[0001] 本发明公开了一种食品生物保鲜剂纳他霉素的制备方法，属于纳他霉素制备技术领域。

[0002] 纳他霉素——近白色或奶油黄色结晶粉末，是一种无臭、无味，低剂量且安全性高的食品防腐剂，通常以烯醇式结构存在，它的作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基团结合，阻遏麦角甾醇生物合成，从而使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡。在焙烤食品用纳他霉素对面团进行表面处理，有明显的延长保质期作用。

[0003] 由于纳他霉素能高效、专一性的抑制酵母菌和霉菌并具有良好的理化稳定性以及极低的毒性，因而纳他霉素被用于医疗(外用)、食品、饲料、粮储之中，特别是在食品原料保鲜、食品防腐方面的应用中显示了良好的前景。但目前由于其极高的生产成本，使纳他霉素产品商业化应用受到了极大的限制，仅作为高端防腐剂应用，因为纳他霉素通常条件下不溶于水只溶于一定条件下的有机溶媒，所以它的提取方法不能经济运行，因此开发一种经济可行的纳他霉素提取工艺对于目前来说是非常重要的事情。

[0004] 目前纳他霉素从发酵原液中提炼出来的过程通常包括用有机溶媒如甲醇、异丙醇从浓缩法或板框压滤法得到的菌丝体中浸提出来，随后进行蒸馏，脱去大部分有机溶剂，再经除蛋白杂质、脱色、沉淀等过程将浸提出的纳他霉素提纯为初提物，此种初提取物再用离子交换或其它方法进一步纯化，最后通过结晶，得到纳他霉素晶体。但是该方法生产纳他霉素制剂，生产过程繁杂，周期长，有机溶剂与酸、碱消耗多，且纳他霉素的失活率高，总收得率往往低于70％，甚至低于50％。

[0005] 本发明主要解决的技术问题：针对目前传统方法在提炼纳他霉素过程中，虽可以将菌丝体浸提出来，最终通过蒸馏、脱色、沉淀、纯化等步骤提炼得到纳他霉素，但是该方法生产过程繁杂，周期长，提炼得到的纳他霉素失活率高，收率低，且有机溶剂与酸、碱消耗多，原料浪费极大的现状，提供了一种将猪肉皮发酵后的发酵过滤液作为培养液，通过与胰蛋白陈、酵母、甘露醇以及琼脂混合，形成培养基，随后将褐黄孢链霉菌、多行汉逊氏酵母菌、纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌，接种发酵培养基上，并经过不同浓度的甲醇梯度淋洗，得到菌丝淋洗液，最终将得到的菌丝淋洗液干燥，从而得到食品生物保鲜剂纳他霉素的制备方法。该方法生产过程简单，避免了大量酸碱的使用，且操作过程中基本无废水和废渣排放，符合节能环保的要求，最终制得的纳他霉素收率提高至90％以上，活率达到95％以上。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：（1）取400～600g新鲜猪皮，用刮刀刮去猪皮表面残留的毛根，削去残余碎肉和皮下残余白色油脂，直至皮下毛孔显露，随后将刮好的猪皮用喷火枪再次去除猪毛及杂质后，放入清水中反复搓洗，洗至清水无色为止时倒入菠萝筛中沥干，得到处理后的新鲜猪皮；
（2）将上述处理后的新鲜猪皮放入直径为7mm的孔板绞肉机中，绞碎得猪皮颗粒，倒入
2L的发酵罐中，并向发酵罐中加入猪皮颗粒质量1～2倍的蒸馏水，充分混合均匀，密封发酵罐，在温度为38～58℃，相对湿度为60～65％下发酵3～5天，随后提升温度至40～60℃，相对湿度至62～68％，再次发酵5～7天，待全部发酵结束，将发酵混合物取出，倒入卧式离心机中，在1100～1200r/min的转速下离心处理15～20min，去渣，留液，得发酵液，之后再将得到的发酵液放置紫光灯下灭菌20～25min，得灭菌发酵液；
（3）按重量份数计，选取25～55份上述制得的灭菌发酵液、5～10份胰蛋白陈、15～20份酵母和15～30份甘露醇，充分混合均匀，随后再向混合液中加入10～15份琼脂，放置在电炉上加热至沸腾，直至琼脂粉溶化为止，搅拌形成初步培养基，之后再在形成的培养基中加入去离子水，洗涤至pH值为5.2～5.5后，以5～10℃/min的速率提升温度至95～105℃，灭菌15～25min，得发酵培养基；
（4）按接种比为1∶1∶1∶1，将褐黄孢链霉菌、多行汉逊氏酵母菌、纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌，接种发酵培养基上，在35～38℃下静置培养12～15h；
（5）待培养结束，选用质量浓度为35％的甲醇溶液，每隔2h对培养物进行淋洗，淋洗3～
5次后，再选用质量浓度为38％的甲醇溶液，每隔4h对培养物进行淋洗，淋洗4～6次；
（6）待上述全部淋洗结束，收集淋洗液，在60～75℃条件下干燥至含水量为1～2％，即可得到一种食品生物保鲜剂纳他霉素。

[0007] 本发明的应用方法是：取5～10g本发明制得的纳他霉素加入到喷枪中，并向喷枪中加入200～300mL清水，混合均匀后，均匀喷撒在500～1000g蛋糕、白面包、酥饼等烘焙食品的表面，即可，经过检测，喷涂本发明制得的纳他霉素的烘焙食品比未喷涂过本明纳他霉素的烘焙食品防霉保鲜效果更加理想，使得产品的货架期延长18～25天，且对产品的口感不产生任何影响，适合大规模生产应用。

[0008] 本发明的有益效果是：（1）本发明操作简单易行，原料简单易得，且制备过程中无需特殊设备，属于绿色环保工艺；
（2）本发明避免了大量的酸碱使用，最终制得的纳他霉素收率提高至90％以上，活率达到95％以上，适合大规模生产应用。

[0009] 首先取400～600g新鲜猪皮，用刮刀刮去猪皮表面残留的毛根，削去残余碎肉和皮下残余白色油脂，直至皮下毛孔显露，随后将刮好的猪皮用喷火枪再次去除猪毛及杂质后，放入清水中反复搓洗，洗至清水无色为止时倒入菠萝筛中沥干，得到处理后的新鲜猪皮；然后将上述处理后的新鲜猪皮放入直径为7mm的孔板绞肉机中，绞碎得猪皮颗粒，倒入2L的发酵罐中，并向发酵罐中加入猪皮颗粒质量1～2倍的蒸馏水，充分混合均匀，密封发酵罐，在温度为38～58℃，相对湿度为60～65％下发酵3～5天，随后提升温度至40～60℃，相对湿度至62～68％，再次发酵5～7天，待全部发酵结束，将发酵混合物取出，倒入卧式离心机中，在1100～1200r/min的转速下离心处理15～20min，去渣，留液，得发酵液，之后再将得到的发酵液放置紫光灯下灭菌20～25min，得灭菌发酵液；接下来按重量份数计，选取25～55份上述制得的灭菌发酵液、5～10份胰蛋白陈、15～20份酵母和15～30份甘露醇，充分混合均匀，随后再向混合液中加入10～15份琼脂，放置在电炉上加热至沸腾，直至琼脂粉溶化为止，搅拌形成初步培养基，之后再在形成的培养基中加入去离子水，洗涤至pH值为5.2后，以5℃/min的速率提升温度至95℃，灭菌15min，得发酵培养基；随后按接种比为1∶1∶1∶1，将褐黄孢链霉菌、多行汉逊氏酵母菌、纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌，接种发酵培养基上，在35～
38℃下静置培养12～15h；待培养结束，选用质量浓度为35％的甲醇溶液，每隔2h对培养物进行淋洗，淋洗3～5次后，再选用质量浓度为38％的甲醇溶液，每隔4h对培养物进行淋洗，淋洗4～6次；最后待上述全部淋洗结束，收集淋洗液，在60～75℃条件下干燥至含水量为1～2％，即可得到一种食品生物保鲜剂纳他霉素。

[0010] 实例1首先取400g新鲜猪皮，用刮刀刮去猪皮表面残留的毛根，削去残余碎肉和皮下残余白色油脂，直至皮下毛孔显露，随后将刮好的猪皮用喷火枪再次去除猪毛及杂质后，放入清水中反复搓洗，洗至清水无色为止时倒入菠萝筛中沥干，得到处理后的新鲜猪皮；然后将上述处理后的新鲜猪皮放入直径为7mm的孔板绞肉机中，绞碎得猪皮颗粒，倒入2L的发酵罐中，并向发酵罐中加入猪皮颗粒质量1倍的蒸馏水，充分混合均匀，密封发酵罐，在温度为38℃，相对湿度为60％下发酵3天，随后提升温度至40℃，相对湿度至62％，再次发酵5天，待全部发酵结束，将发酵混合物取出，倒入卧式离心机中，在1100r/min的转速下离心处理15min，去渣，留液，得发酵液，之后再将得到的发酵液放置紫光灯下灭菌20min，得灭菌发酵液；接下来按重量份数计，选取25份上述制得的灭菌发酵液、5份胰蛋白陈、15份酵母和15份甘露醇，充分混合均匀，随后再向混合液中加入10份琼脂，放置在电炉上加热至沸腾，直至琼脂粉溶化为止，搅拌形成初步培养基，之后再在形成的培养基中加入去离子水，洗涤至pH值为
5.2后，以5℃/min的速率提升温度至95℃，灭菌15min，得发酵培养基；随后按接种比为1∶1∶
1∶1，将褐黄孢链霉菌、多行汉逊氏酵母菌、纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌，接种发酵培养基上，在35℃下静置培养12h；待培养结束，选用质量浓度为35％的甲醇溶液，每隔2h对培养物进行淋洗，淋洗3次后，再选用质量浓度为38％的甲醇溶液，每隔4h对培养物进行淋洗，淋洗4次；最后待上述全部淋洗结束，收集淋洗液，在60℃条件下干燥至含水量为1％，即可得到一种食品生物保鲜剂纳他霉素。

[0011] 本实例方法独特新颖，使用时，取5g本发明制得的纳他霉素加入到喷枪中，并向喷枪中加入200mL清水，混合均匀后，均匀喷撒在500g蛋糕、白面包、酥饼等烘焙食品的表面，即可，经过检测，喷涂本发明制得的纳他霉素的烘焙食品比未喷涂过本明纳他霉素的烘焙食品防霉保鲜效果更加理想，使得产品的货架期延长18天，且对产品的口感不产生任何影响，适合大规模生产应用。

[0012] 实例2首先取500g新鲜猪皮，用刮刀刮去猪皮表面残留的毛根，削去残余碎肉和皮下残余白色油脂，直至皮下毛孔显露，随后将刮好的猪皮用喷火枪再次去除猪毛及杂质后，放入清水中反复搓洗，洗至清水无色为止时倒入菠萝筛中沥干，得到处理后的新鲜猪皮；然后将上述处理后的新鲜猪皮放入直径为7mm的孔板绞肉机中，绞碎得猪皮颗粒，倒入2L的发酵罐中，并向发酵罐中加入猪皮颗粒质量1.5倍的蒸馏水，充分混合均匀，密封发酵罐，在温度为45℃，相对湿度为63％下发酵4天，随后提升温度至50℃，相对湿度至65％，再次发酵6天，待全