一种双模板生物催化还原制备石墨烯的方法 |
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| 申请号 | CN201610002712.6 | 申请日 | 2016-01-06 | 公开(公告)号 | CN105463051A | 公开(公告)日 | 2016-04-06 |
| 申请人 | 南华大学; | 发明人 | 彭国文; 肖方竹; 符建文; 谢睿; 余丽梅; 蒲移秋; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种双模板 生物 催化还原制备 石墨 烯的方法。本发方法包括如下步骤：（1）将 硫酸 盐 还原菌D. vulgaris和异化 铁 还原菌S. putrefaciens CN200分别进行活化、培养，离心收集得到对应的菌体；（2）将 氧 化 石墨烯 超声分散，直至完全溶解，形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液；（3）以 硫酸盐 还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200为双模板，并与氧化石墨烯悬浮液充分混合，在弱 碱 性无氧条件下，采用反应条件温和的生物催化还原氧化石墨烯法，制备得到一种性能优异，结构 缺陷 度和无序性较低的品质优良的石墨烯。与传统的方法相比，本发明所采取的方法具有操作简单，安全可靠，反应条件温和，对环境无污染且产品收率高等优点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种双模板生物催化还原制备石墨烯的方法，其特征在于，以硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200为双模板，在弱碱性无氧条件下，采用生物催化还原氧化石墨烯法，制备得到石墨烯； |
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| 说明书全文 | 一种双模板生物催化还原制备石墨烯的方法技术领域背景技术[0002] 石墨烯是一种由碳原子以正六边形组成的蜂窝状单层二维片层状晶体材料，其中碳原子以六元环周期性地紧密堆积排列于石墨烯平面内，而且每个碳原子是通过 键与临近的三个碳原子相连，S，Px和Py三个杂化轨道组成sp2杂化结构，具有120℃的键角，这就赋予石墨烯极高的力学特性。剩余的Pz轨道的 电子在与平面垂直的方向形成 轨道，此电子可以在石墨烯晶体平面内自由移动，从而石墨烯具有良好的导电性。同时，石墨烯中的各个碳原子之间的连接非常柔软，一旦外界施加机械力时碳原子面就弯曲变形，从而使得石墨烯没有必要将其中碳原子重新排列以应对外来机械力的干扰，这就充分体现了石墨烯优良的机械强度和较好的结构稳定性。正是上述优异的物理-化学特性，石墨烯在电子元器件、能源、信息等领域具有广泛的应用前景，也成为当前科研工作者的研究热点。 [0003] 目前，制备石墨烯的方法主要有微机械剥离法、化学气相沉积法、碳化硅表面外延生长法、胶带法和化学还原氧化石墨烯法等。但是这些方法大都条件十分苛刻、难以实现，产品收率低、生产费用昂贵，而且得到产品存在较大的结构缺陷。这就导致了其规模化生产受到严重限制。同时，在目前常用的化学还原氧化石墨烯法中，需要使用一定量的水合阱、硼氢化钠、浓硫酸、浓硝酸、重铬酸钾、高锰酸钾、过氧化氢和硫化氢等化学试剂，这些化学试剂价格昂贵而且具有一定的毒性，容易造成环境污染。因此，研制生态、环保、经济、高效的石墨烯制备新方法具有重要的现实意义。 [0004] 近年来，生物制备法成为一种高效、低成本、环境友好的制备新方法，在功能材料领域引起人们的极大研究兴趣。如利用经过基因改造的蓝藻细菌，通过光合作用高效、廉价地生产出来了具有高结晶度、超细网状结构、高弹性模量和高生物相容性的纳米纤维素。利用含有蔛皮素3-O- -D-吡喃半乳糖苷的盾柱叶子提取液还原制备得到一种对重金属Cu2+选择性吸附能力好的纳米功能材料。利用单种生物或者微生物（如希瓦氏菌、大肠杆菌、节杆菌和枯草芽孢杆菌）还原氧化石墨烯制得石墨烯，但是这些生物或者微生物（如希瓦氏菌和大肠杆菌）很多都有一定的致病性，对人类生存环境存在一定的安全隐患，对生物还原制备石墨烯的扩大化有一定的制约性，而且产品的收率较低。因此，研发安全可靠的非致病性的生物或者微生物还原氧化石墨烯显得十分有价值。本发明为了提高石墨烯的制备收率，特采用非致病性的硫酸盐还原菌和异化铁还原菌作为双模板，生物催化还原制备得到石墨烯。 发明内容[0005] 本发明的目的是解决现有制备石墨烯的过程中存在的成本过高、制备条件苛刻、产品收率低及对环境有毒有害等技术问题。尝试以硫酸盐还原菌和异化铁还原菌为双模板，在弱碱性无氧条件下，采用反应条件温和的生物催化还原氧化石墨烯法，制备得到一种性能优异、结构缺陷度和无序性较低的品质优良的石墨烯。具体步骤如下：（1）菌体的活化、培养 实验所需的硫酸盐还原菌为Desulfovibrio vulgaris（简称D. vulgaris），是一种ζ变形杆菌，严格厌氧。将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD= 1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0006] 实验所需的异化铁还原菌为Shewanella putrefaciens CN200（简称S. putrefaciens CN200），是一种兼性厌氧异化铁还原菌。将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h，待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0007] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0008] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将一定质量的步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入一定质量的步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体的OD600的变化情况。待充分生物催化反应后，形成混合物沉淀。再将沉淀物离心、清洗，并置于真空冷冻干燥箱中干燥，即得到石墨烯。 [0009] 所述步骤（1）中DM培养液的成分包括： 4-羟乙基哌嗪乙磺酸7.2 g，氯化钠10 g，二水氯化钙0.08 g，氯化铵1.0 g，六水氯化镁0.2 g，碳酸氢钠2.5 g，去离子水1000 mL，pH = 7.0。 [0011] 所述步骤（3）中氧化石墨烯悬浮液的质量为2.0 ~ 4.0 g；活化、培养的D. vulgaris菌体质量为5.0 ~ 15 g；活化、培养的S. putrefaciens CN200菌体质量为15 ~ 25 g。 [0013] 所述步骤（3）中沉淀物的离心方法是：离心转速6000 ~ 12000 r/min，离心时间30 ~ 60 min；清洗方法是：依次使用稀盐酸、乙醇和去离子水反复清洗。其中稀盐酸的摩尔浓度为0.3 ~ 0.5 mol/L，乙醇的体积百分比浓度为45 ~ 75%。 [0015] 本发明方法与现有的技术相比，具有以下显著优势：（1）本发明所采用的双模板生物催化还原制备石墨烯的方法，主要是通过硫酸盐还原菌和异化铁还原菌分泌的还原酶及其所产生的电子传递特性，利用电子转移过程实现氧化石墨烯的生物催化还原。该方法反应条件温和，生态、环保，对环境无污染； （2）本发明所制备得到的石墨烯具有优异的特性，显著降低其结构的缺陷和无序性； （3）本发明的方法操作简便、成本低、不需要任何加压等化工设备，加热条件也很容易实现，产品的收率高； （4）本发明所用的硫酸盐还原菌和异化铁还原菌可以直接接种于培养基进行活化、培养，而且耗时短，反应迅速。均为过夜即可活化，反应1.0 h后就有明显现象，10 h 后即可基本反应完全，无需做其他处理、步骤简单。 附图说明 具体实施方式[0017] 下面通过对实施例对本发明进行具体描述，它们只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出一些非本质的改进或调整，均属于本发明保护范围。 [0018] 实施例1：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0019] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0020] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0021] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将2 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入5 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和20 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.5。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物9000 r/min 转速离心60 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.4 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为75%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-80 ℃真空冷冻干燥箱中干燥10 h，即得到石墨烯，其收率为52%。 [0022] 如图1所示，从扫描电镜结果可以，所制备得到的石墨烯表面具有一些褶皱和隆起，但是结构相对规整有序。 [0023] 图2为所制备得到的石墨烯的XRD谱图，石墨烯在2ɵ= 25.70处出现了新的强衍射峰，这归属于石墨烯的（002）晶面，其层间距为0.331 nm。 [0024] 图3为制备得到的石墨烯的Raman谱图，在1355 cm-1和1575 cm-1左右处出现了D峰和G峰2个特征峰， D峰和G峰的形状都是石墨结构有序度的良好指示，但是其强度较氧化石墨烯相比有所下降，这表明硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200双模板生物催化还原制备得到的石墨烯具有较低的缺陷和无序性。 [0025] 实施例2：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0026] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0027] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0028] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将2 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入10 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和20 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.5。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物9000 r/min 转速离心60 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.4 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为75%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-65 ℃真空冷冻干燥箱中干燥11 h，即得到石墨烯，其收率为58%。 [0029] 实施例3：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0030] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0031] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0032] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将2 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入15 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和20 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.5。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物6000 r/min 转速离心45 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.4 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为75%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-50 ℃真空冷冻干燥箱中干燥12 h，即得到石墨烯，其收率为52%。 [0033] 实施例4：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0034] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0035] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0036] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将3 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入10 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和25 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.25。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物6000 r/min 转速离心45 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.5 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为45%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-80 ℃真空冷冻干燥箱中干燥10 h，即得到石墨烯，其收率为47%。 [0037] 实施例5：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0038] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0039] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0040] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将3 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入15 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和25 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.25。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物12000 r/min 转速离心30 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.5 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为45%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-65 ℃真空冷冻干燥箱中干燥11 h，即得到石墨烯，其收率为50%。 [0041] 实施例6：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0042] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0043] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0044] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将3 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入5 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和25 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.25。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物12000 r/min 转速离心30 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.5 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为45%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-50 ℃真空冷冻干燥箱中干燥12 h，即得到石墨烯，其收率为51%。 [0045] 实施例7：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0046] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0047] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0048] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将4 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入15 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和15 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.0。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物12000 r/min 转速离心45 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.3 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为60%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-80 ℃真空冷冻干燥箱中干燥10 h，即得到石墨烯，其收率为53%。 [0049] 实施例8：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0050] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0051] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0052] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将4 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入10 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和15 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.0。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物9000 r/min 转速离心30 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.3 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为60%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-65 ℃真空冷冻干燥箱中干燥11 h，即得到石墨烯，其收率为49%。 [0053] 实施例9：（1）菌体的活化、培养 将真空冷冻保存在实验室的硫酸盐还原菌D. vulgaris 在50 mL海生菌肉汤中于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养5.0 h，然后离心收集菌体，10000 r/min，10 min。使用DM培养液对D. vulgaris菌体进行3次洗涤，再将其移至含20 mL 15 mmol/L乳酸钠的DM培养液中，于无氧条件下30 ℃的恒温振荡培养箱中继续活化培养10 h，最后，取对数生长期的D. vulgaris菌丝体进行重悬，并控制D. vulgaris菌体培养液的OD=1.25，离心收集D. vulgaris菌体，8000 r/min，30 min。 [0054] 将真空冷冻保存在实验室的异化铁还原菌S. putrefaciens CN200菌体移至装有TSB液体培养基中，于30 ℃的恒温振荡培养箱中活化培养10 h。待TSB培养基长满菌丝后，离心收集S. putrefaciens CN200菌体，2000 r/min，10 min。 [0055] （2）氧化石墨烯的预处理称取25 mg氧化石墨烯GO分散在 150 mL的锥形瓶中，加入50 mL去离子水，在250 W的超声波清洗机中，于室温下超声2.0 h直至GO完全溶解，并形成分散性能较好的透明的淡棕色悬浮液。 [0056] （3）双模板生物催化还原氧化石墨烯将4 g步骤（2）中制备的氧化石墨烯悬浮液装于250 mL烧杯中，并将装有50 mL去离子水的杯状半透膜放入烧杯中，随后向半透膜中加入5 g步骤（1）中活化、培养的硫酸盐还原菌D. vulgaris和15 g异化铁还原菌S. putrefaciens CN200，实验前使用N2气吹洗半透膜 30 min以去除溶液中的氧气，再充分混匀，保持反应体系pH值在8.0，在50 ℃恒温水浴箱中反应50 min，随后在无氧条件下30 ℃静置6.0 h，并随时取样，观察反应过程中硫酸盐还原菌D. vulgaris和异化铁还原菌S. putrefaciens CN200混合菌体在600 nm波长处的OD600值为1.0。待充分生物催化反应后，形成均匀分散的混合物。再将混合物6000 r/min 转速离心60 min，等到混合物沉淀。并向其中加入0.3 mol/L稀盐酸30 mL，搅拌均匀后室温静置 0.5 h。以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用体积百分比浓度为60%乙醇溶液清洗后室温静置1.0 h，以8000 r/min转速离心30 min，倾去上清液，使用去离子水清洗至中性为止。将沉淀物置于-50 ℃真空冷冻干燥箱中干燥12 h，即得到石墨烯，其收率为55%。 |
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