[0001] 本申请是申请日为2009年3月6日、发明名称为“酵母菌株及其使用方法”的申请号为200980116345.0的专利申请的分案申请。

[0002] 本发明涉及酵母菌株，特别是用于发酵工艺的酵母菌株。本发明还涉及用本发明所述的酵母菌株单独或结合其他菌株进行发酵的方法。本发明进一步涉及通过筛选多种代谢产物以及使用特定营养源来挑选适于发酵培养物的酵母菌株的方法。

[0003] 本发明的开发主要用于葡萄汁的发酵以及果酒酿制方法，下文会参照本申请进行说明。然而，本发明并不限于该特定的使用领域，也可用于其它发酵工艺。

[0004] 说明书全文对于现有技术的任何讨论，都不应被认为是承认所述现有技术广为人知或构成了本领域公知常识的一部分。

[0005] 发酵是一种工艺，所述工艺中，酵母将水果或蔬菜中的单糖主要代谢为乙醇和二氧化碳。该工艺与很多食品（如面包、啤酒、果酒、烈酒、表面成熟奶酪和醋）以及生物燃料、维生素和酶的生产相关。

[0006] 果酒是部分由酵母对葡萄汁进行酒精发酵制成的产物。发酵工艺中存在的酵母菌株将葡萄汁碳水化合物代谢为乙醇和二氧化碳。然而，这些成分对果酒的整体风味影响甚微。果酒的香气和风味特征来自于大量化合物，包括挥发性酸和羰基化合物，作为在发酵工艺中由酵母生成的化合物，其中有400种已经被鉴定（ 1986）。

[0007] 发酵可自发进行，其中，天然存在的微生物组进行所述发酵；或者，酿酒商也可人为地将已知的、可商购的果酒酵母的大量培养物接种到葡萄汁中。用于接种葡萄汁的酵母主要为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的各种菌株。

[0008] 自发的果酒发酵的起始阶段通常与非酵母菌属（non-Saccharomyces）酵母的生长相关，所述酵母显示出低的发酵能力，且在低乙醇环境下生长旺盛。这些酵母包括有孢汉生酵母（Hanseniaspora）（克勒克酵母属（Kloeckera））和假丝酵母（Candida）（如星形假丝酵母（Candida stellata）和铁红假丝酵母（Candida pulcherrima））（Heard和Fleet，1986）以及其它种的酵母。在自发的情况下，发酵与多种酵母属和酵母种的顺序相互作用（sequential interaction）相关（Heard和Fleet，1988）。

[0009] 非酵母菌属的酵母对乙醇含量超过5%的环境的敏感性意味着它们只能在果酒发酵最初的2-3天内生长，随后，乙醇耐受的酵母菌属的酵母占据优势地位。重要地，由于非酵母菌属的菌株的种群数量能达到106-107个细胞/ml，其能显著影响发酵（Lema等,1996）。所述影响包括由于多种挥发性及非挥发性产物（如有机酸、高级醇和酯）的生成对果酒的风味和香气特征的实质性影响（Rapp和Versini,1991;Esteve-Zarzoso等,1998）。这些“风味化合物”的性质和浓度由发酵中存在的酵母属和酵母种决定（Houtman 等 ,1980;Lambrechts 和 Pretorius,2000;Brandolini 等 ,2002;Ramano等,2003）。考察非酵母菌属的种对果酒风味和香气影响的工作日益增多（Esteve-Zarzoso等,1998）。其中一些工作显示混合种的发酵物（ferment）能够出乎意料地产生高水平的某些风味-活性化合物，如酯类（Garde-Cerdan和Ancin-Azpilicueta,2006;Rojas等,2003）和2,3-丁二醇（Clemente-Jiminez等,2004）等。

[0010] 挥发性硫醇是果酒中发现的一个风味化合物家族（Gachons等,2000），其包括4-巯基-4-甲基-2-戊酮（4MMP）、4-巯基-4-甲基-2-戊醇（4MMPOH）、3-巯基-1-己醇（3MH）和3-巯基己基乙酸酯（3MHA）。其中一些硫醇，如3MH和3MHA，具有独特的类似葡萄柚和西番莲果的香气和风味（Tominaga等,1998a）。

[0011] 常常发现3MH和3MHA以高于人类感觉阈限的浓度存在于白苏维翁（Sauvignon Blanc，SB）酒中。在SB葡萄汁之中，发现了一种结合半胱氨酸的、非挥发性的、无风味的3MH前体，硫-(3-己烯-1-醇)-半胱氨酸，发酵中，该前体可能被切割而释放出3MH，3MH随后转化为3MHA（Gachons等,2000）。处理所述前体所需的酶被认为是来自于酵母，而转化需要活性酵母生长（Tominaga等，1998b）。相关的酶可能分别是β-裂解酶和乙酰转移酶的某种形式。某出版物暗示有多个酵母基因编码的β-裂解酶（Howell等,2005）。然而，两个实验室的科学家，包括本发明人等无法重复其实验结果。迄今为止，我们认为，在酵母释放硫醇时起作用的前体、酶或通路方面还没有强有力的数据发表。

[0012] Chr Hansen（科-汉森）（丹麦）制造了四种可商购的酵母发酵剂（yeast starter culture），所述发酵剂包括不同酵母种的混合物，称为Harmony、Symphony、Rhythm及Melody。所述混合物中的酵母种是酿酒酵母、德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）。已有报道表明这些混合物可制造具有改变的风味概况（profile）的果酒，但其并未暗示所述风味概况与硫醇的存在、混合或浓度相关。

[0013] 目前还没有研究检测非酵母菌属的种对果酒中挥发性硫醇水平的影响或酵母种的混合物对硫醇产量或果酒风味的影响。我们了解仅有一项检测酵母菌属的种对果酒中挥发性硫醇水平影响的研究。所述研究涉及果酒中酿酒酵母生产的4MMP的测定（Howell等2004）。

[0014] 急需了解发酵工艺中控制化合物存在及含量的生物工艺。具体地说，对酿酒商而言，能调节果酒中的硫醇含量及种类十分有用。

[0015] 调节果酒中的硫醇含量，特别是3MH和3MHA的含量，能够带动新工艺的发展，使得酿酒商能够更精确地改变其产品中这些独特的风味化合物的含量。因此，所述工艺将具有重大的商业价值。

[0016] 本发明的一个目的是克服或改善现有技术的至少一个缺陷，或提供一种有用的备选方案。

[0017] 已意外地发现特定酵母菌株具备在发酵工艺中有用的有利性质。具体地说，所述酵母菌株在发酵工艺中可与其它酵母联合产生协同效应，即增加发酵产物中硫醇的产量。更具体地说，所述酵母能用于提高果酒中3MH和3MHA的产量。此外，在发酵工艺中提高硫醇产量的特定新菌株能利用发酵中该种的酵母通常无法利用的氮源和碳源，即脯氨酸。

[0018] 本发明人等意外地发现，如称作PK-KR1及PK-KR2（克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）的两种新菌株）与可商购的酵母菌株协同作用，提高了果酒发酵培养物中挥发性硫醇的水平。在发酵中，酵母可利用的氮含量相对有限，会严重影响发酵进程及酵母生成的副产物。进一步意外地发现，特定酵母菌株能够利用发酵培养物中商业化的酿酒酵母制品所无法利用的营养源。举例来说，相比于酿酒酵母，所述PK-KR1菌株更倾向于利用L-脯氨酸作为氮源和碳源。脯氨酸是葡萄汁中最丰富的氨基酸之一，但酿酒酵母却无法利用。因此，PK-PR1的使用不仅可以出人意料地改变果酒最终的风味和香气，还可以减轻发酵工艺中PK-KR1与商业化的酿酒酵母制品对相对有限的营养素（氮）的竞争。

[0019] 如上所述，本发明涉及酵母菌株、酵母发酵的发酵剂及发酵方法，其使得硫醇产量的提高及新型营养素的利用成为可能。

[0020] 相应地，就第一方面而言，本发明提供了一种分离的酵母菌株，该菌株于2006年8月24日保藏于澳大利亚国家计量院（National Measurement Institute），保藏号为V06/022711或V06/022712或本文定义的其功能等同物。所述分离株的保藏名称对于PK-KR1为JT1.28，对于PK-KR2为JT3.71。

[0021] 就第二方面而言，本发明提供了一种分离的酵母菌株，所述菌株包括核核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer（ITS））1-5.8S-ITS2的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列编号5或序列编号6的任一序列所示。

[0022] 就第三方面而言，本发明提供了一种分离的酵母菌株，所述菌株包括26S rDNA变异区（divergent domain）1和变异区2（D1/D2）的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列编号7或序列编号8所示。

[0023] 就第四方面而言，本发明提供了一种发酵方法，所述方法包括使用所述第一、第二或第三方面中的酵母菌株。

[0024] 本发明的酵母菌株可在发酵工艺中与一种或多种其它酵母菌株一起使用，以协同增加硫醇的产量。

[0025] 就第五方面而言，本发明提供了一种发酵方法，所述方法包括使用第二酵母菌株以及所述第一、第二或第三方面中的第一酵母菌株，其中，所述方法包括下述步骤：将所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株加入发酵培养物中，从而引起由所述方法产生的发酵产物中硫醇产量的协同增加。

[0026] 优选地，所述发酵产物是酒精饮料。更优选地，所述酒精饮料是果酒。最优选地，所述果酒是白葡萄酒。在一个特别优选的实施方式中，所述白葡萄酒由品种为白苏维翁的葡萄制成。

[0027] 优选地，其中一种酵母菌株为非酵母菌属的菌株。更优选地，所述非酵母菌属的菌株属于毕赤酵母属，更优选所述非酵母菌属的菌株是克鲁维毕赤酵母菌种中的成员。在一个特别优选的实施方式中，所述非酵母菌属的酵母菌株保藏于澳大利亚国家计量院，保藏号为V06/022711或V06/022712或其功能等同物。

[0028] 优选地，其中一种酵母菌株为酵母菌属的菌株。更优选地，所述酵母菌属的菌株选自本文所述的、通常可得的VL3、VIN7、X5或“Merit”。

[0029] 本领域技术人员很清楚所述硫醇可以是任意硫醇或任意硫醇的组合。所述硫醇优选为挥发性的。在一个优选的实施方式中，所述硫醇是3-巯基己基乙酸酯（3MHA），在另一个优选的实施方式中，所述硫醇是3-巯基-1-己醇（3MH）。

[0030] 本领域技术人员同样很清楚所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株可以同时或相继加入发酵物中。

[0031] 就第六方面而言，本发明提供了一种发酵酵母发酵剂，所述发酵剂包括使发酵产物中的硫醇协同增加的至少两种酵母菌株。

[0032] 优选地，其中一种酵母菌株是非酵母菌属的菌株。

[0033] 在一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母浓度的比例6 -1
超过10%。优选地，存在于发酵剂中总酵母浓度为2.5×10细胞ml 。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过20%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过30%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过40%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过50%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过60%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过70%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过80%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例约为90%。在另一个实施方式中，所述非酵母菌属的菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过90%。

[0034] 在另一个实施方式中，发酵剂中存在的总酵母浓度超过2.5×106细胞ml-1。优选地，所述非酵母菌属的菌株保藏于澳大利亚国家计量院，保藏号为V06/022711或V06/022712。在一个实施方式中，发酵产物中协同增加的硫醇是3MHA，而在另一个可选择的实施方式中，发酵产物中协同增加的硫醇是3MH。本领域技术人员当然很清楚可以有多于一种硫醇的协同增加。

[0035] 就第七方面而言，本发明提供了一种制备发酵产物的方法，所述方法包括使用本发明的发酵剂，其中，所述方法包括将所述发酵剂加入发酵培养物的步骤。优选地，所述发酵产物为酒精饮料，最优选地，所述酒精饮料是果酒。

[0036] 就第八方面而言，本发明提供了一种依照本发明的方法制备的饮料。优选地，所述饮料是酒精饮料，更优选地，所述饮料是果酒。最优选地，所述果酒是白葡萄酒。在一个特别优选的实施方式中，所述白葡萄酒由品种为白苏维翁的葡萄制成。

[0037] 同样出人意料地发现，新型酵母分离株，例如PK-KR1，能够利用发酵培养物中的新型氮源和碳源。

[0038] 就第九方面而言，本发明提供了一种包括使用酵母菌株的发酵方法，其中，所述方法包括将所述酵母菌株加入发酵培养物中的步骤，所述酵母菌株在发酵条件下能从氨基酸中获得氮和/或碳。优选地，所述氨基酸是脯氨酸。

[0039] 就第十方面而言，本发明提供了一种包括将脯氨酸加入发酵培养物中的步骤的发酵方法，其中，所述脯氨酸在所述发酵培养物中是酵母菌株的氮源和/或碳源。

[0040] 就第十一方面而言，本发明提供了一种包括使用两种酵母菌株的发酵方法，其中，所述方法包括将所述菌株加入发酵培养物中的步骤，所述菌株的每一种均能从不同的来源获得氮和/或碳。

[0041] 就第十二方面而言，本发明提供了一种为发酵培养物挑选酵母的方法，所述方法包括将酵母菌株加入含有作为其几乎唯一氮源的脯氨酸的发酵培养物中以及从所述培养物中分离出能从脯氨酸中获得氮的酵母菌株的步骤。

[0042] 就第十三方面而言，本发明提供了一种包括使用酵母菌株的发酵方法，所述方法包括将所述酵母菌株加入发酵培养物的步骤，其中，所述酵母菌株不以葡萄糖或果糖作为其唯一或几乎唯一的碳源。

[0043] 就第十四方面而言，本发明提供了一种增强发酵产物风味的方法，所述方法包括在发酵培养物中使用如权利要求1所述的酵母菌株或如权利要求11-18中任一项所述的酵母发酵剂，所述方法包括将所述酵母菌株或所述发酵剂加入发酵培养物中的步骤。

[0044] 在本发明的上下文中，只要是术语“其功能等同物”，均涉及本申请所说明或定义的酵母菌株的功能等同物，在一个实施方式中，它指的是所述酵母菌株与至少一种其它酵母菌株相互作用以协同增加发酵产物中硫醇含量的能力，其中，所述“至少一种其它酵母菌株”不是PK-KR1或PK-KR2。在另一个可选实施方式中，术语“其功能等同物”指的是能利用发酵培养物中该种的酵母通常无法利用的氮源和碳源的酵母菌株。

[0045] 在本发明的上下文中，只要是“协同增加”，均涉及发酵产物中硫醇的含量，它指的是由两种酵母菌株产生的发酵产物中硫醇含量的增加，所述硫醇含量大于任一种的酵母菌株单独在发酵产物中产生的硫醇含量的总和。

[0046] 在本发明的上下文中，术语“发酵产物”包括发酵工艺中的任何产物，包括固体、液体或气体产物。

[0047] 在本发明的上下文中，只要是术语“菌株”涉及酵母，它指的是种内潜在的遗传性变体或亚型；例如，从特定地点及时采集的菌种分离株，或确证在核苷酸水平上与同种其他成员不一致的分离株。

[0048] 在本发明的上下文中，术语“发酵”指的是酵母将水果或蔬菜中的单糖主要代谢为乙醇和二氧化碳的工艺。

[0049] 在本发明的上下文中，术语“包含”、“包括”等应解释为其包含的含义，即“包括但不限于”，而不是其排他的含义。附图说明

[0050] 图1：PK-KR1的26S核糖体基因的D1/D2区与模式菌株（type strain）克鲁维毕赤酵母的核苷酸序列同源性比对。

[0051] 上部序列= 克鲁维毕赤酵母模式菌株（CBS188），登录号U75727

[0052] 下部序列=PK-KR1

[0053] 图2：PK-KR1的ITS区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性比对。

[0054] 上部序列= 克鲁维毕赤酵母模式菌株（CBS188），登录号DQ104711

[0055] 下部序列=PK-KR1

[0056] 图3：PK-KR2的26S核糖体基因的D1/D2区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性比对。

[0057] 上部序列= 克鲁维毕赤酵母模式菌株（CBS188），登录号U75727

[0058] 下部序列=PK-KR2

[0059] 图4：PK-KR2的ITS区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性比对。

[0060] 上部序列= 克鲁维毕赤酵母模式菌株（CBS188），登录号DQ104711

[0061] 下部序列=PK-KR2

[0062] 图5：显示含有酵母菌株VL3和PK-KR1的单一发酵物和混合发酵物中产生的3MHA浓度的柱状图，所述酵母菌株VL3和PK-KR1的混合比例为10:90、50:50及90:10。

[0063] 图6：显示含有酵母菌株VL3和PK-KR2的单一发酵物和混合发酵物中产生的3MHA浓度的柱状图，所述酵母菌株VL3和PK-KR2的混合比例为10:90、50:50及90:10。

[0064] 图7：显示含有酵母菌株VL3和PK-KR1的单一发酵物和混合发酵物中产生的3MH浓度的柱状图，所述酵母菌株VL3和PK-KR1的混合比例为10:90、50:50及90:10。

[0065] 图8：显示含有酵母菌株VL3和PK-KR2的单一发酵物和混合发酵物中产生的3MH浓度的柱状图，所述酵母菌株VL3和PK-KR2的混合比例为10:90、50:50及90:10。

[0066] 图9：综合图5及图6中的数据，显示含有酵母菌株VL3、PK-KR1及PK-KR2的单一发酵物和混合发酵物中产生的3MHA浓度的柱状图，组合如下：VL3:PK-KR1、VL3:PK-KR2，组合比例为10:90、50:50及90:10。

[0067] 图10：综合图7及图8中的数据，显示含有酵母菌株VL3、PK-KR1及PK-KR2的单一发酵物和混合发酵物中产生的3MH浓度的柱状图，组合如下：VL3:PK-KR1、VL3:PK-KR2，组合比例为10:90、50:50及90:10。

[0068] 图11：显示PK-KR1及VL3的单一发酵物和混合发酵物中3MHA浓度（采用氘代标准）的柱状图。

[0069] 图12：显示PK-KR1及VL3的单一发酵物和混合发酵物中3MH浓度（采用氘代标准）的柱状图。

[0070] 图13a：显示PK-KR1与多种商业化的果酒菌株VL3、EC1118、VIN7、X5、QA23及SVG的单一发酵物和混合发酵物（发酵温度14℃）中产生的3MHA浓度的柱状图。

[0071] 在14℃下，一组商业化的果酒酵母的单一发酵物以及它们与PK-KR1的共同发酵物产生的3MHA（a）和3MH（b）的含量（平均值±平均值的标准误差；n=3）。所有共同发酵物均在酿酒酵母:PK-KR1为10:90时起始。相比于VL3、VIN7及X5的单一发酵物各自的3MHA水平，PK-KR1与VL3、VIN7及X5的共同发酵物中3MHA的水平均有显著性提高（P<0.01）。

[0072] 图13b：显示PK-KR1与多种商业化的果酒菌株VL3、EC1118、VIN7、X5、QA23及SVG的单一发酵物和混合发酵物（发酵温度14℃）中产生的3MH浓度的柱状图。

[0073] 图14：显示在5升的体积中，PK-KR1、PK-KR2和VIN7的混合发酵物（发酵温度-114℃）中产生的3MHA及3MH浓度的柱状图。3MHA及3MH的水平以ng l 表示；未用相同字母表示的水平在t-检验下具有显著性差异（P>0.05）。

[0074] 在5升的混合发酵物实验中，3MHA及3MH的水平以ng l-1表示；未用相同字母表示的水平在t-检验下具有显著性差异（P>0.05）。

[0075] 图15：通过白苏维翁葡萄汁中VL3及PK-KR1的单一发酵物和共同发酵物的菌落形成单位估定的细胞数。

[0076] 通过在14℃的条件下，VL3及PK-KR1的单一发酵物（分别为实心三角和实心圆）和共同发酵物（分别为空心三角和空心圆）的菌落形成单位估定的细胞数。所述共同发酵物以VL3:PK-KR1=10:90的比例接种。平均值±平均值的标准误差；n=6。

[0077] 图16：单一发酵和混合发酵期间营养素的利用，单一发酵和混合发酵期间，PK-KR1及VL3对（a）酵母可用氮（YAN）的利用；以及（b）葡萄糖和果糖的利用。

[0078] a）在14℃的条件下，VL3单一发酵（实心三角）和共同发酵（空心三角）及PK-KR1单一发酵（实心圆）期间，酵母可用氮（YAN）含量的变化。所述共同发酵在VL3:PK-KR1为10:90时起始。对照：未接种的无菌葡萄汁（空心方块）。平均值±平均值的标准误差；n=3。

[0079] b）在14℃的条件下，VL3单一发酵（实心三角）和共同发酵（空心三角）及PK-KR1单一发酵（实心圆）期间，葡萄糖和果糖总量的变化。所述共同发酵在VL3:PK-KR1为10:90时起始。对照：未接种的无菌葡萄汁（空心方块）。平均值±平均值的标准误差；n=3。

[0080] 图17：发酵条件下，PK-KR1及VL3在含有脯氨酸作为唯一氮源的培养基中的生长。

[0081] 14℃时，在发酵条件下，VL3（三角）及PK-KR1（圆）在合成酵母氮源培养基中的生长，所述培养基中，脯氨酸是唯一的氮源。平均值±平均值的标准误差；n=6。

[0082] 图18：经碳和氮饥饿后，在发酵条件下，PK-KR1在含有脯氨酸作为唯一氮源的培养基中的生长。

[0083] PK-KR1（经碳和氮饥饿）在单独的YNB（即无碳源及氮源补给）和加入有脯氨酸的相同培养基中的生长。

[0084] 本发明涉及酵母菌株，特别是用于发酵工艺的酵母菌株。

[0085] 本发明还涉及酵母菌株PK-KR1和PK-KR2，所述菌株保藏名称分别为JT1.28和JT3.71，保藏于澳大利亚国家计量院（克拉尔克大街51-65,南墨尔本，VIC3205），保藏号分别为V06/022711和V06/022712。

[0086] 例如，产于新西兰南岛马尔堡区的白苏维翁酒具有非常独特的风味概况。这一独特的风格使得该果酒在国际果酒市场上占据重要的地位。相应地，与加强这些果酒的香气和/或风味相关的酵母也极具商业价值。

[0087] 本发明还涉及用酵母菌株单独或结合其他菌株进行发酵的方法。

[0088] 本发明进一步涉及筛选和分离适于发酵培养物的酵母菌株、特别是加强果酒的一种或多种特征（如风味和/或香气）的酵母的方法。

[0089] 优选地，所述筛选方法包括在一种或多种发酵培养物或培养基中接种一种或多种酵母菌株。优选地，所述培养物或培养基含有几乎单一的预先选定的碳源和/或氮源。优选地，所述碳源和/或氮源为脯氨酸。所述方法进一步包括在适合酵母生长的温度下，孵育所述经接种的发酵物或培养物，并在一段时间内监测酵母的生长。所述方法进一步包括鉴定和分离一种或多种能利用几乎单一的预先选定的碳源和/或氮源作为营养源的酵母菌株。

[0090] 通常情况下，对酵母而言，葡萄汁中的氮是有限的必需资源，较低的氮水平会减缓酵母生长及发酵，很可能导致发酵出现问题（如发酵停滞）（Ribereau-Gayon等2006）。对于存在于葡萄汁中的氮源，酵母首先利用的是氨，然后是氨基酸。脯氨酸通常是葡萄汁中最丰富的氨基酸之一（Ough和Stashak1974；Spayd和Andersen-Bagge1996）。然而，酿酒酵母在厌氧条件下无法利用脯氨酸（处于酿酒酵母降解通路的PutI酶需要O2，Ingledew等1987）。在这点上，酿酒酵母在发酵中无法利用重要的氮源，如果酵母可以通过某些方式利用脯氨酸作为氮源和/或碳源，就能够减少发酵中产生的问题，如酿酒商便无需人为添加氮源。此外，从非酵母菌属共同发酵的角度看，不会直接竞争有限的氮源（例如，通过利用脯氨酸）共同发酵的酵母在商业应用中是十分理想的，因为这不仅减少了与酿酒酵母的竞争，同时也释放出隐藏于脯氨酸中的氮以供酿酒酵母随后利用。

[0091] 相应地，本发明进一步涉及能利用发酵培养物中的新型氮源和/或碳源的酵母菌株。

[0092] 本发明进一步由以下非限制性的实施例进行说明。

[0093] 实施例

[0094] 实施例1酵母分离

[0095] 称为PK-KR1和PK-KR2的两种酵母菌株是按照以下记载从奥克兰西区的库妙河果酒公司（Kumeu River Wines）的Mate葡萄园得到的2005霞多丽（Chardonnay）葡萄汁的天然发酵物中分离而得。图5-图18显示了用所述菌株所做实验的实验数据，并在以下详细说明。

[0096] 在发酵工艺的不同时期采集葡萄汁样品，并将其接种至经酸化的麦芽培养基以挑选酵母和抗细菌（Johnson等，2004）。采用本领域众所周知的方案，用Chelex-100螯合树脂从分离的酵母样菌落中提取DNA（Walsh等1991）。采用本领域众所周知的方法，用聚合酶链式反应，使用对真菌特异的引物扩增每种菌株的核核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer（ITS））1、5.8S、ITS2及26S变异区1和变异区2（D1/D2）（White等,1990,Kurtzman和Robnett1998)）。本领域技术人员应当了解通常对所述酵母基因组的这些区域进行分析以在种的水平上鉴定生物（Leaw等2006；White等,1990；Kurtzman和Robnett1998）。具体地，用序列编号1和序列编号2表示的引物扩增核核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer（ITS））1、5.8S及ITS2，用序列编号3和序列编号4表示的引物扩增26S变异区1和变异区2（D1/D2）。用本领域中众所周知的方法对所得DNA产物的两条链都进行测序。酵母PK-KR1和PK-KR2的ITS1-5.8S-ITS2的DNA序列分别表示为序列编号5和序列编号6。酵母PK-KR1和PK-KR2的26S D1/D2的DNA序列分别表示为序列编号7和序列编号8。

[0097] 用标准 BLAST 搜索工具（可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/上获得）对来自所述菌株的ITS1-5.8S-ITS2DNA和26S D1/D2序列进行分析（依照Kurtzman&Fell,(2006)）。相关的序列同源性比对分析如图1-4所示。如下所述，分析表明分离的酵母是克鲁维毕赤酵母的新型菌株。PK-KR1

[0098] PK-KR1ITS区的比对显示出与DQ674358（发酵毕赤酵母（Pichia fermentans））和DQ104711（克鲁维毕赤酵母）具有99%的同一性

[0099] PK-KR126S区的比对显示出与EF564382.1（克鲁维毕赤酵母）具有100%的同一性[0100] 上述指出的PK-KR1序列也与克鲁维毕赤酵母U75727和DQ104711的相应序列进行了比对。比对结果分别如图1和图2所示。

[0101] PK-KR2

[0102] PK-KR2ITS区的比对显示出与AY027508.1/DQ104711.1（发酵毕赤酵母/克鲁维毕赤酵母）具有98%的同一性

[0103] PK-KR226S区的比对显示出与AJ746339.1（克鲁维毕赤酵母）具有99%的同一性[0104] 上述指出的PK-KR2序列也与克鲁维毕赤酵母U75727和DQ104711的相应序列进行了比对。比对结果如图3和图4所示。

[0105] 结论：PK-KR1和PK-KR2是两种不同的新型克鲁维毕赤酵母菌株。

[0106] 鉴定物 最优匹配种

[0107] PK-KR1 克鲁维毕赤酵母

[0108] PK-KR2 克鲁维毕赤酵母

[0109] 实施例2分离的酵母在单一培养物和混合培养物中的微发酵

[0110] 用实施例1中制备的酵母分离株及Zymaflore VL3（Laffort）酵母菌株进行发酵。VL3是一种可商购的酿酒酵母菌株，在波尔多（Bordeaux）分离得到并出售专门用于果酒发酵。

[0111] 用200mL无菌2005白苏维翁葡萄汁（产自马尔堡的拉保拉（Rapaura））进行发酵。-1
首先用DMDC（焦碳酸二甲酯，C4H6O5，MW：134.09gmol ，CAS：4525-33-1）对葡萄汁进行灭菌。

[0112] 如下表1所示，用单一菌株及多种成对比例的菌株进行发酵。对葡萄汁进行接种前，在标准酵母实验室培养基中于28℃对各酵母种进行48h的培养。与果酒产业协定一致，6 -1
以2.5×10酵母细胞mL 的起始浓度对葡萄汁进行接种。所记载的接种以百分比表示，即
6 -1
100%对应于2.5×10酵母细胞mL 。

[0113] 研究了两组独立的发酵物，设计第一组发酵物用于研究混合种发酵物对硫醇浓度的影响。上述发酵物中使用的酵母比例总结于表1中。

[0114] 表1：混合发酵物酵母接种比例（相对于2.5×106细胞ml-1的百分比）[0115]商业化的酵母菌株 接种量 酵母分离株 接种量
VL3 10% PK-KR1 90%
VL3 50% PK-KR1 50%
VL3 90% PK-KR1 10%
VL3 10% PK-KR2 90%
VL3 50% PK-KR2 50%
VL3 90% PK-KR2 10%

[0116] 研究第二组发酵物是为了研究接种量对硫醇最终浓度的影响，同时为了确证关于VL3和PK-KR1混合发酵物初始发酵的结果。酵母接种物的接种量及接种比例如表2和表3所示。

[0117] 表2：接种量（相对于2.5×106细胞ml-1的百分比）

[0118]酵母菌株 接种量
VL3 100%
VL3 50%
VL3 10%
VL3 5%
VL3 1%
VL3 0.5%

[0119]VL3 0.1%
PK-KR1 90%
6 -1

[0120] 表3：混合发酵物酵母接种比例（相对于2.5×10细胞ml 的百分比）

[0121]商业化的酵母菌株 接种量 酵母分离株 接种量
VL3 100% PK-KR1 90%
VL3 50% PK-KR1 90%
VL3 10% PK-KR1 90%
VL3 5% PK-KR1 90%
VL3 1% PK-KR1 90%
VL3 0.5% PK-KR1 90%
VL3 0.1% PK-KR1 90%

[0122] 在25℃下，于带气阀的250mL锥形烧瓶中进行发酵。用重量损失监测发酵进展，这是由于重量损失近似对应于葡萄汁中糖被代谢为乙醇及CO2的程度。经过七天的发酵后，在6000×g下，对烧瓶中的内容物离心10min以使固体沉积。随后将上清转移至70mL样品容器中，保存于-20℃。所有发酵都重复进行三次。

[0123] 硫醇提取及定量

[0124] 基于Tominaga等（Tominaga等,1998c）的方法，对发酵液体（果酒）中的硫醇浓度进行分析，该方法需要根据标准步骤，用色谱法从果酒中分离硫醇，随后用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行分析。该定量方法依赖于与处理前加入到果酒中的已知量的内标物进行比较。

[0125] 从果酒中分离硫醇

[0126] 在每个50mL的果酒样品中，加入5mL1mM的4-(羟基汞)苯甲酸钠（pHMB）、0.5mL2mM0.1M的醋酸钠（pH6）及0.02mM的丁基羟基茴香醚（BHA），将其混合后，加入氘代形式的3MH及3MHA的混合物。然后，将pH值调至7。

[0127] 随后，使样品通过Dowex树脂柱，所有存在的硫醇都结合到柱子的基质上。然后用50mL BHA洗柱子。再用50mL半胱氨酸洗脱缓冲液（0.1M醋酸钠、0.02mM BHA、400mg半胱氨酸-HCl，pH值调为6）对结合的硫醇进行洗脱。

[0128] 用二氯甲烷提取洗脱液中的硫醇。回收下层含硫醇的有机相，然后用无水Na2SO4干燥，随后过滤，并在N2气流中将终体积浓缩至约25μL。

[0129] GC-MS分析

[0130] 将3μL提取物注入带有Agilent5973惰性质量选择性检测器及BP20柱的-1Agilent6890N气相色谱仪。进样器在240℃下、氦载气以1ml min 的流速增量（ramp flow）-1 -1
运行52分钟，然后提高至2.4ml min 运行12分钟。柱温以3℃min 的速率从40℃程序-1
升温至166℃，随后以40℃min 的速率程序升温至270℃。将质谱仪接口温度条件设定为
250℃。

[0131] 在选择性离子监测模式下，用表4所示的离子检测所述硫醇。

[0132] 表4：SIM模式下的化合物及其选择性离子

[0133]化合物 定量离子 定性离子
3-巯基己基乙酸酯(3MHA) 116 101
3MHA-D 118 103
3-巯基-1-己醇(3MH) 134 100
3MH-D 102 136

[0134] 通过将适宜化合物的峰面积与已知浓度的各标准物的峰面积进行比较来完成化合物的定量。

[0135] 结果

[0136] 图5-图14显示了进行的三次重复发酵中3MH及3MHA水平的平均值和平均值的标准误差。所有值都以ng l-1表示。

[0137] 用简单t-检验（单尾）进行计算后，图中的所有P值都表明了所研究的两次处理的硫醇含量相同的可能性。

[0138] 第一组发酵物

[0139] 图5-图10显示了从第一组发酵物中收集的数据，对应于指定菌株的单一100%接种及如表1详细记载的混合发酵酵母接种比例。用苯甲硫醇（benzenemethanthiol）作为内标物，对上述数据进行分析和定量。

[0140] 图5-图8显示了各种菌种中硫醇含量的比较。图9和图10绘制了所有菌种的3MH或3MHA含量，并重绘了图5-图8中的数据。

[0141] 包含PK-KR1的混合发酵物中的3MHA产量

[0142] 图5显示了与仅接种单一菌种的发酵物相比，接种VL3（10%）和PK-KR1（90%）的混合发酵物中3MHA产量显著提高。所述VL3（10%）和PK-KR1（90%）的混合发酵物生产的3MHA量高出接种单一菌种的各自发酵物产生3MHA量的三倍。确定所述3MHA在混合发酵物中产量的提高在统计上是具有显著性的（P=0.005）。

[0143] 图5还显示了在接种量相反（90%的VL3+10%的PK-KR1）的混合发酵物中，3MHA量也有提高，虽不如上述显著，但也具显著性意义（P=0.01）。

[0144] 包含PK-KR2的混合发酵物中的3MHA产量

[0145] 图6显示了相比两种菌种的单一发酵物，所有比例的VL3和PK-KR2混合发酵物中，3MHA的产量都有所提高。

[0146] 包含PK-KR1的混合发酵物中的3MH产量

[0147] 图7显示了相比于仅接种单一菌种的发酵物，接种VL3和PK-KR1的混合发酵物中，3MH的水平都有所提高。

[0148] 包含PK-KR2的混合发酵中的3MH产量

[0149] 图8显示了相比于两种菌种的单一发酵物，所有比例的VL3和PK-KR2混合发酵物中，3MH的产量都有所提高。

[0150] 第一组发酵的结果综述

[0151] 总的来说，相比于单一菌株的发酵物，本发明的酵母菌株和酵母菌属的种的菌株的特定混合发酵物似乎都能提高3MHA和/或3MH的产量。VL3与PK-KR1和PK-KR2的特定混合物提高了3MHA和3MH的产量。

[0152] 第二组发酵物

[0153] 为了确定第一组发酵物中观察到的硫醇水平提高是否是源于在接种物中采用了不同量的VL3，故研究了第二组发酵物，检测VL3单一发酵物及VL3与PK-KR1的混合发酵物中VL3不同含量对硫醇产量的影响。

[0154] 图11和图12显示了第二组发酵物的数据，对应于如表2详细记载的接种量及如表3详细记载的混合发酵物接种比例。采用氘代标准测定上述实验中的硫醇含量。

[0155] 接种不同量VL3的发酵物中的3MHA产量

[0156] 图11显示了尽管VL3的接种量对单一发酵物中的硫醇产量有统计上的显著性影响，但用单因素方差分析（one way ANOVA）（P=0.003）判定后，并没有明显的趋势。其它含量（50%、5%、1%、0.5%和0.1%）的值基本相同，与这些含量的值相比，100%和10%的值有轻微下降。因此，即使VL3接种量对所得3MHA的含量有任何影响，该影响也很小。

[0157] 图11还显示了相比单一接种发酵物，以100:90、50:90及10:90的比例接种VL3和PK-KR1的发酵物中，3MHA的水平有显著性提高。相比于接种100%VL3或0.1%VL3的发酵物中3MHA的产量，用t-检验确定有显著性差异。

[0158] 重要地，相比于单一菌种发酵物，接种特别是具有商业用途的VL3和PK-KR1接种量的混合发酵物显示出3MHA水平的提高。上述数据确证了第一组发酵物的结果。具有商6 -1
业用途的VL3和PK-KR1接种量适用于VL3大于5%（大于0.25×10细胞ml ）的发酵物。

[0159] 接种不同量VL3的发酵物中的3MH产量

[0160] 图12显示了不同的VL3接种量对3MH水平的影响与3MHA的情况相似。尽管接种量具有显著性影响，但用单因素方差分析（P=0.03）判定后，并没有明显的趋势。从100%VL3发酵中得到的3MH水平比其它接种量的3MH水平低，该结果也是相对恒定的。

[0161] 图12还显示了相比于仅接种单一菌种的发酵物，接种VL3和PK-KR1的混合发酵物中3MH的水平没有提高。

[0162] 第二组发酵物的结果综述

[0163] VL3接种量的所有影响都非常小，很可能在分离中对于3MHA和3MH的水平总体上没有影响。

[0164] 结果总结

[0165] 用VL3和两种从库妙河（Kumeu River）分离的克鲁维毕赤酵母菌株的混合物进行的发酵显示了3MHA和/或3MH量的提高，提高的幅度取决于采用的菌种及接种的比例。

[0166] 用于接种发酵物的可商购的果酒酿酒酵母菌株（VL3）的量与组合酵母菌株的发酵物中3MHA和3MH的产量无关。

[0167] 实施例3PK-KR1与一系列可商购的果酒酵母菌株的单一和混合培养物的微发酵[0168] 用实施例1中制备的PK-KR1及一系列可商购的果酒菌株（VL3、VIN7、X5、SVG、QA23及EC118）进行发酵。依照实施例2中详细记载的方案进行发酵，区别在于将发酵温度由25℃改为14℃（该温度处于商业上SB发酵的温度内）。依照实施例2中详细记载的方案进行硫醇提取和定量。

[0169] 图13a显示了相比于单一菌种发酵物，10%VL3和90%PK-KR1、10%VIN7和90%PK-KR1以及10%X5和90%PK-KR1的混合发酵物中3MHA产量提高。附加的实验显示：尽管单独的PK-KR1产生了相当含量的3MHA，发酵物中糖的减少却是最小的，表明所述产物可能没有很让人满意的风味。

[0170] 图13b显示了PK-KR1与一系列可商购的果酒酵母菌株的混合发酵物中3MH的产量没有提高。

[0171] PK-KR1和PK-KR2与VIN7的共同发酵以5升的体积重复4次（n=4）。接种步骤、比例和硫醇分析如上所述，结果如图14所示。方差分析显示该处理（采用的菌株/混合菌株）对3MHA（F=4.02；P=0.02）及3MH（F=4.28；P=0.02）水平均有影响。相比于其它的混合物，只要包括PK-KR1和/或PK-KR2的混合物中，3MH和3MHA水平显著更高（P>0.05）。

[0172] 种群动态

[0173] 为了更好地了解这些PK-KR1的共同发酵物，我们监测了发酵全程中，各个共同发酵物的菌株的频率变化。

[0174] 方法

[0175] 每天在无菌条件下从发酵瓶侧壁（sideport）取1mL样品。以合适的稀释度将样品铺于YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）琼脂板上，30℃孵育24h，然后进行菌落计数（n～200）。对于含PK-KR1的混合物，由于两种酵母的菌落形态都很独特，因而无需选择性培养基来区分，即可在YPD琼脂板上进行区分。

[0176] 为了监测酵母可用氮（YAN）、葡萄糖及果糖的利用，每两天在无菌条件下从发酵中取1mL样品。用两种检测试剂盒来确定YAN的量：1°氨基氮-Bl（Unitech Scientific,California）和氨（Unitech Scientific,California）。两项测试的总和即为YAN的总量。用D-葡萄糖/果糖试剂盒（Unitech Scientific,California）来确定样品中D-葡萄糖和果糖的量。所有检测试剂盒均基于简单的酶促反应，所述酶促反应由UV-分光光度仪进行监测。

[0177] 用合成培养基（synthetic defined medium）进行脯氨酸分析，所述培养基由1.7g/l酵母氮源（不含氮、氨基酸及碳源）（YNB）、200g/l葡萄糖及0.45g/l L-脯氨酸（≥99%；Sigma试剂P0380）组成，所述脯氨酸的量与典型的葡萄汁中测得的量类似。按
6
2.5×10酵母细胞/ml的量接种该培养基，在14℃下，用带气阀的容器以100rpm的摇速使样品进行发酵。按照下述改善的方式重复上述实验：将酵母细胞置于限制性培养基中48h，使其经受碳及氮饥饿，确保细胞内储存的碳和氮被耗尽；用可在培养基中升华的固体CO2（干冰）清除烧瓶中过量的O2；还进行了不在YNB中加入葡萄糖或脯氨酸的处理。

[0178] 结果

[0179] 发酵物中营养素的利用

[0180] 种群动态实验的结果如图15所示，显示共同发酵物中的PK-KR1存留下来，并达到了很高的种群数量。鉴于已知氮是果汁中一种有限的必需资源，我们探索了监测单一发酵物和共同发酵物中营养素的变化，以查明哪些菌种在什么时候利用哪些资源。正如所预料的那样，在VL3单一发酵物中，YAN在发酵开始的四天内减少（图16a），而由于葡萄糖/果糖含量被利用，在整个发酵过程中都减少（图16b）。含PK-KR1的共同发酵物显示了对YAN及葡萄糖/果糖的利用存在两天的迟滞。有趣的是，VL3单独存在时利用的YAN和葡萄糖/果糖在共同发酵物中似乎并不都会被利用。然而，在PK-KR1单一发酵物中观察到一个有趣的7
结果。尽管PK-KR1达到了如此高的种群数量（3.5×10cfu/ml），这些数据显示葡萄汁中的主要氮源和碳源并未利用。仅消耗了16%的YAN和11%的葡萄糖/果糖，而PK-KR1却达到了很高的存活种群数量。

[0181] 营养源

[0182] 酿酒酵母在厌氧条件下无法利用脯氨酸（处于酿酒酵母降解通路的PutI酶需要O2，Ingledew等1987），且用于一级氨基氮的检测试剂盒无法检测脯氨酸。然而，脯氨酸是葡萄中最丰富的氨基酸之一（Ough和Stashak1974;Spayd和Andersen-Bagge1996）。为了验证PK-KR1可在发酵条件下利用脯氨酸的假设，我们在含脯氨酸作为唯一氮源的合成培养基中对VL3和PK-KR1进行发酵。图17显示了上述发酵物中的种群动态。出乎意料地，PK-KR1显示出与之前在葡萄汁中进行的实验相同的生长速率，并达到了类似的种群数量7 7
（3.5×10cfu/ml及2.48×10cfu/ml）。形成鲜明对比的是，在整个发酵中，VL3种群数量显著降低，甚至无法达到两次种群倍增（two population doublings）。上述数据与之前关于酿酒酵母无法在厌氧条件下利用脯氨酸的报道一致（Ingledew等1987）。

[0183] 鉴于仅有PK-KR1存在时，葡萄汁中葡萄糖和果糖的量几乎没有变化，然而却达到了很高的种群数量，我们推测该生物可同化其它可能供选择的碳源。我们进行了第二个营养素利用实验。这里，我们使细胞饥饿以耗尽它们储存的碳和氮，然后将PK-KR1的复制培养物加入到相同的YNB合成培养基（有脯氨酸或无脯氨酸）中。这次，为了确保接种后氧气量尽可能少，加入了少许固体CO2（干冰），它的升华可清除烧瓶中的空气。将其在28℃孵育8天，经样品抽出（大气中的空气不让进入）进行种群数量检测，估算每毫升的菌落形成单位数。上述数据如图18所示。由于没有氮源或碳源，预期PK-KR1在单独的YNB中不会6 -1
生长；然而，在培养基中加入脯氨酸，使得第四天时种群从起始接种的1.5×10ml 增长到
7 -1
2.2×10ml 。这大约是种群数量的14倍。推论是，生物质的增加通过脯氨酸的同化而实现，其既可作为能量源来进行分解代谢的活动（碳源），又可作为氮源来进行合成代谢的生物质构建。

[0184] 尽管以上说明的本发明的实施方式是采用特定酵母菌株及酿酒商发酵工艺完成，本领域技术人员应当了解本发明可采用其他多种形式完成。

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