一种牛篣苷元的制备方法 |
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| 申请号 | CN201610135720.8 | 申请日 | 2016-03-10 | 公开(公告)号 | CN105624258A | 公开(公告)日 | 2016-06-01 |
| 申请人 | 广西大学; | 发明人 | 蒋承建; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 牛 篣 苷元 的制备方法，其包括以下步骤：菌种活化、制备 种子 菌液、利用里氏木霉和泡盛曲霉 发酵 牛蒡子粉、 超 声波 协助提取牛蒡子粗提物、 硅 胶柱层析纯化。本发明以牛蒡子粉为原料采用 生物 发酵技术制备牛蒡子提取物，利用β- 葡萄糖 苷酶和 纤维 素酶高产菌株发酵炮制牛蒡子粉，在体外可控条件下使牛篣苷的糖苷键断裂转化为牛篣苷元，提高了牛蒡子中牛篣苷元的含量，并采用简单有效的提纯方法，能够提取较高纯度的牛篣苷元。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种牛篣苷元的制备方法，其特征在于：本发明采用的发酵菌种为里氏木霉(Trichodermareesei，CICC40932)和泡盛曲霉变种(Aspergillusawamorivar，CICC2203)； |
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| 说明书全文 | 一种牛篣苷元的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及一种牛篣提取物的制备方法，具体涉及一种牛篣苷元的制备方法。 背景技术[0002] 牛蒡子苷元，化学名：(3R,4R)-[(3,4-Dimethoxyphenyl)methy]dihydro-3-[(4-hyd roxy-3-methoxyphenyl)methyl]-2(3H)-furanone，分子式：C21H24O6，分子量：372.41。近来报到，牛蒡子苷元在抗炎，抗病毒，抗肿瘤，免疫调节等方面表现出较强的药理活性；同时可以作为一种新型的热休克反应抑制调节剂，对过高温表现的癌症的治疗有帮助作用。此外还具有抗老年痴呆的作用和抑制K+挛缩的作用。牛蒡苷元是木脂素类化合物，主要来源于菊科植物牛蒡(ArctiumlappaL)的果实牛蒡子。牛蒡子中主要含有牛蒡苷和牛蒡苷元。经验证，牛蒡苷体外在抑菌，抗病毒和抗肿瘤方面活性较弱，牛蒡苷进入体内后，在消化道中被肠道菌转化为苷元的脱甲基化合物，此脱甲基化合物在肝脏儿茶酚-O-甲基转移酶的作用下恢复为苷元，苷元被血液输送到各个器官发挥作用，说明在抗菌抗肿瘤方面，牛蒡苷元发挥主要作用。但是牛蒡子药材中牛蒡苷含量大于5％，而牛蒡苷元的含量较低，仅有0.19％。 [0003] 目前，已有关于牛篣苷元的制备方法的研究，如一种牛蒡子苷元的制备方法，专利号CN101736050A和一种高纯度牛蒡苷元的制备方法，专利号CN103145655A，前者采用牛蒡子药材中自身固有的水解酶将牛蒡苷水解成牛蒡苷元，再经硅胶柱色谱分离，溶剂重结晶法得到牛蒡苷元结晶，后者采用石油醚对牛蒡子脱脂，再用乙酸乙酯渗漉提取，将乙酸乙酯提取物在酸性条件下进行牛篣苷水解为牛蒡苷元，采用溶剂重结晶法和反相高效制备液相色谱法纯化得到牛蒡苷元。第一种方法利用牛膀胱自身的水解酶进行水解，第二种直接在酸性条件下进行水解，两者反应时间慢，水解效率低。 发明内容[0004] 本发明的目的在于，针对现有技术，提供一种牛篣苷元的制备方法。 [0005] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：本发明采用的发酵菌种为里氏木霉(Trichodermareesei，CICC40932)和泡盛曲霉变种(Aspergillus awamorivar，CICC2203)；所述的制备方法包括以下步骤： (1)菌种活化：将处于真空干燥管内并低温保存的菌种冻干粉取出后恢复至室温，转移至超净工作台内，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，取出隔热均匀涂布于PDA平板上，分离培养1～2d，培养温度为28～30℃； (2)制备种子菌液：将活化好的菌株接种于PDA平板上，置于恒温培养箱内在28～30℃下培养5～6d，加入无菌水至平板中晃动，冲下琼脂表面的孢子，过滤，取得孢子悬浮液，计 6 7 算孢子浓度，并配制成孢子浓度为10 ～10个/mL的悬浮液，将孢子悬浮液按1：25的体积比置于Mandel培养液中在28～30℃下培养1～2d即得种子菌液； (3)牛蒡子粉的发酵炮制：将里氏木霉种子菌液和泡盛曲霉变种种子菌液按接种比为 1:1～4，接种量为1～5mL/110mL接种至发酵培养基中，在30℃下发酵培养36～168h，发酵完后向发酵培养基中添加10mol/LNaOH至NaOH的质量分数为2％，终止发酵； (4)牛蒡子粗提物的制备：在100℃下烘干发酵后的培养基并粉碎，将粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，频率为20kHz下超声辐射20min，静置8～12h后过滤并收集滤液为牛蒡子粗提物溶液； (5)纯化：将硅胶，三氯甲烷充分溶胀后，湿法填入色谱柱，将牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上样，洗脱液为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，10:2)，展开剂为氯仿：甲醇(v: v，95:5)，将洗脱液浓缩干燥，将干燥物再次用硅胶柱层析纯化，洗脱液改为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，6:1)，收集洗脱液，干燥结晶。 [0006] 进一步的，所述的Mandel营养液由磷酸二氢钾2g，硫酸铵1.4g，尿素0.3g，硫酸镁0.3g，氯化钙0.3g，硫酸铁5mg，硫酸锰1.56mg，硫酸锌1.4mg，氯化钴0.2mg混合后，添加蒸馏水定容至1L，添加吐温80、蛋白胨、葡萄糖至吐温80的浓度为2ml/L，蛋白胨的浓度为1ml/L，葡萄糖的浓度10ml/L，用硫酸调PH至5.0～6.0，在115℃下灭菌20min制得。 [0007] 进一步的，所述的发酵培养基中含有50～92％的牛蒡子粉，碳源与氮源比为100：2～14，Mandel营养液含量为5～30ml/110ml，发酵培养基的固液比为1:1.5～5，PH为4～10。 [0008] 优选的，牛蒡子粉含量为52％，碳氮比为100:6，Mandel营养液含量为10ml/110ml，发酵培养基的固液比为1:2，PH为5～7。 [0009] 进一步的，所述的发酵培养基中，氮源为蛋白胨、豆粕粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL的一种。 [0010] 优选的，本发明中，发酵培养基的氮源为尿素。 [0011] 进一步的，所述的发酵培养基中碳源为玉米粉、麸皮和蔗糖的一种或几种，具体可为单一碳源、麸皮与玉米粉混合碳源、麸皮与蔗糖混合碳源、蔗糖与玉米粉混合碳源和玉米粉、麸皮、蔗糖的混合碳源。 [0012] 优选的，本发明发酵培养基中，碳源为麸皮：蔗糖：玉米粉为：1：1：1。 [0013] 优选的，本发明中泡盛曲霉变种与里氏木霉的种子菌液接种比为1:2，最佳接种量为2ml/110ml。 [0014] 进一步的，培养时间为36～168h，具体可为36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，但不仅限于此，优选的培养时间144h。 [0015] 进一步的，所述的发酵培养基的制备方法为将牛蒡子粉、氮源、碳源装入锥形瓶中在121℃下灭菌15min，然后加入无菌Mandel营养液和无菌水，在121℃灭菌15min。 [0016] 进一步的，里氏木霉(Trichodermareesei)是多细胞的真核微生物，其可作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，里氏木霉适于蛋白生产，对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素，经过基因工程手术改造的里氏木霉重组菌株安全无害。 [0017] 进一步的，泡盛曲霉变种(Aspergillus awamori var)在CYA培养基中，于25℃培养7天后菌落特征为：菌落直径6.5cm；菌丝体白色，菌落深橄榄褐色；菌落丝绒状，有放射状沟纹；有渗出液；菌落反面土黄色至黄褐色。分生孢子头放射状；分生孢梗茎壁光滑；顶囊球形，直径30-40μm，表面全面可育；产孢结构双层，梗基6-10×2-4μm，瓶梗4-8×2-4μm；分生孢子球形，直径3.5—5.5μm，壁稍粗糙。泡盛曲霉变种主要产糖化酶，果胶酶，不同化亚硝酸盐。 [0018] 本发明的有益效果是：本发明以牛蒡子粉为原料采用生物发酵技术制备牛蒡子提取物，利用β-葡萄糖苷酶和纤维素酶高产菌株发酵炮制牛蒡子粉，在体外可控条件下使牛篣苷的糖苷键断裂转化为牛篣苷元，提高了牛蒡子中牛篣苷元的含量，并采用简单有效的提纯方法，能够提取较高纯度的牛篣苷元，本发明可以最大程度的录用牛蒡子原料，降低浪费率，提高提取率，转化效率高，同时避免了强酸强碱的使用，是一种简便高效的牛篣苷元制备方法。 具体实施方式[0019] 下面结合具体实施例，对本发明进一步的说明。 [0020] 实施例1 [0021] 一种牛篣苷元的制备方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将处于真空干燥管内并低温保存的菌种冻干粉取出后恢复至室温，转移至超净工作台内，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，取出隔热均匀涂布于PDA平板上，分离培养2d，培养温度为30℃；(2)制备种子菌液：将活化好的菌株接种于PDA平板上，置于恒温培养箱内在30℃下培养6d，加入无菌水至平板中晃动，冲下琼脂表面的孢子，过滤，取得孢子悬浮液，计算孢子浓度，并配制成孢子浓度为107个/mL的悬浮液，将孢子悬浮液按1：25的体积比置于Mandel培养液中在30℃下培养2d即得种子菌液； (3)牛蒡子粉的发酵炮制：将里氏木霉种子菌液和泡盛曲霉变种种子菌液按接种比为 1:4，接种量为5mL/110mL接种至含有92％的牛蒡子粉，碳源(玉米粉、麸皮和蔗糖)与氮源(豆粕粉)比为100：14，Mandel营养液含量为30ml/110ml，发酵培养基的固液比为1:5，PH为 10的发酵培养基中，在30℃下发酵培养168h，发酵完后向发酵培养基中添加10mol/LNaOH至NaOH的质量分数为2％，终止发酵； (4)牛蒡子粗提物的制备：在100℃下烘干发酵后的培养基并粉碎，将粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，频率为20kHz下超声辐射20min，静置12h后过滤并收集滤液为牛蒡子粗提物溶液； (5)纯化：将硅胶，三氯甲烷充分溶胀后，湿法填入色谱柱，将牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上样，洗脱液为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，10:2)，展开剂为氯仿：甲醇(v: v，95:5)，将洗脱液浓缩干燥，将干燥物再次用硅胶柱层析纯化，洗脱液改为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，6:1)，收集洗脱液，干燥结晶。 [0022] 实施例2 [0023] 一种牛篣苷元的制备方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将处于真空干燥管内并低温保存的菌种冻干粉取出后恢复至室温，转移至超净工作台内，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，取出隔热均匀涂布于PDA平板上，分离培养1d，培养温度为28℃；(2)制备种子菌液：将活化好的菌株接种于PDA平板上，置于恒温培养箱内在28℃下培养5d，加入无菌水至平板中晃动，冲下琼脂表面的孢子，过滤，取得孢子悬浮液，计算孢子浓度，并配制成孢子浓度为106个/mL的悬浮液，将孢子悬浮液按1：25的体积比置于Mandel培养液中在28℃下培养1d即得种子菌液； (3)牛蒡子粉的发酵炮制：将里氏木霉种子菌液和泡盛曲霉变种种子菌液按接种比为 1:1，接种量为1mL/110mL接种至含有50％的牛蒡子粉，碳源(玉米粉和蔗糖)与氮源(尿素)比为100：2，Mandel营养液含量为5ml/110ml，发酵培养基的固液比为1:1.5，PH为4的发酵培养基中，在30℃下发酵培养36h，发酵完后向发酵培养基中添加10mol/LNaOH至NaOH的质量分数为2％，终止发酵； (4)牛蒡子粗提物的制备：在100℃下烘干发酵后的培养基并粉碎，将粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，频率为20kHz下超声辐射20min，静置8h后过滤并收集滤液为牛蒡子粗提物溶液； (5)纯化：将硅胶，三氯甲烷充分溶胀后，湿法填入色谱柱，将牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上样，洗脱液为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，10:2)，展开剂为氯仿：甲醇(v: v，95:5)，将洗脱液浓缩干燥，将干燥物再次用硅胶柱层析纯化，洗脱液改为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，6:1)，收集洗脱液，干燥结晶。 [0024] 实施例3 [0025] 一种牛篣苷元的制备方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将处于真空干燥管内并低温保存的菌种冻干粉取出后恢复至室温，转移至超净工作台内，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，取出隔热均匀涂布于PDA平板上，分离培养1.5d，培养温度为29℃；(2)制备种子菌液：将活化好的菌株接种于PDA平板上，置于恒温培养箱内在29℃下培养5.5d，加入无菌水至平板中晃动，冲下琼脂表面的孢子，过滤，取得孢子悬浮液，计算孢子浓度，并配制成孢子浓度为107个/mL的悬浮液，将孢子悬浮液按1：25的体积比置于Mandel培养液中在29℃下培养1.5d即得种子菌液； (3)牛蒡子粉的发酵炮制：将里氏木霉种子菌液和泡盛曲霉变种种子菌液按接种比为 1:3，接种量为3mL/110mL接种至含有80％的牛蒡子粉，碳源(玉米粉)与氮源(NH4NO3)比为 100：6，Mandel营养液含量为20ml/110ml，发酵培养基的固液比为1:3，PH为6的发酵培养基中，在30℃下发酵培养72h，发酵完后向发酵培养基中添加10mol/LNaOH至NaOH的质量分数为2％，终止发酵； (4)牛蒡子粗提物的制备：在100℃下烘干发酵后的培养基并粉碎，将粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，频率为20kHz下超声辐射20min，静置10h后过滤并收集滤液为牛蒡子粗提物溶液； (5)纯化：将硅胶，三氯甲烷充分溶胀后，湿法填入色谱柱，将牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上样，洗脱液为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，10:2)，展开剂为氯仿：甲醇(v: v，95:5)，将洗脱液浓缩干燥，将干燥物再次用硅胶柱层析纯化，洗脱液改为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，6:1)，收集洗脱液，干燥结晶。 [0026] 实施例4 [0027] 一种牛篣苷元的制备方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将处于真空干燥管内并低温保存的菌种冻干粉取出后恢复至室温，转移至超净工作台内，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，取出隔热均匀涂布 |
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