可以导致酸和/或高级醇的混合物的形成。在另一个实例中，可以调整根据本发明的任一方面的方法的参数，以产生相比其余多于一种酸和/或高级醇。例如，具有下列参数，在复合培养基（0.25 g/L NH4Cl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.31 g/L K2HPO4、0.23 g/L KH2PO4、2.5 g/L NaHCO3、1 g/L酵母提取物、10 g/L 乙酸钾(K-acetate)、20 g/l 乙醇、0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸、1.5 mg/L FeCl2 x 4 H2O、70 µg/L ZnCl2 x 7 H2O、100 µg/L MnCl2 x 4 H2O、6 µg/L硼酸、190 µg/L CoCl2 x 6 H2O、2 µg/L CuCl2 x 6 H2O、24 µg/L NiCl2 x 6 H2O、36 µg/L Na2MoO4 x 2 H2O、3 µg/L Na2SeOO3 x 5 H2O、4 µg/L Na2WO4 x 2 H2O、100 µg/L 维生素B12、80 µg/L 对氨基苯甲酸、20 µg/L 生物素、200 µg/L 烟酸、100 µg/L 泛酸钙、300 µg/L 盐酸吡哆醇、200 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O）中生长混合培养物，在 37℃，具有约6.5的pH，持续约 240小时，可以控制丁醇和/或己醇产生的浓度。 [0058] 在根据本发明任一方面的反应混合物中，可以存在氧气。相应地，根据本发明任一方面的第一和第二微生物可以是好氧生长。具体是，可以在连续气流中将氧气提供到根据本发明任一方面的含水培养基中。更具体地，气流在的O2浓度可以是以按体积计气体总量的少于1%存在于气流中。具体是，氧气可以是以下列的浓度范围存在：按体积计0.000005至2%，按体积计0.00005至2%、按体积计0.0005至2%、按体积计0.005至2%、按体积计0.05至2%、按体积计0.00005至1.5%、按体积计0.0005至1.5%、按体积计0.005至1.5%、按体积计0.05至 1.5%、按体积计0.5至1.5%、按体积计0.00005至1%、按体积计0.0005至1%、按体积计0.005至 1%、按体积计0.05至1%、按体积计0.5至1%、按体积计0.55至1%、按体积计0.60至1%、特别是以按体积计0.60至1.5%、0.65至1%和0.70至1%的范围。具体是，当在气相/流中的O2比例是按体积计相对气流中气体体积约0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、 1.5、2%时，产乙酸微生物是特别合适的。本领域技术人员将能够使用本领域已知的任一种方法测量气流中的氧气体积浓度。具体是，可以使用本领域已知的任何方法测量氧气体积。 在一个实例中，可以通过来自PreSens Precision Sensing GmbH的微量氧浸入探头测量氧气的气相浓度。可以通过荧光猝灭测量氧气浓度，其中猝灭程度与气相中氧分压关联。甚至更具体的是，当通过具有按体积计总气体的少于1%的氧浓度（以按体积计提供给反应混合物的气流中气体的总体积的约0.015%）的气流提供氧气时，根据本发明任一方面的第一和第二微生物能够在含水培养基中最佳地工作。 [0059] 根据本发明任一方面的含水培养基可以包含氧气。氧气可以通过本领域已知的任何方法溶解在培养基中。具体是，氧气可以是以0.5mg/L存在。具体是在含水培养基中游离氧的溶解浓度可以至少是0.01mg/L。在另一个实例中，溶解氧可以是约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。具体是，溶解氧浓度可以是0.01-0.5mg/L、0.01- 0.4mg/L、0.01-0.3mg/L、0.01-0.1mg/L。具体是，氧气可以在连续气流中提供到含水培养基。更具体的是，所述含水培养基可以包含氧气和包含CO和/或CO2的碳源。更具体的是，氧气和包含CO和/或CO2的碳源在连续气流中提供到含水培养基。甚至更具体的是，所述连续气流包含合成气和氧气。在一个实例中，两种气体都是相同流的一部分。在另一个实例中，每种气体是提供到含水培养基的分开的流。这些气体可以例如使用在含水培养基中打开的单独的喷嘴、过滤器板、在将气体提供入含水培养基的管内的膜等来分开。所述氧气可以是游离氧。根据本发明的任一方面，“包含游离氧的反应混合物”指包含以O2形式的元素氧的反应混合物。O2可以是在反应混合物中的溶解氧。具体是，溶解氧可以以 ≥ 5ppm (0.000005体积%; 5x10-6)的浓度。本领域技术人员可以能够使用本领域已知任何方法以测量溶解氧的浓度。在一个实例中，溶解氧可以通过氧浸入探头（来自PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany的PSt6型）测量。 [0060] 在根据本发明任一方面的一个实例中，碳源是合成气并且碳源可以在提供到含水培养基中之前与氧气掺合。此掺合步骤可以改进反应中的效率和高级醇的产生。本发明的方法的总体效率、醇生产率和/或总体碳捕获可以取决于连续气流中的CO2、CO、H2和O2的化学计量。所应用的连续气流可以是组成O2、CO2和H2。具体是，在连续气流中，O2的浓度范围可以在按体积计0.000005至1%内，CO/CO2 按体积计约10–50%，具体是33%，并且H2会在按体积计44%至84%内，具体是64至66.04%。更具体地，连续气流中的气体浓度可以是按体积计0.15%的O2，按体积计32%的CO/CO2和按体积计64%的H2。在另一个实例中，连续气流还可以包含惰性气体如N2，多至按体积计50%的N2浓度。 [0061] 本领域技术人员将理解有必要在相关的间隔监测流的组成和流速。可以通过改变组分流的比例来实现流的组成的控制，以获得目标或所需组成。可以通过本领域已知任何方法监测掺合流的组成和流速。在一个实例中，系统适合于连续监测至少两种流的流速和组成，并将它们组合以产生在最佳组成的连续气流中单一掺合的底物流，和用于将优化的底物流传递到根据本发明任一方面的混合培养物中的手段。 [0062] 有利的是在反应混合物和/或提供到反应混合物的气流中掺入O2，因为大多数包括合成气的废气包含少量或大量的氧气。在使用合成气作为碳源用于生产高级醇之前去除该氧气是困难和成本高昂的。根据本发明任一方面的方法允许生产至少一种高级醇而无需首先从碳源中去除任何痕量的氧气。这使得可以节省时间和金钱。在一个实例中，当在根据本发明任一方面的反应混合物中存在O2时，第一微生物即所述产乙酸菌可以存在于两个生长期。在实例中，至少一种产乙酸菌可以在指数生长期，并且另一种产乙酸菌可以在产乙酸微生物的生命周期中任何其它生长期中。具体是，根据本发明的任一方面，在含水培养基中的产乙酸菌可以包含一种在指数生长期中的产乙酸菌和另一种在稳定期的产乙酸菌。在氧气的存在下，不存在指数生长中的产乙酸菌，在稳定期的产乙酸菌可以不能产生乙酸和/或乙醇。此现象至少被Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013等所证实。发明人因此惊奇地发现在指数生长中产乙酸菌的存在下，在任何生长期的产乙酸菌都可以有氧呼吸并产生乙酸和/或乙醇，以超过或等于当反应混合物缺氧时产生的量。在一个实例中，指数生长期中的产乙酸菌可以能够从反应混合物中去除游离氧，为在任何生长期中的产乙酸菌提供合适的环境（无游离氧）以代谢包含CO的碳底物并产生乙酸和/或乙醇。 [0063] 在另一个实例中，所述含水培养基可以在包含CO的碳源的存在下，早已包含任何生长期特别是在稳定期的产乙酸菌。在此实例中，在提供到含水培养基的碳源中或含水培养基本身中可以存在氧气。在氧气的存在下，产乙酸菌可以是无活性的并且在添加指数生长期的产乙酸菌之前不产生乙酸和/或乙醇。正是在这个实例中，指数生长期的产乙酸菌可以被添加到含水培养基中。在含水培养基中早已发现的无活性产乙酸菌可以然后被激活并可以开始产生乙酸和/或乙醇。 [0064] 在进一步的实例中，任何生长期的产乙酸菌可以首先与指数生长期的产乙酸菌混合并然后和添加的碳源和/或氧气混合。 [0065] 根据本发明任一方面，在氧的存在下生长的指数生长期的微生物可以导致微生物获得适应以在氧的存在下生长和代谢。具体是，所述微生物可以能够从微生物周围环境去除氧。此新近获得的适应允许指数生长期的产乙酸菌摆脱氧环境并因此从碳源产生乙酸和乙醇。具体是，具有新获得的适应的产乙酸菌允许细菌将包含CO的碳源转化成乙酸和/或乙醇并在醇的存在下将新形成的酸转化成相应的高级醇。选自克氏梭菌和C. carboxidivorans的第二微生物可以转化乙酸和/或乙醇以形成新形成的酸。如早先所述，对此方法有利的是在O2的存在下进行（即在反应混合物中包含O2），因为大部分包含合成气的废气都包含少量或大量的氧气。此反应混合物允许从废气生产高级醇而无需经过首先提取氧的额外昂贵的步骤的方法。 [0066] 根据本发明任一方面的反应混合物因此可以包含CO、游离氧和指数生长期的产乙酸菌。 [0067] 本领域技术人员将理解不同生长期的微生物和测量它们并鉴定它们的方法。具体是，在批次培养中大部分微生物可以见于至少四种不同的生长期；即，它们是：延滞期（A），对数期或指数期（B），稳定期（C），和死亡期（D）。对数期可以进一步分成早期对数期和中期至晚期对数/指数期。稳定期也可以进一步区分成早期稳定期和稳定期。例如Cotter, J.L., 2009, Najafpour. G., 2006, Younesi, H., 2005和Köpke, M., 2009公开了不同生长期的产乙酸菌。具体是，细胞的生长期可以使用至少在Shuler ML, 1992和Fuchs G., 2007中教导的方法进行测量。 [0068] 延滞期是将细胞接种到新鲜培养基后紧接着的时期，群体暂时保持不变。尽管没有发生明显的细胞分裂，但是细胞可以在体积或质量方面生长，合成酶、蛋白、RNA等并且代谢活性增加。延滞期的长度可以取决于广泛的因素，包括接种物的多少；从转移中的物理损伤或冲击(shock)恢复所必需的时间；用于合成必要的辅酶或分裂因子所需的时间；和用于合成新的（可诱导的）酶所需的时间，所述酶是代谢培养基中存在的底物所必需的。 [0069] 生长的指数（对数）期是平衡生长的模式，其中所有细胞通过二分裂规则地分裂并通过几何级数生长。细胞以恒定速率分裂，取决于生长培养基的组成和接种的条件。细菌培养物的指数生长速率表示为世代时间，也是细菌群体的倍增时间。世代时间（G）定义为每世代（n=世代数目）的时间（t）。因此，G=t/n是从其推导世代时间计算的公式。指数期可以分成（i）早期对数期和（ii）中期至晚期对数/指数期。本领域技术人员可以容易地鉴定何时微生物特别是产乙酸微生物进入对数期。例如，计算产乙酸菌的生长速率以确定是否它们在对数期的方法可以使用至少在Henstra A.M., 2007教导的方法完成。具体是，根据本发明任一方面的指数生长期的微生物可以包括在早期对数期和中期至晚期对数/指数期的细胞。 [0070] 稳定期是当指数生长结束的时期，因为在批次培养（例如封闭系统，诸如试管或摇瓶）中指数生长不可以永远继续。群体生长受限于三个因素之一：1、可利用营养物的耗尽；2.抑制性代谢物或终产物的积累；3.空间的耗尽，在此情况下称为缺少“生物空间”。在稳定期期间，如果活细胞被计数，其无法确定是否一些细胞濒临死亡和相等数目的细胞正在分裂，或者细胞群体已经仅仅停止生长和分裂。稳定期像延滞期一样不一定是静止阶段。产生次级代谢物诸如抗生素的细菌在生长周期的稳定期期间这样做（次级代谢物定义为在生长活动期之后产生的代谢物）。 [0071] 死亡期在稳定期之后。在死亡期期间，活细胞的数目呈几何（指数）减少，基本上是对数期期间生长的逆转。 [0072] 在一个实例中，在根据本发明的任一方面的方法中的产乙酸菌可以包括细胞的组合：对数期的细胞和稳定期的细胞。在根据本发明任一方面的方法中，对数期的产乙酸细胞可以包括选自下列的生长速率：0.01至2 h-1、0.01至1 h-1、0.05至1 h-1、0.05至2 h-1、0.05至0.5 h-1等。在一个实例中，反应混合物中对数期产乙酸细胞的细胞OD600可以选自由0.001至2、0.01至2、0.1至1、0.1至0.5等组成的范围。本领域技术人员将能够使用本领域已知的任何方法测量OD600并确定反应混合物中和/或将要加到反应混合物中的细胞的生长速率。例如，可以使用Koch (1994)。具体是，可以使用不同方法确定和监测细菌生长。最常见的一种是浊度测量，这依赖于细菌在悬浮液中的光密度（OD），并使用分光光度计。可以使用UV分光计在600nm测量OD。 [0073] 在一个实例中，根据本发明任一方面的方法包括将（i）游离氧，（ii）一批在对数期的产乙酸细胞（，iii）一批在稳定期的产乙酸细胞，（iii）一批克氏梭菌和（iv）包含CO的碳源混合在一起。对数期的产乙酸细胞允许含水培养基中任何其它产乙酸细胞在氧气的存在下产生乙酸和/或乙醇。对数期产乙酸细胞的浓度可以在反应混合物中维持。因此，在反应中时间的任何点，反应混合物都包含对数期的产乙酸细胞和另一生长期例如稳定期的产乙酸细胞。 [0074] 根据本发明任一方面的方法可以进一步包括提取所产生的高级醇的步骤。基于本领域已知的方法，本领域技术人员将知道这样做的手段。 [0076]无附图。 具体实施方式[0078] 实施例 1扬氏梭菌和克氏梭菌在确定成分培养基中在氢气和二氧化碳上的共培养 在此实施例中，扬氏梭菌作为第一生物体在确定成分培养基中自养培养，以便产生乙酸和乙醇。在给定时间后，然后将克氏梭菌作为第二生物体接种在相同反应器中，用于将乙酸和乙醇转化成丁酸和己酸。之后，扬氏梭菌然后将丁酸转化成丁醇。 [0079] 使用确定成分培养基用于两种微生物的共培养，所述培养基由下列组成：2 g/L (NH4)2HPO4、0.2 g/L NaCl、0.15 g/l KCl、1 g/l KOH、0.5 g/L MgCl2 x 6 H2O、0.2 g/L CaCl2 x 2 H2O、15 mg/L FeCl2 x 4 H2O、0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸、0.4 g/L Na2S x 9 H2O、3 mg/L 硼酸、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、1 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.3 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.3 mg/L MnSO4 x H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.1 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.1 mg/L Na2SeO3、106 µg/L 生物素、5 µg/L 叶酸、2.5 µg/L 盐酸吡哆醇、266 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、12.5 µg/L 核黄素、12.5 µg/L 烟酸、413 µg/L 泛酸钙、12.5 µg/L 维生素B12、12.5 µg/L 对氨基苯甲酸、15 µg/L硫辛酸。 [0080] 在250mL确定成分培养基中在500mL血清瓶中进行自养培养，所述血清瓶以1L/h速率用由67% H2和33% CO2组成的合成气连续通气。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以150 min-1的摇动速率连续摇动。通过连续添加KOH（40g/L)的无氧原液将pH保持在pH 5.0-6.5的范围。 [0081] 在实验的开始，用自养生长的细胞以0.1的OD600接种扬氏梭菌。因此，扬氏梭菌在具有500mL复合培养基的1L血清瓶中用由67% H2和33% CO2组成的合成气以3 L/h的速率连续通气下生长在复合培养基中。使用复合培养基，所述培养基由下列组成：1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.8 g/L NaCl、0.1 g/L KH2PO4、20 mg/L CaCl2 x 2 H2O、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸、0.4 g/L Na2S x 9 H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L 生物素、20 µg/L叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L 烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素 B12、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以150 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.67的OD600和pH4.69的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述确定成分培养基中。然后使用此细胞悬浮液接种共培养实验。 [0082] 与之平行，使克氏梭菌异养生长在500mL血清瓶中200mL复合培养基中乙酸和乙醇上。使用复合培养基，所述复合培养基由下列组成：0.25 g/L NH4Cl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.31 g/L K2HPO4、0.23 g/L KH2PO4、2.5 g/L NaHCO3、1 g/L酵母提取物、10 g/L 乙酸钾、20 g/l 乙醇、0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸、1.5 mg/L FeCl2 x 4 H2O、70 µg/L ZnCl2 x 7 H2O、100 µg/L MnCl2 x 4 H2O、6 µg/L硼酸、190 µg/L CoCl2 x 6 H2O、2 µg/L CuCl2 x 6 H2O、24 µg/L NiCl2 x 6 H2O、36 µg/L Na2MoO4 x 2 H2O、3 µg/L Na2SeOO3 x 5 H2O、4 µg/L Na2WO4 x 2 H2O、100 µg/L 维生素B12、80 µg/L 对氨基苯甲酸、20 µg/L 生物素、200 µg/L 烟酸、100 µg/L 泛酸钙、300 µg/L 盐酸吡哆醇、200 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以100 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.81的OD600和pH 5.96的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述确定成分培养基中。在运行实验96小时后，然后使用该细胞悬浮液以0.2的OD600接种共培养实验。 [0083] 在实验期间，取5mL样品用于确定OD600、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR光谱学确定。 [0084] 接种扬氏梭菌后，细胞开始生长并连续产生乙酸。伴随着乙酸的产生，以相比乙酸的产生较低的速率产生乙醇。96小时后，然后将克氏梭菌接种到反应器，在后续的实验中测量到乙醇浓度降低。然后在实验的随后113个小时中测量丁酸（最大1163 mg/L）和己酸（最大136 mg/L）的同时产生。与通过克氏梭菌的丁酸的产生平行，扬氏梭菌将丁酸转化成丁醇至在实验结束时20 mg/L丁醇的最大浓度。 [0085] 实施例 2扬氏梭菌和克氏梭菌在具有含CO气体（25%CO）的复合培养基中的共培养 扬氏梭菌作为第一生物体在复合培养基中自养培养，以便产生乙酸和乙醇。在给定时间后，然后将克氏梭菌作为第二生物体接种在相同反应器中，用于将乙酸和乙醇转化成丁酸和己酸。之后，扬氏梭菌然后将丁酸转化成丁醇和将己酸转化成己醇。 [0086] 使用复合培养基用于两种微生物的共培养，所述培养基由下列组成：1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.8 g/L NaCl、0.1 g/L KH2PO4、20 mg/L CaCl2 x 2 H2O、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸、0.4 g/L Na2S x 9 H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L 生物素、20 µg/L叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L 烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素 B12、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸。 [0087] 在500mL复合培养基中在1mL血清瓶中进行自养培养，所述血清瓶以~3.6 L/h (≥0.5ppm 氧气)速率用由5% H2、25 % CO2、25 % CO和45％ N2组成的合成气连续通气。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以120 min-1的摇动速率连续摇动。在此实验期间，未控制pH。 [0088] 在实验的开始，用自养生长的细胞以0.1的OD600接种扬氏梭菌。因此，扬氏梭菌在具有500mL复合培养基的1L血清瓶中用由67% H2和33% CO2组成的合成气以3 L/h的速率连续通气下生长在上述复合培养基中。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以150 min-1的-1摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min , 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.51的OD600和pH 5.04的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述复合培养基中。然后使用此细胞悬浮液接种共培养实验。 [0089] 与之平行，使克氏梭菌异养生长在500mL血清瓶中200mL复合培养基中乙酸和乙醇上。使用复合培养基，所述复合培养基由下列组成：0.25 g/L NH4Cl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.31 g/L K2HPO4、0.23 g/L KH2PO4、2.5 g/L NaHCO3、1 g/L酵母提取物、10 g/L 乙酸钾、20 g/l 乙醇、0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸、1.5 mg/L FeCl2 x 4 H2O、70 µg/L ZnCl2 x 7 H2O、100 µg/L MnCl2 x 4 H2O、6 µg/L硼酸、190 µg/L CoCl2 x 6 H2O、2 µg/L CuCl2 x 6 H2O、24 µg/L NiCl2 x 6 H2O、36 µg/L Na2MoO4 x 2 H2O、3 µg/L Na2SeOO3 x 5 H2O、4 µg/L Na2WO4 x 2 H2O、100 µg/L 维生素B12、80 µg/L 对氨基苯甲酸、20 µg/L 生物素、200 µg/L 烟酸、100 µg/L 泛酸钙、300 µg/L 盐酸吡哆醇、200 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以100 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.54的OD600和pH 6.60的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述复合培养基中。在运行实验240小时后，然后使用此细胞悬浮液接种共培养实验。 [0090] 在实验期间，取5mL样品用于确定OD600、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR光谱学确定。 [0091] 接种扬氏梭菌后，细胞开始生长并连续产生乙酸和乙醇，在71小时后乙酸到~ 3 g/L的浓度且乙醇到~ 0.5 g/L的浓度。在实验的后续时间过程中，乙酸完全转化成乙醇，在240小时后多至4.8 g/L的浓度。在240小时的过程时间时，然后将克氏梭菌接种入反应器。 因为此生物体除了乙醇还需要乙酸作为底物，与接种克氏梭菌同时，将约3 g/L乙酸（以乙酸钠的形式）无氧加入反应器。在实验的后续时间过程中，测量到丁酸和己酸的产生各自多至1.6 g/L的浓度。与通过克氏梭菌的丁酸和己酸的产生平行，扬氏梭菌将丁酸转化成丁醇至690 mg/L丁醇的最大浓度和将己酸转化成己醇至1478 mg/L己醇的最大浓度。 表2. 实施例2的结果（n.d.=没有检测到）。 [0092] 实施例 3用扬氏梭菌从无氧气的合成气生产乙酸和乙醇 在该实施例中，将扬氏梭菌在复合培养基中用合成气（由H2和CO2组成）在不存在氧气的情况下厌氧培养以产生乙酸和乙醇。对于扬氏梭菌的细胞培养，将2 mL的冷冻培养物(Cryoculture)在具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H2O的200 ml培养基（ATCC1754培养基: pH 6.0、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.1 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.02 g/L CaCl2 × 2H2O、 20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L d-生物素、20 µg/L 叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素B12 、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸、约67.5 mg/L NaOH）中厌氧培养。培养在防火1L玻璃瓶中用由67% H2, 33% CO2 构成的预混合气体混合物化能自养进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有1-3 L/h的熏蒸(fumigation)持续161小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，且固定在反应器中央于充气管处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。 [0093] 对于预培养，将来自扬氏梭菌的生长培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.12的OD600。培养在耐压 500ml玻璃瓶中用由67% H2, 33% CO2 构成的预混合气体混合物进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续65小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。将细胞离心，用10 ml生产缓冲液（pH 6.2; 0.5 g/L的KOH, 用67% H2、33% CO2 的预混气体混合物以1 L/hr通气1小时）洗涤并再次离心。 [0094] 对于生产培养，将来自扬氏梭菌的预培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.2的OD600。培养在耐压500ml玻璃瓶中用由67% H2, 33% CO2 构成的预混合气体混合物进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续118小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。当pH降至低于5.0，加入1 ml 140 g/l KOH溶液。当取样时， 1 移取各5 ml样品用于测定OD600、pH和产物范围。产物浓度的测定通过半定量 H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T (M) SP)用作内部定量标准品。 [0095] 在118小时的培养时期，生产培养物中的细胞密度保持恒定，其可通过稳定的OD600为0.2来识别，对应于μ = 0 hr-1的生长速率。乙酸浓度同时从4 mg/L至3194 mg/L且乙醇浓度从17 mg/L至108 mg/L显著增加。 [0096] 实施例 4用扬氏梭菌从包含CO2和H2与氧气的合成气中不产生乙酸和乙醇 将扬氏梭菌在复合培养基中用合成气和氧气培养。将扬氏梭菌在存在合成气（由H2和CO2组成）且不存在氧气的情况下首先培养以产生乙酸和乙醇。对于培养，细胞生长在耐压玻璃瓶中，所述玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密密封。扬氏梭菌细胞涉及的所有步骤均在厌氧条件下进行。 [0097] 对于扬氏梭菌的细胞培养，将2 mL的冷冻培养物(Cryoculture)在具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H2O的200 ml培养基（ATCC1754培养基: pH 6.0、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.1 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.02 g/L CaCl2 × 2H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、 10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、 0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L d-生物素、20 µg/L 叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素B12 、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸、约67.5 mg/L NaOH）中厌氧培养。培养在防火1L玻璃瓶中用由67% H2、33% CO2 构成的预混合气体混合物化能自养进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有1-3 L/h的熏蒸持续161小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，且固定在反应器中央于充气管处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。 [0098] 对于预培养，将来自扬氏梭菌的生长培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.12的OD600。培养在耐压 500ml玻璃瓶中用由67% H2、33% CO2 构成的预混合气体混合物进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续24小时。随后，气体混合物改变为具有66.85% H2、33% CO2和0.15% O2的组成的气体混合物且细胞以3 L/h进一步充气67小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的Begasungsfritte进行，其放置于反应器中央于喷雾器(sparger)处。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。将细胞离心，用10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。 [0099] 对于生产培养，将来自扬氏梭菌的预培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL ATCC培养基中并生长至0.1的OD600。培养在耐压500ml玻璃瓶中用由66.85% H2、33% CO2 和0.15% O2构成的预混合气体混合物进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的通气持续113小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。当取样时，移取各5 ml样品用于测定OD600、pH和产物范围。产物浓度的测定通过半定量1 H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T (M) SP)用作内部定量标准品。 [0100] 在89小时至113小时的时期中，未显示出可识别的细胞生长。OD600稳定在0.29，对应于生长速率μ = 0 h-1。在该时间过程中乙酸浓度从86.9 mg/L略微增加至89.4 mg/L且乙醇浓度从16.2 mg/L降至11.9 mg / L。 [0101] 实施例 5在包含CO2和氧气的合成气的存在下对数期的扬氏梭菌的培养 扬氏梭菌从直通的气相(feed-through gas phase)给料H2和CO2，并形成乙酸和乙醇。 对于培养，使用耐压玻璃瓶，所述玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密密封。其中扬氏梭菌细胞涉及的所有培养步骤均在厌氧条件下进行。 [0102] 对于扬氏梭菌的细胞培养，将5 mL的冷冻培养物(Cryoculture)在具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H2O的500 ml培养基（ATCC1754培养基: pH 6.0、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.1 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.02 g/L CaCl2 × 2H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、 10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、 0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L d-生物素、20 µg/L 叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素B12 、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸、约67.5 mg/L NaOH）中厌氧培养。培养在防火1L玻璃瓶中用由67% H2、33% CO2 构成的预混合气体混合物化能自养进行，其处于37℃, 100 rpm的开放水浴摇床中且具有3 L/h的熏蒸持续72小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，且固定在反应器中央于充气管处。将细胞离心，用 10 ml ATCC培养基洗涤并再次离心。 [0103] 对于主培养物，将来自扬氏梭菌的生长培养物的许多经洗涤的细胞转移至具有约400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的500 mL ATCC培养基中并生长至0.1的OD600。培养在耐压1L玻璃瓶中用由66.85% H2、33% CO2 和0.15% O2构成的预混合气体混合物进行，其处于37℃, 150 rpm的开放水浴摇床中且具有1 L/h的通气持续45小时。气体进入培养基通过具有10微米孔径的滤器进行，其放置于反应器中央。当取样时，移取各5 ml样品用于测定OD600nm、pH和产物范围。产物浓度的测定通过半定量1 H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T (M) SP)用作内部定量标准品。 [0104] 在培养期过程中，显示显著的细胞生长，其通过OD600 nm从0.10至0.54的增加所证实，对应于生长速率μ = 0.037 h -1。乙酸浓度同时从9.6 mg/L增加至3,304 mg/L且乙醇浓度从2.2 mg/L增加至399 mg/L。 [0105] 实施例 6在包含CO和氧气的合成气（65% CO）的存在下对数期的扬氏梭菌的培养 将扬氏梭菌在复合培养基中与合成气（由CO、H2和CO2组成）在存在氧气的情况下自养培养以产生乙酸和乙醇。 [0106] 使用复合培养基，所述培养基由下列组成：1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.8 g/L NaCl、0.1 g/L KH2PO4、20 mg/L CaCl2 x 2 H2O、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸、0.4 g/L Na2S x 9 H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L 生物素、20 µg/L叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L 烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素 B12、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸。 [0107] 在500mL培养基中在1L血清瓶中进行自养培养，所述血清瓶以3.6L/h速率用由65%CO、4%H2和15% CO2组成的合成气连续通气。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以120 -1min 的摇动速率连续摇动。 [0108] 未控制pH。 [0109] 在实验的开始，用在H2/CO2上自养生长的细胞以0.1的OD600接种扬氏梭菌。因此，扬氏梭菌在具有500mL复合培养基的1L血清瓶中用由67% H2和33% CO2组成的合成气以3 L/h的速率连续通气下生长在复合培养基中。上述培养基也用于此培养。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以150 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.49的OD600和pH5.03的对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述培养基中。然后使用此细胞悬浮液接种培养实验。一氧化碳的气相浓度如下测量：对气相取样并通过具有热导检测器的Agilent Technologies Inc.的气相色谱GC 6890N离线分析。通过来自PreSens Precision Sensing GmbH的微量氧浸入探头测量氧气的气相浓度。通过荧光猝灭测量氧气浓度，而猝灭程度与气相中氧分压关联。在使用的合成气中氧气测量值指示0.1体积%的O2浓度。 [0110] 在实验期间，取5mL样品用于确定OD600、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR光谱学确定。 [0111] 接种扬氏梭菌后，细胞开始以0.062 h-1的生长速率µ生长，且持续生产乙酸直至94.5小时后6.2 g/L的浓度。伴随生产乙酸，乙醇以相比于乙酸生产较低的速率生产直至 94.5小时后1 g/L的浓度。 表3. 实施例6的结果（n.d.=没有检测到）。 [0112] 实施例 7扬氏梭菌在具有氧气的合成气上的生长和乙酸生产 对于氢气和二氧化碳向乙酸的生物转化，同型产乙酸细菌扬氏梭菌在具有氧气的合成气上培养。所有培养步骤在厌氧条件下进行，在可以用丁基橡胶塞气密密封的耐压玻璃瓶中。 [0113] 对于预培养，用5 mL扬氏梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H2O的500 ml培养基（ATCC1754培养基: pH 6.0、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.1 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.02 g/L CaCl2 x 2 H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L d-生物素、20 µg/L 叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素B12 、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸、约67.5 mg/L NaOH）。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37℃、100 rpm下和3 L/h的通气率用具有67% H2、33% CO2 的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 µm的孔径的喷雾器排放至培养基中，所述喷雾器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。 [0114] 预培养后，将细胞悬浮液离心(10 min, 4200 rpm)并将沉淀用10 ml培养基洗涤并再次离心。对于主要培养物，将与需要一样多的来自预培养物的经洗涤的细胞以0.1的OD600nm转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL培养基。化能自养培养在250 mL耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm下和1 L/h的通气率用具有65% H2、33% CO2、2%O2的预混气体在开放水浴摇床中进行47小时。将气体经具有10 µm的孔径的喷雾器排放至培养基中，所述喷雾器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来测定OD600nm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)用作内部定量标准品。还通过氧浸入探头(具有Oxy4Trace的PSt6, Presens, Germany)在线测量培养基中的溶解氧。 [0115] 在培养期过程中，通过OD600nm从0.11增加至0.32观察到细胞生长，其与µ = 0.022 h -1的生长速率相关。乙酸浓度从8 mg/L增加至91 mg/L，没有观察到乙醇浓度的增加。在培养期过程中，溶解氧浓度在0.06-0.15 mg/L之间变化。 [0117] 实施例 8扬氏梭菌在具有氧气的合成气上的生长和乙酸生产 对于氢气和二氧化碳向乙酸的生物转化，同型产乙酸细菌扬氏梭菌在具有氧气的合成气上培养。所有培养步骤在厌氧条件下进行，在可以用丁基橡胶塞气密密封的耐压玻璃瓶中。 [0118] 对于预培养，用5 mL扬氏梭菌的冰冻的冷冻原种接种具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸和400 mg/L Na2S x 9 H2O的500 ml培养基（ATCC1754培养基: pH 6.0、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.1 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.02 g/L CaCl2 x 2 H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L d-生物素、20 µg/L 叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素B12 、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸、约67.5 mg/L NaOH）。化能自养培养在1L耐压玻璃瓶中在37℃、100 rpm下和3 L/h的通气率用具有67% H2、33% CO2 的预混气体在开放水浴摇床中进行72小时。将气体经具有10 µm的孔径的喷雾器排放至培养基中，所述喷雾器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。 [0119] 预培养后，将细胞悬浮液离心(10 min, 4200 rpm)并将沉淀用10 ml培养基洗涤并再次离心。对于主要培养物，将与需要一样多的来自预培养物的经洗涤的细胞以0.1的OD600nm转移至具有额外400 mg/L L-盐酸半胱氨酸的200 mL培养基。化能自养培养在250 mL耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm下和1 L/h的通气率用具有66.85% H2、33% CO2、0.15%O2的预混气体在开放水浴摇床中进行47小时。将气体经具有10 µm的孔径的喷雾器排放至培养基中，所述喷雾器固定在反应器的中央。培养在无pH控制下进行。培养过程中，取若干5 mL样品来测定OD600nm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)用作内部定量标准品。还通过氧浸入探头(具有Oxy4Trace的PSt6, Presens, Germany)在线测量培养基中的溶解氧。 [0120] 在培养期过程中，通过OD600nm从0.10增加至0.45观察到细胞生长，其与µ = 0.032 h -1的生长速率相关。乙酸浓度从7 mg/L增加至2347 mg/L且乙醇浓度从2 mg/L增加至319 mg / L。在整个培养阶段中，溶解氧浓度是0.00 mg/L。 [0121] 在具有相同参数（培养基组成、体积、瓶、气体、通气率、温度、摇动频率）的相似技术设定（但培养基中无细胞）中，测量0.03 mg/L的溶解氧浓度。 [0122] 实施例 9扬氏梭菌和克氏梭菌在复合培养基中用含CO气体（7% CO）共培养 扬氏梭菌作为第一生物体在复合培养基中自养培养，以便产生乙酸和乙醇。在给定时间后，然后将克氏梭菌作为第二生物体接种在相同反应器中，用于将乙酸和乙醇转化成丁酸和己酸。之后，扬氏梭菌然后将丁酸转化成丁醇和将己酸转化成己醇。 [0123] 使用复合培养基用于两种微生物的共培养，所述培养基由下列组成：1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.8 g/L NaCl、0.1 g/L KH2PO4、20 mg/L CaCl2 x 2 H2O、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸、0.4 g/L Na2S x 9 H2O、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L 生物素、20 µg/L叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L 烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素 B12、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸。 [0124] 在500mL复合培养基中在1L血清瓶中进行自养培养，所述血清瓶以~3.6L/h速率用由63 % H2、7 % CO2和2 % CO组成的合成气（≥0.5ppm氧气）连续通气。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以120 min-1的摇动速率连续摇动。在此实验期间，未控制pH。 [0125] 在实验的开始，用自养生长的细胞以0.1的OD600接种扬氏梭菌。因此，扬氏梭菌在具有500mL复合培养基的1L血清瓶中用由67% H2和33% CO2组成的合成气以3 L/h的速率连续通气下生长在上述复合培养基中。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以150 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.89的OD600和pH4.52的稳定期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述复合培养基中。然后使用此细胞悬浮液接种共培养实验。 [0126] 与之平行，使克氏梭菌异养生长在500mL血清瓶中200mL复合培养基中乙酸和乙醇上。使用复合培养基，所述复合培养基由下列组成：0.25 g/L NH4Cl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.31 g/L K2HPO4、0.23 g/L KH2PO4、2.5 g/L NaHCO3、1 g/L酵母提取物、10 g/L 乙酸钾、20 g/l 乙醇、0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸、1.5 mg/L FeCl2 x 4 H2O、70 µg/L ZnCl2 x 7 H2O、100 µg/L MnCl2 x 4 H2O、6 µg/L硼酸、190 µg/L CoCl2 x 6 H2O、2 µg/L CuCl2 x 6 H2O、24 µg/L NiCl2 x 6 H2O、36 µg/L Na2MoO4 x 2 H2O、3 µg/L Na2SeOO3 x 5 H2O、4 µg/L Na2WO4 x 2 H2O、100 µg/L 维生素B12、80 µg/L 对氨基苯甲酸、20 µg/L 生物素、200 µg/L 烟酸、100 µg/L 泛酸钙、300 µg/L 盐酸吡哆醇、200 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以100 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.86的OD600和pH6.01的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述复合培养基中。 在运行实验49小时后，然后使用此细胞悬浮液接种共培养实验。 [0127] 在实验期间，取5mL样品用于确定OD600、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR光谱学确定。 [0128] 接种扬氏梭菌后，细胞开始生长并连续产生乙酸和乙醇，在49小时后乙酸到~ 1.3 g/L的浓度且乙醇到~ 0.8 g/L的浓度。在49小时的过程时间，然后将克氏梭菌接种入反应器。在实验的后续时间过程中，测量到丁酸和己酸的产生各自多至0.6 g/L的浓度。与通过克氏梭菌的丁酸和己酸的产生平行，扬氏梭菌将丁酸转化成丁醇至472 mg/L丁醇的最大浓度和将己酸转化成己醇至630 mg/L己醇的最大浓度。 [0129] 实施例 10产乙醇梭菌和克氏梭菌在复合培养基中用含CO的气体共培养，用于产生高级醇诸如己醇和辛醇（10% CO） 在此实施例中，产乙醇梭菌作为第一生物体在复合培养基中自养培养，以便产生乙酸和乙醇。在给定时间后，将克氏梭菌作为第二生物体接种在相同反应器中，用于将乙酸和乙醇转化成丁酸和己酸。在之后的步骤中，产乙酸梭菌然后将丁酸转化成丁醇和将己酸转化成己醇。也观察到辛醇的产生。 [0130] 使用复合培养基用于两种微生物的共培养，所述培养基由下列组成：1 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.8 g/L NaCl、0.1 g/L KH2PO4、20 mg/L CaCl2 x 2 H2O、20 g/L MES、1 g/L酵母提取物、0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸、20 mg/L 次氮基三乙酸、10 mg/L MnSO4 x H2O、8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O、2 mg/L CoCl2 x 6 H2O、2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O、0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O、0.2 mg/L Na2MoO4 x 2 H2O、0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O、0.2 mg/L Na2SeO4、0.2 mg/L Na2WO4 x 2 H2O、20 µg/L 生物素、20 µg/L叶酸、100 µg/L 盐酸吡哆醇、50 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O、50 µg/L 核黄素、50 µg/L 烟酸、50 µg/L 泛酸钙、1 µg/L 维生素 B12、50 µg/L 对氨基苯甲酸、50 µg/L 硫辛酸。 [0131] 在500mL复合培养基中在1L血清瓶中进行自养培养，所述血清瓶以1.0L/h速率用由60 % H2、30 % CO2和10 % CO组成的合成气连续通气。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在-137℃并以150 min 的摇动速率连续摇动。在此实验期间通过添加无氧KOH调节一次pH。 [0132] 在实验的开始，用自养生长的细胞以0.1的OD600接种产乙醇梭菌。因此，产乙醇梭菌在具有500mL复合培养基的1L血清瓶中用由67% H2和33% CO2组成的合成气以1 L/h的速率连续通气下生长在上述复合培养基中。通过具有10 µm孔径的微泡分散器将气体导入液相。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以150 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.62的OD600和pH 5.15的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL上述复合培养基中。然后使用此细胞悬浮液接种共培养实验。在实验的晚期，从在如上述的相同条件下生长的预培养物中以0.2的OD600再次将产乙醇梭菌接种到运行实验中。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.55的OD600和pH 5.12的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL从运行实验厌氧取出的培养基中。在运行实验 74小时后，然后使用此细胞悬浮液再次将细胞转移到共培养实验。 [0133] 与之平行，使克氏梭菌异养生长在500mL血清瓶中200mL复合培养基中乙酸和乙醇上。使用复合培养基，所述复合培养基由下列组成：0.25 g/L NH4Cl、0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O、0.31 g/L K2HPO4、0.23 g/L KH2PO4、2.5 g/L NaHCO3、1 g/L酵母提取物、10 g/L 乙酸钾、20 g/l 乙醇、0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸、1.5 mg/L FeCl2 x 4 H2O、70 µg/L ZnCl2 x 7 H2O、100 µg/L MnCl2 x 4 H2O、6 µg/L硼酸、190 µg/L CoCl2 x 6 H2O、2 µg/L CuCl2 x 6 H2O、24 µg/L NiCl2 x 6 H2O、36 µg/L Na2MoO4 x 2 H2O、3 µg/L Na2SeOO3 x 5 H2O、4 µg/L Na2WO4 x 2 H2O、100 µg/L 维生素B12、80 µg/L 对氨基苯甲酸、20 µg/L 生物素、200 µg/L 烟酸、100 µg/L 泛酸钙、300 µg/L 盐酸吡哆醇、200 µg/L 盐酸硫胺素 x H2O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放的水浴Innova 3100在37℃并以100 min-1的摇动速率连续摇动。通过厌氧离心（4500 min-1, 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.86的OD600和pH6.01的晚期对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL从运行实验厌氧取出的培养基中。在运行实验23小时后，然后使用此细胞悬浮液将细胞转移到共培养实验。在实验的晚期，从在如上述的相同条件下生长的预培养物中以0.15的OD600再次将克氏梭菌接种-1 到运行实验中。通过厌氧离心（4500 min , 4300 g, 20℃, 10 min）在具有0.38的OD600和pH 6.67的对数期收获细胞。丢弃上清液并将沉淀重新悬浮在10mL从运行实验厌氧取出的培养基中。在运行实验74小时后，然后使用此细胞悬浮液再次将细胞转移到共培养实验。 [0134] 在实验期间，取5mL样品用于确定OD600、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR光谱学确定。 [0135] 接种产乙醇梭菌后，细胞开始生长并产生乙酸到~ 2.2 g/L的浓度至在23小时后~ 0.5 g/L的浓度。在此时间点，将克氏梭菌接种到运行实验，随后产生丁酸和己酸。然后丁酸和己酸被产乙醇梭菌还原成相应的醇。在运行实验69小时后，通过添加无氧KOH使pH从pH4.74增加到pH6.01。之后，将50 mg/L L-盐酸半胱氨酸添加到培养基并且将产乙醇梭菌和克氏梭菌两者的细胞接种到运行实验。培养140小时后，产生650 mg/L 丁醇、220 mg/L己醇和4.5 mg/L辛醇。 [0136] 参考文献 |
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