一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法

本发明涉及一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，而该产物能够作为合成L-抗坏血酸的中间体，还涉及到用于该生产方法的拟葡糖酸杆菌（Pseudogluconobacter）属菌株。

可作为合成L-抗坏血酸的中间体的2-酮基-L-古洛糖酸在此以前已采用Reichvtein所建立的方法进行过商业生产〔Helvetica    Chimica    Acta    17，311（1934）〕。然而，这种方法包括许多步骤，需要大量的溶剂，因此，它作为一个现代技术是不能令人满意的。作为其替代方法，已经有几种主要利用微生物的方法被提出。例如，方法之一包括利用一种微生物将葡萄糖氧化成5-酮基-D-葡糖酸，再利用化学的或微生物学的方法将其还原为L-艾杜糖酸，然后利用微生物学的方法进一步将其氧化成2-酮基-L-古洛糖酸[美国专利号2，421，611]。另一已知方法包括利用一种微生物将葡萄糖氧化成2，5-二酮基-葡糖酸，然后通过微生物学的或化学的方法将其转变成2-酮基-L-古洛糖酸[日本专利公布号39-14493，53-25033，56-15877和59-35920]。

但是，这些已知方法中的化学还原步骤（即前一方法中的5-酮基-D-葡糖酸还原为L-艾杜糖酸以及后一方法中的2，5-二酮基-D-葡糖酸还原为2-酮基-L-古洛糖酸）在立体专一性（Stereo-specibicity）方面具有缺点，因此，前一方法中 的副产物D-葡糖酸以及后一方法中的副产物2-酮基-D-葡糖酸的产生导致所需化合物的产量减少。而且，即使利用微生物使上面的还原得以进行，整个产物的产量也要下降，因为必须供给微生物以过量的葡萄糖（起始物）作为还原作用的能源。而在这方面，利用L-山梨糖作为起始物生产2-酮基-L-古洛糖酸仅仅包括一个氧化步骤。实际上，人们按照这一方向业已试图利用属于葡糖酸杆菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，无色杆菌属以及产碱菌属的细菌。其参考文献包括：《生物技术与生物工程》，14卷，799页（1972），Acta    Microbvologica    Sinica，20，246（1980）和21，185（1981），日本专利公布号41-159和41-160，美国专利号3，043，749和日本专利公布号49-39838。

但是，利用在文献中提到过的菌株获得的结果实际上是不令人满意的且生产量太低而不能保证它们的商业开发。

在这种情况下，本发明人极力寻找一种适用于商业生产的生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，且发现从土壤样品中分离出的一种细菌株K591s（储存在和歌山县）以及另一些从土壤样品中分离出的细菌株12-5，12-15，12-4和22-3（储存在滋贺县）能够以比原来高得多的产量将L-山梨糖转变为2-酮基-L-古洛糖酸。而且，通过分类学研究，本发明人发现这些都是在文献中没有提到过的新细菌。在上述发现的基础上，本发明有进一步的发展。

这样，本发明涉及：（1）一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，包括将一种能够使L-山梨糖氧化成2-酮基-L-古洛糖酸的拟葡糖酸杆菌属的细菌（可以直接用这种细菌或者细菌先经过处理）与 L-山梨糖接触，以产生和积累2-酮基-L-古洛糖酸，然后收集它;（2）一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，包括在至少一种下列微生物存在的条件下将一种拟葡糖酸杆菌属的微生物（能够将L-山梨糖氧化成2-酮基-L-古洛糖酸）与L-山梨糖接触，这些微生物属于芽孢杆菌属，假单胞菌属，变形菌属，柠檬酸细菌属，肠杆菌属，欧文氏菌属，黄单胞菌属，黄杆菌属，微球菌属，或埃希氏菌属;（3）产酮糖拟葡糖酸杆菌（Pseudogluconobactersaccharoketogenes），它是需氧的且在辅酶A存在的条件下生长。

上面提到的五种细菌株中，菌株K591s和12-5具有下列分类学特征。

（a）形态学特征

（1）杆状，其大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米

（2）无细胞多形态性

（3）靠2至4根极生鞭毛游动

（4）不形成孢子

（5）革兰氏阴性

（6）不抗酸

（b）培养特征

（1）营养琼脂平皿：基本上不生长

酵母浸出物营养琼脂：圆形，边缘整齐、表面光滑，呈乳光。

（2）酵母浸出物营养琼脂斜面：适度生长且是线状的，光滑，乳光。

（3）酵母浸出物营养液体培养：适度生长，整个培养基均匀混浊。

（4）营养白明胶穿刺：表面稀疏生长，白明胶未液化。

（5）石蕊牛乳：酸化且凝固。

（c）生理学特征

（1）硝酸盐还原：弱但阳性

（2）反硝化作用：阴性

（3）甲基红（MR）试验：阳性

（4）伏-普（VP）试验：阴性

（5）吲哚：不产生

（6）硫化氢：不产生

（7）淀粉：不水解

（8）柠檬酸：不被利用

（9）铵盐：利用

（10）色素：不产生

（11）脲酶：产生

（12）氧化酶：阳性

（13）过氧化氢酶：阳性

（14）生长的温度范围：16-36℃;最适生长温度范围：24-34℃。宜于生长的pH值范围：5.5-8.7;最适pH范围：6.0-7.5。

（15）需氧的

（16）Hugh-Leibson的OF试验：氧化

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，D-甘露醇和甘油产酸但不产气。从D-山梨醇，肌醇或淀粉既不产酸也不产气。

（d）其它特征

（1）从乙醇产生微弱的乙酸

（2）生物素，硫胺素，核黄素和辅酶A（COA）是生长所需要的

（3）从甘油产生二羟丙酮

（4）DNA中的G·C含量：67±1摩尔%

（5）存在含有十个异戊二烯单位的辅酶Q（COQ10）

（6）从L-山梨糖大量产生2-酮基-L-古洛糖酸

（7）链霉素抗性

12-15菌株的分类学特征描述如下：

（a）形态

（1）杆状;细胞大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米

（2）无细胞多形态性

（3）靠2至4根极生鞭毛游动

（4）不形成孢子

（5）革兰氏阴性

（6）不抗酸

（b）培养特征

（1）营养琼脂平皿：基本上不产生。

酵母浸出液营养琼脂平皿：圆形，边缘整齐，光滑且呈乳光，

（2）酵母浸出液营养琼脂斜面：适度生长且为线形，光滑，呈乳光。

（3）酵母浸出物营养液体培养：适度生长，整个培养基均匀混浊。

（4）营养白明胶穿刺：仅在顶部稀疏生长。白明胶未被液化。

（5）石蕊牛乳：酸化但不凝固

（c）生理特征

（1）硝酸盐还原：阴性

（2）反硝化作用：阴性

（3）甲基红（MR）试验：阳性

（4）伏一普（VP）试验：阴性

（5）吲哚：不产生

（6）硫化氢：不产生

（7）淀粉：不水解

（8）柠檬酸：不利用

（9）铵盐：利用

（10）无色素产生

（11）脲酶：产生

（12）氧化酶：阳性

（13）过氧化氢酶：阳性

（14）在23-32℃下生长，最适为28-32℃，生长的pH范围：pH6.0-7.5;最适pH 范围：6.5-7.1。

（15）需氧的

（16）Hugh-Leibson的OF试验：氧化

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，和甘油产酸但不产气。从D-甘露醇，D-山梨醇，肌醇和淀粉既不产酸也不产气。

（d）其它特征

（1）从乙醇微弱产生乙酸

（2）生物素，硫胺素，核黄素和辅酶A（COA）是生长所需的

（3）从甘油产生二羟丙酮

（4）DNA中的GC含量：67±1摩尔%

（5）存在含有十个异戊二烯单位的辅酶Q（COQ）

（6）从L-山梨糖大量产生2-酮基-L-古洛糖酸

（7）链霉素抗性

12-4菌株的分类学特征描述如下：

（a）形态学特征

（1）杆状，每个细胞的大小为：0.3～0.5×0.7～1.4微米

（2）无细胞多形态性

（3）靠2至4根极生鞭毛游动

（4）不形成孢子

（5）革兰氏阴性

（6）不抗酸

（b）培养特征

（1）营养琼脂平皿：菌落微小，无法进行细微的观察。酵母浸出物肉汤琼脂：圆形，边缘整齐，光滑，呈乳光。

（2）酵母浸出液营养琼脂斜面：适度生长且为线形。光滑，呈乳光。

（3）酵母浸出液营养液体培养：适度生长;整个培养基混浊均匀。

（4）营养白明胶穿刺：仅在顶部稀疏生长。白明胶未被液化。

（5）石蕊牛乳：酸化但不凝固。

（c）生理特征

（1）硝酸盐还原：阴性

（2）反硝化作用：阴性

（3）用基红（MR）试验：阳性

（4）伏一普（VP）试验：阴性

（5）吲哚：不产生

（6）硫化氢：产生

（7）淀粉：不水解

（8）柠檬酸：不利用

（9）铵盐：利用

（10）不产生色素

（11）脲酶：产生

（12）氧化酶：阳性

（13）过氧化氢酶：阳性

（14）在16-36℃时生长，最适为24-34℃。生长的pH范围：5.5-8.2;最适pH范围：6.0-7.5

（15）需氧的

（16）Hugh-Leifson的OF试验：氧化

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖糖，乳糖，海藻糖，和甘油产酸但不产气。从D-甘露醇，D-山梨醇，肌醇和淀粉既不产酸也不产气。

（d）其它特征

（1）从乙醇微弱产生乙酸

（2）生物素，硫铵素，核黄素以及CoA或泛酸是生长所需要的。

（3）从甘油产生二羟基丙酮

（4）DNA的GC含量为：67±1摩尔%

（5）存在一种含有十个异戊二烯单位的辅酶Q（CoQ10）

（6）从L-山梨糖大量产生2-酮基-L-古洛糖酸

（7）链霉素抗性

22-3菌株的分类特征描述如下：

（a）形态学特征

（1）杆状，测得每个细胞的大小为0.3～0.5×0.7～1.4微米。

（2）无细胞多形态性

（3）靠2至4根极生鞭毛游动

（4）不形成孢子

（5）革兰氏阴性

（6）不抗酸

（b）培养特征

（1）营养琼脂平皿：菌落细小，无法进行细微观察。酵母浸出物营养琼脂：圆形，边缘整齐，光滑，呈乳光。

（2）酵母浸出液营养琼脂斜面：适度生长且为线形，光滑，呈乳光。

（3）酵母浸出液营养液体培养：适度生长，整个培养基均匀混浊。

（4）营养白明胶穿刺：仅在顶端稀疏生长。白明胶未被液化。

（5）石蕊牛乳：酸化但不凝固。

（c）生理特征

（1）硝酸盐还原：阳性（弱）

（2）反硝化作用：阴性

（3）甲基红（MR）试验：阳性

（4）伏-普（VP）试验：阴性

（5）吲哚：不产生

（6）硫化氢：不产生

（7）淀粉：不水解

（8）柠檬酸：不被利用

（9）铵盐：被利用

（10）无色素产生

（11）脲酶：产生

（12）氧化酶：阳性

（13）过氧化氢酶：阳性

（14）在16-38℃下生长，最适为24-34℃。生长的pH值范围：5.5～8.9;最适pH范围：6.0～7.8。

（15）需氧的

（16）Hugh-Leifson的OF试验：氧化

（17）从L-阿拉伯糖，D-木糖，D-葡萄糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，海藻糖以及甘油产酸但不产气。从D-甘露醇，D-山梨醇，肌醇及淀粉既不产酸也不产气。

（d）其它特征

（1）从乙醇微弱产生乙酸

（2）生物素，硫铵素，核黄素及CoA或泛酸是生长所需的。

（3）从甘油产生二羟基丙酮

（4）DNA的GC含量：67±1摩尔%

（5）存在含有十个异戊二烯单位的辅酶Q（CoQ10）

（6）从山梨糖强力产生2-酮基-L-古洛糖酸

（7）链霉素抗性

从土壤中得到的这五个菌株的上述分类学特征参照《伯捷氏鉴定细菌学手册》第八版（1974）和《伯捷氏系统细菌学手册》第一 卷（1984）而予以检查。如上的检查表明K591s，12-5，12-15，12-4和22-3菌株只是暂时分类于假单胞菌属，这主要是根据它们是革兰氏阴性的带有极生鞭毛的游动杆状细菌。且发现它们需要某些生长因素，DNA的GC含量是67±1摩尔%，醌系统是一带有十个异戊二烯单位的辅酶Q，它们类似于属于假单胞菌属的第四部分的第四RNA群的缺陷假单胞菌和泡囊假单胞菌。但是，从乙醇微弱产生乙酸和从甘油产生二羟基丙酮是它们又不同于假单胞菌属的细菌株的特征。

上述特征也是葡糖酸杆菌属的种的特征。但是，由于这五株细菌对氧化酶试验是阳性，不能在pH4.5的条件下生长，而在不含糖的蛋白胨酵母浸出液培养基或酵母浸出液营养培养基上却能良好生长，DNA的GC含量是67±1摩尔%，所以它们也不同于葡糖酸杆菌属的细菌种系。

因此，这五株细菌K591s，12-5，12-15，12-4和22-3，不能划入任何已知属中，不得不考虑它们是一新属中的细菌新种。据此，菌株K591s，12-5，12-15，12-4和22-3总称为产酮糖拟葡糖酸杆菌。

至于这五株细菌的营养需要方面，K591s，12-5，和12-15具有生长需要CoA的独特特征。这五株菌对CoA的需要不能用泛酸代替。另一方面，12-4和22-3能够在泛酸存在的条件下生长，如同在CoA存在的条件下一样。

在下面的描述中，这些产酮糖拟葡糖酸杆菌有时被称作氧化菌株。

本发明中能够使用的菌株不仅包括上面所述的五株，而且还包括从这五株得到的突变株在内的其它菌株，突变是采用紫外线或X-射 线辐射处理，或是用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（亚硝基胍），甲基甲烷磺酸盐（methylmethanesulfonate），氮芥（nithrogen    mustard）等等一类化学诱变剂处理。例如TH14-86突变菌株就是通过用亚硝基胍处理产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s而得到的。该突变菌株除了从L-山梨糖产生2-酮基-L-古洛糖酸的能力增强外，其它均显示出K591s的分类特征。

上面提到的产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s，12-5和TH14-86于1985年9月19日储存在大阪发酵研究所（IFO），产酮糖拟葡糖酸杆菌12-15，12-4和22-3于1985年12月16日储存。

此外，产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s，12-5和TH14-86于1985年10月7日储存在通产省工业科学技术厅发酵研究所（FRI），产酮糖拟葡糖酸杆菌12-15，12-4和22-3则于1985年12月20日储存于该处。

该储存物于1986年8月9日开始成为布达佩斯条约的储存物，且储存于FRI。

本发明所使用的产酮糖拟菌糖酸杆菌（Pseadogluconobactersaccharoketogenes）12-4，12-5，12-15，22-3，K591s和TH14-86也已于1986年9月6日保藏时中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其编号依次为CCTCC    86-125，86-122，86-124，86-126，86-121和86-123。

这些储存物在IFO和FRI的储存号如下：

微生物    IFO    FRI

产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s    14464    P-8481    BP-1130

产酮糖拟葡糖酸杆菌12-5    14465    P-8480    BP-1129

产酮糖拟葡糖酸杆菌TH    14466    P-8479    BP-1128

14-86

产酮糖拟葡糖酸杆菌12-15    14482    P-8577    BP-1132

产酮糖拟葡糖酸杆菌12-4    14483    P-8576    BP-1131

产酮糖拟葡糖酸杆菌22-3    14484    P-8578    BP-1133

在本发明的实践过程中，上面提到过的菌株可以在含有L-山梨糖的培养基中生长，或者，也可以将L-山梨糖与从该菌株细胞获得的制备物接触。

术语“从细胞获得的制备物”或“细胞制备物”在这里是指任何和各种从该细菌的培养液中洗涤得到的细胞，丙酮干燥细胞，固定在聚丙烯酰胺凝胶，K-角叉菜胶和其类似物一类支持物上的细胞，以及其它等效的制备物。

起始物L-山梨糖可以在培养开始时一次性加入，也可以在培养的过程中分几次加入或者是连续加入。

至于L-山梨糖和该微生物的接触反应中，L-山梨糖在反应系统中的浓度是3-30%（w/v）最好在5-25%（w/v）。

将L-山梨糖与该细菌细胞制备物接触的步骤的一个例子就是：将L-山梨糖，2-（N-吗啉代）乙基磺酸（MES）〔2-（N -movpholion）ethanevulfonic acid〕缓冲液〔pH6.5，0.5M）和CaCO3加到细胞制备物中，用水稀释，在锥形瓶中摇动混合物。

在L-山梨糖和该细胞制备物的有效接触反应系统中，L-山梨糖的浓度是0.1-10%（w/v），最好在0.3-3%（w/v）。细胞制备物的量是1-30毫克/毫升（指反应前的干细胞）。反应系统的pH值控制在大约5.5-7.5的范围内，反应温度大约在20-40℃，反应时间大约是1-100小时。

在实施本发明的在含有L-山梨糖的液体培养基中培养拟葡糖酸杆菌以产生和积累2-酮基-L-古洛糖酸的过程中，发现当其它细菌与拟葡糖酸杆菌氧化菌株混合存在时2-酮基-L-古洛糖酸的积累量明显高于氧化菌株单独培养时的积累量。

允许与拟葡糖酸杆菌相伴随的细菌可以是下列属：芽孢杆菌属，假单胞菌属，变形菌属，柠檬酸细菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，黄单胞菌属和黄杆菌属。下面提到的是一些特别的种。

蜡状芽孢杆菌    IFO    3131

地衣芽孢杆菌    IFO    12201

巨大芽孢杆菌（Bacillus    megaterium    IFO    12108）

短小芽孢杆菌（Bacillus    pumilus    IFO    12090）

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus    amyloliguefaciens

IFO    3022）

枯草芽孢杆菌（Bacillus    subtilis    IFO    13719）

环状芽孢杆菌（Bacillus    circulans    IFO    3967）

三叶草假单胞菌（Pseudomonas    trifolii

IFO    12056）

嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas    maltophilia

IFO    12692）

无恒变形菌（Proteus    inconstans    IFO    12930）

弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter    freundii

IFO    13544）

阴沟肠杆菌（Enterobacter    cloacae    IFO    3320）

草生欧文氏菌（Erwinia    herbicola    IFO    12686）

豌豆黄单胞菌（Xanthomonas    pisi    IFO    13556）

柑桔黄单胞菌（Xanthomonas    citri    IFO    3835）

脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacterium    menigosepticum

IFO    12535）

变易微球菌（Micrococcus    varians    IFO    3765）

大肠杆菌（Escherichia    coli    IFO    3366）

上述任何一种菌株均可在适宜的培养基中以20-40℃培养1-4天并将所得到的培养物作为在有该伴随菌存在时进行培养的接种物。接种量一般以该氧化菌株的1/10～1/1000为宜。当以这种量的伴随菌与氧化菌株共同培养时，则氧化菌的生长就得到促进并比单纯氧化菌的生长快，混合培养物能在较短的时间内将高浓度的L-山梨糖氧化为2-酮基-古洛糖酸。作为伴随菌的菌株要优选那些不能同化或很少同化L-山梨糖和2-酮基-古洛糖酸的菌株。另外，可以使用与纯氧化菌株相同的培养条件。用于培养上述微生物的培养基可以是液态或固态的含能被所述菌株利用之养分的培养基。然而，对于大量生产，宜优选液态培养基。该培养基中含有碳源，氮源，无机盐，有机酸盐以及培养微生物常用的微量养分。虽然起始物L-山梨糖是作为碳源，但还可以用其他的辅助碳源，如葡萄糖，甘 油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖密等。氮源举例有各种无机和有机的含氮化合物或含氮物质，如铵盐（例如硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，磷酸铵等），玉米浆，，肉膏，酵母膏，干酵母，豆粉，棉籽饼，尿素等等。作为无机盐，可以使用钾盐，钠盐，钙盐，镁盐，铁盐，锰盐，钴盐，锌盐，铜盐和/或磷酸盐。

作为微量养分，除了COA，泛酸，生物素，硫胺素和核黄素这些所述微生物的基本生长因素以外，还可以适量加入那些促进微生物生长并从而促进2-酮基-L-古洛糖酸生产的物质，如黄素单核苷酸（FMN），黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其他的维生素，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，硫代硫酸钠等等，无论是纯化合物的形式还是含有它们的天然物质均可。

培养方法可以使用任何静态培养，摇振培养，浸入培养等方法。对大量生产则优选所谓的浸入培养。

当然，培养条件依据菌株，培养基组分和其他因子而定，而且在每种情况下都可以选择条件以最高效率获取目标化合物。例如，培养温度可以优选25-35℃，培养基的pH可以为5-9。

在上述条件下培养10-120小时，2-酮基-L-古洛糖酸以最大浓度聚积。由于培养基的pH值一般均随着目标化合物的生长而降低，所以，最好不时地加入一些适宜的碱性物质，如氢氧化钠，氢氧化钾或氨，使培养基的pH保持在最适于菌株生成2-酮基-L-古洛糖酸的水平上，或者在培养基中含有适宜的缓冲剂从而维持培养基的pH不变。

除上所述，灭菌的细菌（不是氧化菌株）的培养液可以优选作为培养基成分。能以这种方式使用的细菌包括杆菌属（Bacillus），假单胞菌属（Pseudomonas），柠檬酸杆菌属（Citrobacter），埃希 氏菌属（Escherichia），欧文氏菌属（Erwinia）等。特别应提及的有如下的菌株。

蜡状芽孢杆菌    （Bacillus    cereus    IFO    3131）

枯草芽孢杆菌    （Bacillus    subtilis    IFO    3023）

短小芽孢杆菌（Bacillus    pumilus    IFO    12089）

巨大芽孢杆菌（Bacillus    megaterium

IFO    12108）

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus    amyloliquefaciens

IFO    3022）

三叶草假单胞菌（Pseudomonas    trifolii

IFO    12056）

弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter    freundii

IFO    12681）

大肠杆菌（Escherichia    coli    IFO    3456）

草生欧文氏菌（Erwinia    herbicola

IFO    12686）

这些细菌在培养基中以20-40℃培养2-4天，所得的培养液灭菌后以0.5-5.0%（v/v）的比例加到培养基中用于氧化菌株。通过这种方式可以提高氧化菌株的生长。

这样产生的和聚积在培养液中或反应混合物中的2-酮基-L-古洛糖酸可用各种已知的方法收获和提纯。2-酮基-L-古洛糖酸能以游离酸的形式收获，也能以例如钾，钠，钙或铵盐等等形式分离出来。

任何可达到本发明目的的收获方法都可使用。例如，如果需要，可用过滤，离心或用活性碳处理从培养液中去除细胞，并浓缩液体。 过滤收集沉淀的晶体，再经重结晶收获目标化合物。另外，溶剂萃取，层析，沉淀或盐析等其它方法均可以适当地结合（或）重复地使用。

当2-酮基-L-古洛糖酸以游离酸的形式获得时，可以用常规的方法将其转化为诸如钠，钾，钙，铵盐等盐类。当目标化合物以盐的形式收获时，可用已知的方法将其转化为不同的盐或游离酸。

用本发明方法所获化合物产物与2-酮基-L-古洛糖酸的同一性，业已通过确定理化常数，如元素分析，熔点，旋光度，红外吸收光谱等而得到证实。

在反应混合物中或培养液中存在的2-酮基-L-古洛糖酸的定量确定是用高效液相层析进行的（流动相：稀硫酸，pH2.2;流速：0.5毫升/分;检测器：差示折光仪），使用的层析柱为磺酸化聚苯乙烯凝胶柱（Shimadzu    Seisakusho，Ltd，Japan，SCR-101H柱，7.9mm×30cm），使用一水合2-酮基-L-古洛糖酸钠晶体作为标准。用薄层层析作为检测2-酮基-L-古洛糖酸的方法。即在纤维板（Merck    U.S.A）上点样，用酚∶水∶甲酸为75∶25∶5的溶剂系统在室温下展层3小时，干燥后用染色剂处理，2-酮基-L-古洛糖酸在Rf约为0.30处给出一点，该点用硝酸银染色为黑褐色，用邻苯二胺染色为黄色，用苯胺苯二甲酸染色为粉红色。

使用本发明的方法，使用属于拟葡糖酸杆菌属（Pseudogluconobacter）的并能使L-山梨糖氧化为2-酮基-L-古洛糖酸的微生物，可以大量地生产2-酮基-L-古洛糖酸。

以下的实施例是要详细地说明本发明。在涉及培养基时使用的%代表重量/体积的百分数。

实施例1

向200毫升的锥形瓶中装入20毫升含2.0%葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母和2.0%CaCO3并经120℃高温灭菌20分钟的种子培养基。用在表1的斜面培养基上以28℃生长4天的产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s（IFO 14464;FERM BP-1130）-铂环量接种于该瓶中，以每分钟200转于30℃摇振培养2天。将2毫升所获的培养汁转移到含有同上述一样的种子培养基的瓶中，并以相同的条件培养得到种子培养物。

在200毫升的锥形瓶中装入含有2.0%CSL，0.5%干酵母，0.5%硫酸铵，0.05%Na2S2O3·5H2O，0.2%硫酸亚铁，4.0%CaCO3，和10.0%L-山梨糖（单独灭菌发酵培养液并经120℃高压灭菌20分钟的发酵培养基。含有上述发酵培养基的锥形瓶用1.25毫升上述制备的种子培养物接种，并以30℃摇振培养3天。经高效液相层析分析，所获的发酵液中含有60.5mg/ml的2-酮基-L-古洛糖酸（转化率为56.1%）。该发酵液（1000毫升）经离心除去细胞和其他的沉淀。获得上清液980毫升，过Amberlite IR 120柱（Rohm Hass Co，U.S.A.H型，500毫升），然后用约300毫升去离子水洗柱。合并流出液和洗脱液，再过一个活性炭柱（500毫升），然后以约300毫升的去离子水洗，去除阳离子和色素。合并流出液和洗脱液（1600毫升），用氢氧化钠调pH至6.5，在50℃减压条件下浓缩至约70毫升。浓缩物在5℃静置24小时，就得到无色的晶柱。过滤收集晶柱，用少量的冷甲醇洗，在室温减压条件下用五氧化磷干燥之，得到 37.5克    水化2-酮基-L-古洛糖酸单钠。

熔点：147-155℃（分解）

元素分析：C6H9O7Na·H2O

理论值：C，30.78%，H，4.74%

实际值：C，30.94%，H，4.85%

旋光度：〔α〕24D-23.3°（C＝1.0，水）。

上述产物在HPLC中的滞留时间，在TLC中的Rf值，以及颜色等方面，均与标样的相同。

实施例2

将环生长于表1所示的斜面培养基的产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s接种于一含有5毫升表2所示的完全培养基的试管（16mm×160mm）中，于30℃振荡培养两天。将1毫升该培养物转移到含5毫升相同培养基的试管中，然后摇振培养4小时。所获的培养液（5毫升）在5℃以每分钟12000转无菌离心15分钟来收获细胞。将细胞悬浮于10毫升tris-马来酸缓冲液中（pH6.5;0.05M），然后离心。重复上述过程两次，将洗过的细胞悬浮于5毫升含有1mg/ml亚硝基胍的上述缓冲液，在30℃摇振2小时进行致突变处理。悬浮液在5℃以每分钟12000转离心15分钟收集细胞，然后用每份10毫升的tris-马来酸缓冲液洗两次以收复含被亚硝基胍处理过的细胞的那部分。将其用0.85%的盐水稀释至适宜的浓度，在直径为9厘米含有15毫升完全培养基（固体）的平板上涂布。接种了的平板培养基在28℃培养5天以长出菌落。计数菌落并与未处理的对照组比较。归因于亚硝基胍处理的死亡率为90.4%。在完全培养基板上的菌落叠印到表3的最小基本培养基平板上，经28℃培养3天后，检查营 养缺陷型（营养突变）的频率，该频率值约为6.6%。

将在完全培养基平板上经诱变剂处理过的菌落成条形涂布在新鲜的完全培养基平板上，长度约为2厘米，每板12个菌株。在28℃培养2天，将一铂环量的生长细胞转移到含有3毫升由7.0%L-山梨糖（单独灭菌），1.0%干酵母，1.0%胨，0.1%氯化亚铁和3.0%CaCO3组成的培养基（pH6.5）的试管中，并在30℃摇振培养4天。在受试的突变菌株中，发现在上述条件下，菌株TH14-86生产的2-酮基-L-古洛糖酸是其亲本菌株K591s的两倍。菌株TH14-86（IFO 14466;FERM BP-1128）被选作氧化菌株，并具有增大了的氧化L-山梨糖的能力。

表1    斜面培养基（g/l）

D-山梨醇    25

胨    10

酵母膏    10

CaCO32

琼脂    20

pH7.0

表2    完全培养基（g/l）

D-山梨醇    25

胨    10

酵母膏    10

pH6.5（如为固体培养基，需加20克琼脂）

表3    微量基本培养基（g/l）

蔗糖    5

K2HPO43

KH2PO41

（NH4）2SO41

NaCl    1

MgSO4·7H2O 0.1

MnCl2·nH2O 0.002

L-谷氨酸钠    0.1

L-半胱氨酸    0.1

CoA    0.002

FMN    0.002

硫胺素    0.002

生物素    0.001

pH7.0（如为固体培养基，需加20克琼脂）

实施例3

在实施例2中由产酮糖拟葡糖酸杆菌K591s衍生出来的突变菌株TH14-86于28℃在斜面培养基上生长4天。从斜面培养物中取一铂环量的细胞接种到含20毫升实施例1所述的种子培养基的200毫升的锥形瓶中，并在30℃摇振培养2天。

向容积为1升的锥形瓶中装入200毫升由3.0%葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母和2.0%CaCO3组成并经120℃高压灭菌20分钟的培养基。用20毫升上述培养物接种该锥形瓶，并在28℃摇振培养2天以得到种子培养物。另外，将一铂环量在斜面培养基上于28℃生长2天的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium IFO 12108）接种到含有20毫升由4.0%蔗糖，4.0%棉籽饼，0.65%K2HPO4，0.55%KH2PO4，0.05%硫酸铵，0.05%NaCl，0.05%硫酸镁和0.05%泛酸钙组成的培养基（pH7.0）以120℃高压灭菌20分钟的200毫升锥形瓶中，并在30℃培养3天。所获的培养液以120℃高压灭菌20分钟，低温储藏，并用作下述发酵培养基的组分。一个5升的发酵罐中装入3升酵母培养基，该培养基由12.5%L-山梨糖（以120℃单独灭菌15分钟），0.5%硫酸铵，0.03%KH2PO4，0.05%Na2S2O3·5H2O，0.05%硫酸镁，0.1%FeSO4·7H2O，5ug/ml MnSO4·4H2O，5ug/ml硫胺素，0.1ug/ml生物素，0.1ug/ml FMN，5.0%CaCO3和4.0%（v/v）上述灭菌过的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）培养液组成，并经120℃高压灭菌30分钟。以300毫升上述种子培养物接种该发酵培养基，并在32℃以2.4升/分的通气速率，每分钟800转的搅拌条件下培养3天。所获的发酵液中含有102.0mg/ml2-酮基-L-古洛糖酸（转化率为75.7%）。以实施例1的方式纯化1升该培养液得到73.2克水合2-酮基-L-古洛糖酸单钠晶体。

实施例4

按与实施例1相同的方式培养产酮糖拟葡糖酸杆菌（Pseudogluconobacter    saccharoketogenes    12-5，IFO    14465，FERM    BP-1129）得到种子培养物。将20毫升例3所述的发酵培养基（含9.0%的L-山梨糖）装入-200毫升锥形瓶中，于120℃高压灭菌20分钟。用1.5毫升上述种子培养物接种于锥瓶，且于32℃培养2天。其结果是发酵液含有73.2毫克/毫升的2-酮基-L-古洛糖酸（回收率：75.4%）。

实施例5

以与实施例4相同的方式分别摇振培养产酮糖拟葡糖酸杆菌（Pseudogluconobacter    saccharoketogenes）12-4（FERM    BP-1131，IFO    14483），12-15（FERM    BP-1132，IFO    11482）和22-3（FERM    BP-1133，IFO    14484）3天。培养液中的2-酮基-L-古洛糖酸的产量对菌株12-4为52.1mg/ml（转化率为53.7%），对菌株12-15 为48.7mg/ml（转化率为50.2%），对菌株22-3为69.3mg/ml（转化率为71.4%）。

实施例6

200毫升的锥形瓶中装入25毫升由1.0%L-山梨糖（单独消毒），0.5%胨和0.5%酵母膏组成的培养基（pH7.0）并经120℃高压灭菌15分钟。以一铂环量的已在表1斜面培养基上于28℃生长4天的产酮糖拟葡糖酸杆菌TH14-86菌株接种该瓶，在30℃摇振培养2天得到种子培养物。

在200毫升锥形瓶中装入25毫升由5.0%L-山梨糖（单独灭菌，），1.0%胨，0.5%酵母膏和2.0%CaCO3组成的培养基（pH7.0）。并经120℃高压消毒15分钟用1.0毫升上述种子培养物接种该瓶并在30℃培养2天。

所获的培养物（500毫升）在室温下放置20分钟，倾析除去沉淀物。余下的液体在室温下以每分钟1000转低速离心除去主要由CaCO3组成的沉淀。这样获得的细胞悬浮液在5℃以每分钟6000转进一步离心10分钟，收集到的细胞用每份约100毫升的冷盐水（0.85%）洗两次，再以每分钟6000转于5℃离心得到洗过的细胞。细胞再次悬浮于35毫升冷盐水（0.85%）中，得到洗过的细胞的悬浮液。向4毫升这种洗过的细胞悬浮液中加入300毫克L-山梨糖，0.5毫升2-（N-吗啉代）乙基磺酸（MES）缓冲液（pH6.5;0.5M）和180毫克CaCO3，然后用水稀释至10毫升。该混合物在100毫升锥形瓶中于30℃摇振反应24小时。发现这种方式获得的反应混合物中含有24.6mg/ml的2-酮基-L-古洛糖酸（转化率为76.0%）。

实施例7

产酮糖葡糖酸杆菌K591s，12-5和TH14-86菌株分别在斜面培养基上于28℃生长4天。另外，表4中的伴随细菌在相同的斜面培养基上于28℃生长2天。将每种菌株各一铂环量接种到含有20毫升如实施例1的种子培养物的200毫升锥形瓶中，并在30℃以每分钟200转摇振培养2天。以这种方式收获到各菌株的培养液。

200毫升的锥形瓶中装入25毫升由2.0%CSL，0.3%干酵母，0.5%硫酸铵，0.05%Na2S2O3·5H2O，0.2%硫酸亚铁，5.0%CaCO3和15.0%L-山梨糖（单独消毒）组成并经120℃高温灭菌20分钟。含有上述培养基的锥形瓶以1.5毫升上述的一种产酮糖拟葡糖酸杆菌（氧化型）菌株接种，并且在30℃摇振培养5天得到纯培养物。

在混合培养的情况下，是用0.1毫升所述伴随细菌在接种氧化菌株的同时进行接种，接种后的培养基在30℃摇振培养5天。

用高效液相层析分析每种培养液中所产生的2-酮基-L-古洛糖酸。所得结果见表4。伴随细菌存在导致2-酮基-L-古洛糖酸的产量增加。

表4在有或没有伴随细菌存在的条件下培养产酮糖拟葡糖酸杆菌来生产2-酮基-古洛糖酸

产酮糖拟葡糖酸杆菌

伴随细菌

K591s    12-5    TH14-86

（mg/ml）    （mg/ml）    （mg/ml）

没加    55.3    74.1    87.6

（34.2%）    （45.8%）    （54.1%）

蜡状芽孢杆菌（Bacill-    87.3    101.5    125.9

us    cereus）IFO    （54.0%）    （62.7%）    （77.8%）

3131

地衣芽孢杆菌（Bacill-    -    -    125.0

us    licheniformis）    （77.3%）

IFO    12201

巨大芽孢杆菌（Bacill-    69.3    90.2    135.4

us    megaterium）    （42.8%）    （55.8%）    （83.7%）

IFO    12108

短小芽孢杆菌（Bacill-    93.1    129.0    134.7

us    pumilus）    （57.5%）    （79.8%）    （83.3%）

IFO    12090

解淀粉芽孢杆菌（Bacil-    126.9

lus    amyloliquefac-    -    -    （78.5%）

iens）IFO    3022

枯草芽孢杆菌（Bacill-    81.7    94.4    135.3

us    sabtilis）    （50.5%）    （58.4%）    （83.7%）

IFO    13719

三叶草假单胞菌    67.2    98.8    122.6

（Pseudomonas    trif-    （41.5%）    （61.1%）    （75.8%）

olii）IFO    12056

嗜麦芽假单胞菌    71.9    79.8    135.3

（Pseadornonas    mal-    （44.4%）    （49.3%）    （83.7%）

topbilia）

IFO    12692

天恒变形菌（Proteus    124.5

inconstans）    -    -    （77.0%）

IFO    12930

弗氏柠檬酸杆菌    132.3

（Citrobacter    -    -    （81.8%）

freundii）IFO

13544

阴沟肠杆菌（Enteroba-    132.0

cter    cloacae）    -    -    （81.6%）

IFO    3320

草生欧文氏菌（Erwinia    71.8    111.6    129.1

herbicola）    （44.4%）    （69.0%）    （79.8%）

IFO    12686

豌豆黄单孢菌（Xanth-    121.5

omonas    pisi）    -    -    （75.1%）

IFO    13556

脑膜脓毒性黄杆菌    122.8

（Flavobacter    （75.9%）

meningosepticum）    -    -

IFO    12535

（括号中的数字表示转化率）

实施例8

在2升的Sakaguchi烧瓶中装入500毫升由2.0%葡萄糖，1.0%胨，1.0%干酵母，2.0%CaCO3和0.01%Actcol（消沫剂，Takeda chemical Industries Ltd）组成的预培养基并经120℃高压灭菌20分钟。

将在表1斜面培养基上生长的TH14-86细胞悬浮于10毫升无菌水中，并全部接种到Sakaguchi烧瓶中，用往复摇振器于28℃以每分钟85次培养3天得到预培养物。在200升的发酵罐中装入120升（pH6.5）的由3.0%葡萄糖，1.0%CSL，0.5%干酵母，0.05%硫代硫酸钠，0.1%硫酸亚铁，2.0%碳酸钙和0.03%Actcol组成的种子培养并经125℃高压灭菌30分钟。向该发酵罐中转移1.8升上述预培养物，随后以每分钟搅拌120转，每分钟通气100升，压力为1.0kg/cm2G和30℃的条件培养3天得到种子培养物。

另一方面，将一铂环量在表1斜面培养基上于28℃生长2天的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）IFO12108接种到含有500毫升预培养基的Sakaguchi烧瓶中，并在往复摇振器（85 s.p.m）以28℃培养2天得到预培养物。在50升的发酵罐中装入与上述相同的预培养基并以120℃消毒20分钟。用500毫升伴随菌的预培养物接种该发酵罐，在每分钟搅拌120转，每分钟通气30升，压力为1.0kg/cm2G，温度为30℃的条件下培养2天，得到伴随菌的种子培养物。

向一个2立方米的发酵罐中装入1000升由15.0%L-山梨糖（单独灭菌），5.0%碳酸钙，2.0%CSL，0.2%干酵母，0.3%硫酸铵，0.05%硫代硫酸钠，0.1%硫酸亚 铁和0.03%Actcol组成的并经125℃消毒15分钟发酵培养基。向该发酵罐中转入110升上述产酮糖拟葡糖酸杆菌TH14-86的种子培养物和10升伴随菌巨大芽孢杆菌IFO12108的种子培养物，以每分钟搅拌110转，每分钟通气900升，压力为0.5kg/cm2和30℃温度的条件进行培养。接种4天后的培养液中含有123.1mg/ml的2-酮基-L-古洛糖酸（转化率为76.1%）。

实施例9

200毫升的锥形瓶中装入20毫升实施例8中的预培养基，并以120℃高压灭菌30分钟。将一铂环量的在表1斜面培养基上于28℃生长4天的产酮糖拟葡糖酸杆菌TH14-86接种到上述烧瓶中，并在30℃摇振培养2天。将20毫升所获的培养物转移到含有200毫升相同培养基的1升锥形瓶中，并在30℃摇振培养2天以得到TH14-86种子培养物。

-铂环量的在斜面培养基上于28℃生长2天的巨大芽孢杆菌IFO    12108接种到含20毫升预培养基的200毫升烧瓶中，在28℃摇振培养2天得到伴随细菌的种子培养物。由3.0%L-山梨糖（单独消毒），2.0%CSL，0.2%干酵母，0.3%硫酸铵，0.05%硫代硫酸钠，0.1%硫酸亚铁，0.02%Actcol和9.0%碳酸钙组成的发酵培养基（3升）中取出2.1升并在120℃高压灭菌30分钟。将灭菌后的培养基装入5升的发酵罐中。

用300毫升上述TH14-86菌株的种子培养物和4毫升伴随细菌的种子培养物接种该发酵罐，以每分钟通气2.4升，每分钟搅拌800转，温度30℃的条件进行培养。

另外，用510克L-山梨糖溶于水中制备800毫升的山梨糖溶液，以120℃高压灭菌20分钟。从培养的第6至第42小时连续地将这种灭菌过的溶液加到发酵罐中。加入L-山梨糖后，以相同的条件再培养28小时（共70小时）。所获的培养液含有163.5mg/ml的2-酮基-L-古洛糖酸（转化率为75.8%）。