[0001] 本发明公开了一种高分散低酰基结冷胶的制备方法，属于低酰基结冷胶领域。

[0002] 结冷胶是一种线型聚阴离子微生物多糖，具有独特的凝胶特性和溶液流变学性质，自发现起即被应用于食品和化妆品中。近年来，随着生物医学学科的发展，天然高分子结冷胶及其水凝胶，在药物传递系统和组织工程材料等领域展现出了广阔的应用前景。结冷胶无毒，具有生物相容性和可生物降解性，所形成的水凝胶透明且稳定性好，并在一定条件下凝胶的力学性质与人体普通组织相近。

[0003] 结冷胶是一种阴离子微生物多糖，具有凝胶形成能力强、透明度高、耐酸耐热性能好等优良特性在食品加工业中，结冷胶不仅可以作为一种优良的胶凝剂使用，而且能够赋予食品令人愉悦的质地和口感；此外，结冷胶还可与其他食品胶配合使用，广泛应用于面点、糖果、调味品等多种食品加工中，使得食品能够获得最佳的感官、质构和稳定性要求。

[0004] 在食品工业中，亲水性胶体的均匀分散是非常重要的，生产中有时候需要大量的搅拌处理以避免由于胶体抱团、结块溶胀导致水合不充分而产生的“鱼眼”。在目前食品工业操作中，要使得低酰基结冷胶有好的分散性，在配方和生产工艺允许的情况下，可以将结冷胶与螯合剂、白糖或其他配料干粉、植物油、丙二醇等先行混合起来，再一并投入到冷水中。这种处理可以将结冷胶细小颗粒分隔开来，达到在水中均匀分散的效果，但有些特殊的食品中不会用到其他配料，这就会显著影响到低酰基结冷胶的分散性能。

[0005] 本发明主要解决的技术问题：针对目前单独溶解在冷水中容易发生抱团，必须通过高速搅拌或干混入其他粉状配料才能改善分散性能，如果配方中不存在其他粉状配料或操作过程中不允许高速搅拌，则产品的低分散性会严重影响到后期的处理，而且结冷胶产率不高、步骤复杂的问题，提供了一种高分散低酰基结冷胶的制备方法，本发明将伊乐藻假单胞菌和短小芽孢杆菌接种到发酵培养基中发酵，将发酵液分离取上清液并脱蛋白，调节pH值后用醋酸纤维素滤膜过滤，将过滤物和壳聚糖混合产生絮凝溶解进行脱酰基处理，最后脱色、喷雾干燥即可得高分散低酰基结冷胶，本发明制得的低酰基结冷胶溶解在冷水中，不会产生抱团，即使不添加配料也可以在冷水中均匀分散，而且结冷胶的凝胶强度达到1200g/cm2以上，透明度达到89%以上，具有广泛的应用前景。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：（1）按重量份数计，取30～40份葡萄糖、15～20份蛋白胨、2～3份玉米浆干粉、18～22份牛肉膏、1.5～2.2份磷酸氢二钾、0.5～1.8份磷酸二氢钾及21～23份质量分数0.5％的氯化钠溶液，混合均匀后，将混合物放在紫外灯下杀菌消毒，得发酵培养基，用质量分数为2％的氨水调节发酵培养基pH至7.0；
（2）取1.0～1.5L上述pH调节完成后的发酵培养基放入3L发酵罐中，按接种量8～10％，将混合菌液放入发酵罐中，温度设定为30～35℃，转速设定为150～170r/min，发酵8～10天，所述的混合菌液为浓度为1.5×108个/mL的伊乐藻假单胞菌菌液和浓度为0.6×108个/mL的短小芽孢杆菌液按体积比1:1混合而成；
（3）待上述发酵结束后收集发酵液，将发酵液放入离心机中，在3000～5000r/min下离心分离5～8min，收集上清液，把上清液放入烧杯中，向烧杯中加入上清液体积30～35％无水乙醇，搅拌均匀；
（4）上述搅拌均匀后，放入水浴锅中，以5℃/min速率对烧杯进行升温，待温度升至35～
45℃时，向烧杯中加入上清液质量2～4％复合蛋白酶，以转速200r/min进行保温搅拌1～
2h，然后再以5℃/min速率继续升温至85～95℃，升温后用质量分数15％的氢氧化钾溶液调节pH为10.5～11.0，保温50～60min；
（5）待上述保温结束后自然冷却至室温，将烧杯中的混合物用醋酸纤维素滤膜进行过滤，收集过滤物放入烧瓶中，向烧瓶中加入过滤物体积2～3倍的无水乙醇，再加入过滤物质量2～3％壳聚糖，搅拌混合均匀，静置直至无絮凝物产生后过滤，收集过滤物；
（6）将上述所得的过滤物放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，收集干燥物放入烧杯中，向烧杯中加入70℃的水，搅拌直至干燥物完全溶解后停止加水，再向烧杯中加入干燥物质量6～8％的200目白土，搅拌30～40min后趁热减压过滤，收集过滤物放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，收集干燥物，即可得到高分散低酰基结冷胶。

[0007] 本发明的应用的方法：称取1～2g本发明制得的结冷胶，分散于250～350mL蒸馏水中，在室温下搅拌至充分溶解，向溶液中分别加入0.4～0.6g氯化钙、7～9g果冻粉，120～140g白砂糖，0.8～1.2g柠檬酸钠，0.1～0.2g香精色素，搅拌后加热到60～80℃下继续搅拌
20～30min，搅拌后冷却至室温，冷却形成凝胶后即可形成果冻，在100～105℃下高温灭菌处理10～15min，即可。

[0008] 本发明的有益效果是：（1）本发明制得的低酰基结冷胶溶解在冷水中时，不会产生抱团，即使不添加配料也可以在冷水中均匀分散；
（2）本发明生成的低酰基结冷胶凝胶强度高，透明度高，而且制备工艺简单，成本低，具有广泛的应用前景。

[0009] 首先按重量份数计，取30～40份葡萄糖、15～20份蛋白胨、2～3份玉米浆干粉、18～22份牛肉膏、1.5～2.2份磷酸氢二钾、0.5～1.8份磷酸二氢钾及21～23份质量分数0.5％的氯化钠溶液，混合均匀后，将混合物放在紫外灯下杀菌消毒，得发酵培养基，用质量分数为2％的氨水调节发酵培养基pH至7.0；取1.0～1.5L上述pH调节完成后的发酵培养基放入3L发酵罐中，按接种量8～10％，将混合菌液放入发酵罐中，温度设定为30～35℃，转速设定为150～170r/min，发酵8～10天，所述的混合菌液为浓度为1.5×108个/mL的伊乐藻假单胞菌菌液和浓度为0.6×108个/mL的短小芽孢杆菌液按体积比1:1混合而成；待发酵结束后收集发酵液，将发酵液放入离心机中，在3000～5000r/min下离心分离5～8min，收集上清液，把上清液放入烧杯中，向烧杯中加入上清液体积30～35％无水乙醇，搅拌均匀；搅拌均匀后，放入水浴锅中，以5℃/min速率对烧杯进行升温，待温度升至35～45℃时，向烧杯中加入上清液质量2～4％复合蛋白酶，以转速200r/min进行保温搅拌1～2h，然后再以5℃/min速率继续升温至85～95℃，升温后用质量分数15％的氢氧化钾溶液调节pH为10.5～11.0，保温50～60min；待保温结束后自然冷却至室温，将烧杯中的混合物用醋酸纤维素滤膜进行过滤，收集过滤物放入烧瓶中，向烧瓶中加入过滤物体积2～3倍的无水乙醇，再加入过滤物质量2～3％壳聚糖，搅拌混合均匀，静置直至无絮凝物产生后过滤，收集过滤物；将所得的过滤物放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，收集干燥物放入烧杯中，向烧杯中加入70℃的水，搅拌直至干燥物完全溶解后停止加水，再向烧杯中加入干燥物质量6～8％的200目白土，搅拌
30～40min后趁热减压过滤，收集过滤物放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，收集干燥物，即可得到高分散低酰基结冷胶。

[0010] 实例1首先按重量份数计，取30份葡萄糖、20份蛋白胨、3份玉米浆干粉、20份牛肉膏、2.2份磷酸氢二钾、1.8份磷酸二氢钾及23份质量分数0.5％的氯化钠溶液，混合均匀后，将混合物放在紫外灯下杀菌消毒，得发酵培养基，用质量分数为2％的氨水调节发酵培养基pH至7.0；取
1.0L上述pH调节完成后的发酵培养基放入3L发酵罐中，按接种量8％，将混合菌液放入发酵罐中，温度设定为30℃，转速设定为150r/min，发酵8天，所述的混合菌液为浓度为1.5×108
8
个/mL的伊乐藻假单胞菌菌液和浓度为0.6×10个/mL的短小芽孢杆菌液按体积比1:1混合而成；待发酵结束后收集发酵液，将发酵液放入离心机中，在3000r/min下离心分离5min，收集上清液，把上清液放入烧杯中，向烧杯中加入上清液体积30％无水乙醇，搅拌均匀；搅拌均匀后，放入水浴锅中，以5℃/min速率对烧杯进行升温，待温度升至35℃时，向烧杯中加入上清液质量2％复合蛋白酶，以转速200r/min进行保温搅拌1h，然后再以5℃/min速率继续升温至85℃，升温后用质量分数15％的氢氧化钾溶液调节pH为10.5，保温50min；待保温结束后自然冷却至室温，将烧杯中的混合物用醋酸纤维素滤膜进行过滤，收集过滤物放入烧瓶中，向烧瓶中加入过滤物体积2倍的无水乙醇，再加入过滤物质量2％壳聚糖，搅拌混合均匀，静置直至无絮凝物产生后过滤，收集过滤物；将所得的过滤物放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，收集干燥物放入烧杯中，向烧杯中加入70℃的水，搅拌直至干燥物完全溶解后停止加水，再向烧杯中加入干燥物质量6％的200目白土，搅拌30min后趁热减压过滤，收集过滤物放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，收集干燥物，即可得到高分散低酰基结冷胶。

[0011] 称取1g本发明制得的结冷胶，分散于250mL蒸馏水中，在室温下搅拌至充分溶解，向溶液中分别加入0.4g氯化钙、7g果冻粉，120g白砂糖，0.8g柠檬酸钠，0.1g香精色素，搅拌后加热到60℃下继续搅拌20min，搅拌后冷却至室温，冷却形成凝胶后即可形成果冻，在100℃下高温灭菌处理10min，即可。

[0012] 实例2首先按重量份数计，取35份葡萄糖、15份蛋白胨、2份玉米浆干粉、22份牛肉膏、1.5份磷酸氢二钾、1.5份磷酸二氢钾及23份质量分数0.5％的氯化钠溶液，混合均匀后，将混合物放在紫外灯下杀菌消毒，得发酵培养基，用质量分数为2％的氨水调节发酵培养基pH至7.0；取
1.3L上述pH调节完成后的发酵培养基放入3L发酵罐中，按接种量9％，将混合菌液放入发酵
8
罐中，温度设定为33℃，转速设定为160r/min，发酵9天，所述的混合菌液为浓度为1.5×10个/mL的伊乐藻假单胞菌菌液和浓度为0.6×108个/mL的短小芽孢杆菌液按体积比1:1混合而成；待发酵结束后收集发酵液，将发酵液放入离心机中，在4000r/min下离心分离6min，收